本發(fā)明屬于快速分析檢測(cè)，具體地，涉及基于鏈量放大增強(qiáng)熒光的高通量金黃色葡萄球菌腸毒素微流控芯片及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、毒素對(duì)人類健康和食品安全構(gòu)成巨大威脅，目前，已開(kāi)發(fā)了許多分析方法來(lái)檢測(cè)食品和環(huán)境中的毒素，常用的檢測(cè)毒素的方法可分為五大類：第一類是分子生物學(xué)方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，pcr)、實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-timequantitative?polymerase?chain?reaction，rt-pcr/qpcr)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated?isothermal?amplification，lamp)；第二類是免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，熒光免疫法(immunofluorescenceassay，ifa)和化學(xué)發(fā)光免疫法(chemiluminescenceimmunoassays，clia)；第三類是定量檢測(cè)方法，如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法(liquidchromatography/massspectrometry，lc-ms/ms)等；第四類是電化學(xué)和比色熒光傳感器法(biosensor)。

2、傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)目標(biāo)單一，例如，表面等離子體共振和表面增強(qiáng)拉曼光譜需要特殊設(shè)備并涉及復(fù)雜的程序；熒光和化學(xué)發(fā)光技術(shù)需要預(yù)處理，耗時(shí)長(zhǎng)；lc-ms/ms方法通常具有良好的靈敏度和高特異性，但該檢測(cè)的設(shè)備價(jià)格昂貴且不便于攜帶；抗體作為識(shí)別分子的免疫方法往往因其價(jià)格高、穩(wěn)定性差而受到限制。所以亟待建立一種更高準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性、通量性且能可靠和快速的從生物流體中以微量濃度檢測(cè)毒素的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于鏈量放大增強(qiáng)熒光的高通量金黃色葡萄球菌腸毒素微流控芯片及檢測(cè)方法，本發(fā)明通過(guò)將熒光傳感器與微流控芯片結(jié)合，既能放大信號(hào)，也能夠高通量檢測(cè)樣品，從而提高了毒素檢測(cè)方法的靈敏度和速度。本發(fā)明建立的方法具有裸眼可視化、檢出限低、線性范圍廣、檢測(cè)目標(biāo)物多、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用前景廣泛等優(yōu)點(diǎn)，并且能夠滿足對(duì)毒素高通量和高靈敏快速檢測(cè)的需求。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面提供一種基于鏈量放大增強(qiáng)熒光的高通量金黃色葡萄球菌腸毒素微流控芯片(簡(jiǎn)稱熒光微流控芯片)，所述微流控芯片中設(shè)置有熒光傳感器，所述熒光傳感器包括識(shí)別探針和信號(hào)探針；

3、所述識(shí)別探針由磁性納米顆粒、待測(cè)靶標(biāo)的核酸適配體h1和靶標(biāo)適配體互補(bǔ)鏈h2組成，其中，核酸適配體h1與磁性納米顆粒連接，h2的一部分與h1互補(bǔ)；

4、所述信號(hào)探針由具有信號(hào)放大功能的納米材料與三條寡核苷酸h3、h4、h5組成，其中，h3與具有信號(hào)放大功能的納米材料連接，h4的一部分與至少部分h3互補(bǔ)，另一部分與部分h2互補(bǔ)，h5與至少部分h3互補(bǔ)且其5’端修飾有熒光基團(tuán)。

5、在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“熒光傳感器”是將特定的分子識(shí)別事件轉(zhuǎn)換成可檢測(cè)的熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)可視化的信號(hào)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物靈敏檢測(cè)的裝置。熒光傳感器包含生物分子識(shí)別元件和熒光信號(hào)發(fā)生器。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“核酸適配體”是特異性識(shí)別靶標(biāo)的單鏈寡核苷酸。

6、在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“微流控”是操縱或處理微升乃至納升的微小體積的流體的一門科學(xué)技術(shù)。借助微流控芯片，可以節(jié)省反應(yīng)試劑，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，有利于減小設(shè)備體積與尺寸，降低檢測(cè)成本。

7、在一些實(shí)施方案中，h1的核苷酸的數(shù)量為20～100個(gè)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h1的序列如seq?id?no:1-3中至少一項(xiàng)所示。當(dāng)檢測(cè)單一靶標(biāo)時(shí)，可采用一條針對(duì)該靶標(biāo)的h1序列，當(dāng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)時(shí)，可采用多條針對(duì)各自靶標(biāo)的h1序列。

8、在一些實(shí)施方案中，h1具有可連接磁性納米顆粒的修飾基團(tuán)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h1修飾有生物素。

9、根據(jù)本發(fā)明，h2中的一部分與h1互補(bǔ)，因此h2的核苷酸數(shù)量多于h1的核苷酸數(shù)量，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述h2與h1互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)量為10～50個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，h2與h4互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)量為4～15個(