本發(fā)明涉及診斷標(biāo)志物，具體地說(shuō)，涉及Myoferlin在檢測(cè)鼻咽癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和死亡率均居世界首位，嚴(yán)重影響國(guó)人生命健康安全。鼻咽癌幾乎均為低分化鱗癌和未分化癌，惡性程度高，易早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。早期轉(zhuǎn)移是鼻咽癌最重要的特征之一，鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已成為制約其療效和預(yù)后的瓶頸，也是導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡的主要原因。在鼻咽癌復(fù)雜的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞表面蛋白參與其中并發(fā)揮極其關(guān)鍵調(diào)控作用。因此從細(xì)胞表面蛋白入手尋找鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，篩選鼻咽癌早期診斷標(biāo)志物對(duì)于提高療效、改善預(yù)后具有重要意義。

鼻咽癌起病部位隱匿，早期癥狀不明顯，絕大多數(shù)患者首次就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。放療是目前治療鼻咽癌的主要手段。早期鼻咽癌放療后5年生存率可達(dá)80％，而由于放療抵抗和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，鼻咽癌常規(guī)放療后5年生存率仍然徘徊在40％-50％。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)提高鼻咽癌療效進(jìn)行了多方努力，但總的效果仍不夠理想。因此，鼻咽癌早期診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)對(duì)于鼻咽癌防治具有重要作用。

人Myoferlin基因(Gene ID：26509)位于染色體10q23.33區(qū)域，全長(zhǎng)176076bp，包含59個(gè)外顯子。人Myoferlin蛋白(UniProt ID：Q9NZM1)由2061個(gè)氨基酸組成，分子量234709Da。Myoferlin是一種鈣/磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)，屬于ferlin膜蛋白家族成員在細(xì)胞膜融合、損傷后修復(fù)、內(nèi)吞及酪氨酸激酶受體活性等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Myoferlin蛋白高表達(dá)于成肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，參與骨骼肌發(fā)育、修復(fù)以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等功能，但其在鼻咽癌中的表達(dá)和功能未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種鼻咽癌相關(guān)標(biāo)志物，并提供了該標(biāo)志物及其特異性抗體在制備檢測(cè)鼻咽癌試劑盒中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種鼻咽癌相關(guān)標(biāo)志物Myoferlin，基因名為人Myoferlin基因(Gene ID:26509)位于染色體10q23.33區(qū)域，全長(zhǎng)176076bp，包含59個(gè)外顯子。人Myoferlin蛋白(UniProt ID:Q9NZM1)由2061個(gè)氨基酸組成，分子量234709Da。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了Myoferlin或其特異性抗體在制備檢測(cè)鼻咽癌的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

所述試劑盒可為免疫組化試劑盒或酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

進(jìn)一步地，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了Myoferlin蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，因此，所述試劑盒可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有鼻咽癌轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌的檢測(cè)。

第二方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)Myoferlin的試劑或試劑盒在制備檢測(cè)鼻咽癌的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述檢測(cè)Myoferlin的試劑或試劑盒優(yōu)選為可定量檢測(cè)Myoferlin蛋白的試劑或試劑盒，或優(yōu)選為檢測(cè)Myoferlin蛋白表達(dá)水平或表達(dá)量的試劑或試劑盒。通過(guò)分析Myoferlin蛋白的表達(dá)量判斷樣本是否患有鼻咽癌，并進(jìn)一步判斷是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了鼻咽癌診斷與預(yù)后的生物標(biāo)志物Myoferlin，根據(jù)Myoferlin的表達(dá)水平判斷待測(cè)樣本是否患有鼻咽癌，并進(jìn)一步判斷是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有利于鼻咽癌的早發(fā)現(xiàn)和早治療。

本發(fā)明為有效判斷人鼻咽疾病進(jìn)程提供了新的科學(xué)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞表面蛋白實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

圖2為經(jīng)7次質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，在5-8F高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)倍率最大的前10個(gè)蛋白質(zhì)。

圖3為Western blot檢測(cè)Myoferlin在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)。

圖4為免疫組化檢測(cè)Myoferlin在正常鼻咽粘膜和鼻咽癌組織中的表達(dá)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

1、為篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，申請(qǐng)人以高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系5-8F與無(wú)轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系6-10B為研究對(duì)象，采用體內(nèi)穩(wěn)定同位素聯(lián)合生物素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，篩選發(fā)現(xiàn)Myoferlin蛋白在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系5-8F中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示Myoferlin表達(dá)上調(diào)可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。具體實(shí)驗(yàn)方案如下：

1)體內(nèi)穩(wěn)定同位素標(biāo)記不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系：將穩(wěn)定同位素重鏈(K⁸R¹⁰-‘heavy’)，即L-lysine-(¹³C₆¹⁵N₂)(K⁸)(Thermo公司，88209)和L-arginine-(¹³C₆¹⁵N₄)(R¹⁰)(Thermo公司，89990)以及穩(wěn)定同位素輕鏈(K⁰R⁰-‘light’)，即L-lysine-(¹²C₆¹⁴N₂)(K⁰)(Thermo公司，89987)和L-arginine(¹²C₆¹⁴N₄)(R⁰)(Thermo公司，89989)，分別加入高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系5-8F與無(wú)轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系6-10B的含10％透析型血清(Thermo公司，89986)的條件培養(yǎng)基中(Thermo公司，89984)進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記，細(xì)胞經(jīng)過(guò)6-8次傳代培養(yǎng)后可標(biāo)記完全。

2)生物素-親和素系統(tǒng)(Thermo公司，89881)富集細(xì)胞表面蛋白質(zhì)：穩(wěn)定同位素標(biāo)記好的鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入生物素分子標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，接下來(lái)利用生物素與親和素的特異性結(jié)合作用，將鼻咽癌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)純化富集起來(lái)。

3)液相色譜分離結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)：富集的蛋白樣品經(jīng)2D Quant Kit蛋白定量試劑盒(GE Healthcare公司，80-6483-56)精確定量后進(jìn)行等量混合，接下來(lái)進(jìn)行SDS-PAGE膠分離及胰酶酶解，得到的肽段首先經(jīng)第一維強(qiáng)陽(yáng)離子交換液相色譜分離，然后再經(jīng)第二維反相液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行質(zhì)譜分析，軟件采集各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)查詢以鑒定蛋白質(zhì)。

4)生物信息學(xué)分析：采用生物信息學(xué)軟件首先對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)相關(guān)性和實(shí)驗(yàn)變異度分析以確定差異蛋白的篩選倍數(shù)，接下來(lái)對(duì)篩選得到的鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的GO富集度分析、信號(hào)通路分析以及聚類分析，初步探明這些細(xì)胞表面差異蛋白在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的整體變化規(guī)律和作用。

由圖1所示，A為蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞表面蛋白實(shí)驗(yàn)流程圖。B為質(zhì)譜鑒定結(jié)果的實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析，7次質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)(包括3次生物學(xué)重復(fù)，2-3實(shí)驗(yàn)重復(fù)/每次生物學(xué)重復(fù))相關(guān)性比率R²：0.915-0.968，提示實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。C為通過(guò)生物信息學(xué)分析、篩選得到387個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

經(jīng)7次質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，在5-8F高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)倍率最大的前10個(gè)蛋白質(zhì)(如圖2所示)。

2、經(jīng)過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選，共得到387個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中Myoferlin是變化倍率最大的蛋白(在高轉(zhuǎn)移5-8F鼻咽癌細(xì)胞系中上調(diào)22.7倍)。

3、對(duì)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞表面蛋白Myoferlin進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)驗(yàn)證。

1)蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證：采用Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)Myoferlin分別在鼻咽癌細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞表面蛋白的差異。

操作流程如下：

a，蛋白質(zhì)抽提：收集培養(yǎng)好的鼻咽癌細(xì)胞(5-8F、6-10B)分別分成兩份，一份加入RIPA裂解液(碧云天)冰上裂解1小時(shí)，間或超聲，12000rpm離心30分鐘后取上清即為鼻咽癌細(xì)胞總蛋白；另一份采用方案2中生物素-親和素方法富集鼻咽癌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。2D Quant Kit蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

b，SDS-PAGE膠電泳：取20μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，95℃煮沸5分鐘后迅速置于冰上冷卻10分鐘，1000g短暫離心后上樣于8％的SDS-PAGE膠上，60V電泳30分鐘，待蛋白從積層膠跑入分離膠后，將電壓設(shè)置為100V進(jìn)行電泳分離，待溴酚藍(lán)指示帶跑到距離分離膠底部1厘米左右時(shí)停止電泳。

c，轉(zhuǎn)膜：用于轉(zhuǎn)印的PVDF膜先用無(wú)水甲醇浸泡10分鐘，再轉(zhuǎn)移到純水中浸泡5分鐘，然后與濾紙、凝膠一起置于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡10分鐘后制成三明治。設(shè)定100V恒壓轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。

d，抗體孵育：PVDF膜用5％脫脂奶粉于室溫下封閉1小時(shí)后根據(jù)蛋白分子量剪開(kāi)，分別與Myoferlin特異性抗體(abcam公司，ab76746)和β-actin內(nèi)參抗體(sigma，A5441)置于4℃冰箱孵育過(guò)夜，次日再分別與HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(KPL,04-18-06)室溫下孵育1小時(shí)。

e，采用ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像儀采集圖像。

圖3顯示W(wǎng)estern blot檢測(cè)Myoferlin在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示Myoferlin在5-8F細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞表面蛋白中表達(dá)均高于鼻咽癌細(xì)胞系6-10B。

2)免疫組織化學(xué)分析Myoferlin在鼻咽癌組織中表達(dá)的臨床意義：以Myoferlin特異性抗體(abcam公司，ab76746)聯(lián)合邁新S-P免疫組織化學(xué)試劑盒(福建邁新公司)組成診斷試劑盒。

簡(jiǎn)要操作步驟如下：

a，烤片：石蠟組織切片放置于切片架上，60℃烤箱進(jìn)行1小時(shí)烤片。

b，脫蠟：烤過(guò)的切片依次放入100％二甲苯(I,II)中脫蠟2次，每次20分鐘。

c，水化：脫蠟后的切片依次用梯度酒精(100％、95％、75％、50％)水化5分鐘，然后PBS液水洗3次，每次5分鐘。

d，抗原修復(fù)：專用切片盒中加入適量枸櫞酸鹽緩沖液加熱至沸騰后，將切片置于切片架上放入切片盒中，95℃煮沸維持15分鐘，待其自然冷卻至室溫后(約1小時(shí))，PBS液水洗3次，每次5分鐘。

e，用濾紙輕輕將組織周邊的液體吸干，每片組織上加過(guò)氧化物酶阻斷劑(試劑A)一滴，室溫孵育10分鐘。然后PBS液沖洗3次，每次5分鐘。

f，封閉：用濾紙吸去PBS液，每片組織上加正常動(dòng)物血清(試劑B)一滴，室溫孵育10分鐘。

g，輕輕除去血清，每片組織上分別加入預(yù)冷的PBS液稀釋好的一抗Myoferlin(1:200，abcam公司，ab76746)置入濕盒，4℃冰箱孵育過(guò)夜。

h，第二天將濕盒從冰箱取出放置常溫下，繼續(xù)孵育30分鐘，然后PBS液沖洗3次，每次5分鐘。

i，用濾紙吸去PBS液，每片組織上加生物素標(biāo)記的二抗(試劑C)一滴，室溫孵育10分鐘。PBS液沖洗3次，每次5分鐘。

j，用濾紙吸去PBS液，，每片組織上加鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液(試劑D)一滴，室溫孵育10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘。

k，用濾紙吸去PBS液，根據(jù)每片組織片大小加適量新鮮配置好的DAB溶液，用顯微鏡仔細(xì)觀察3-10分鐘，掌握好適宜的染色程度。

l，用雙蒸水沖洗3次，每次1分鐘，每片組織上加一滴成熟蘇木素復(fù)染10分鐘，1％鹽酸酒精分色3秒，流水返藍(lán)15分鐘。

m，梯度酒精(50％、75％、95％、100％)依次脫水，二甲苯透明5分鐘，通風(fēng)柜內(nèi)風(fēng)干30分鐘，60℃烤片10分鐘，中性樹(shù)膠封片保存。

n，免疫組織化學(xué)染色采用雙盲法，以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例綜合計(jì)分，即積分法計(jì)算結(jié)果。每張切片隨機(jī)選取某類細(xì)胞至少10個(gè)視野(×200)，至少1000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度根據(jù)染色深淺與背景著色對(duì)比，以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性計(jì)分：無(wú)著色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色為計(jì)2分，棕褐色計(jì)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例：無(wú)著色為0分；＜30％計(jì)為1分；30％-60％計(jì)為2分；≥60％計(jì)為3分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例兩者相加計(jì)量：0-2分計(jì)為弱陽(yáng)性(+)；3-4分計(jì)為陽(yáng)性(++)；5-6分計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。染色結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Myoferlin蛋白在正常鼻咽粘膜組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)如表1所示：

表1.Myoferlin蛋白在正常鼻咽粘膜組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)

Myoferlin蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系如表2所示：

表2.Myoferlin蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

圖4顯示，Myoferlin在有轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中的表達(dá)較無(wú)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織高，且兩者均明顯高于正常鼻咽粘膜組織。A，正常鼻咽粘膜組織，B，無(wú)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織，C，有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。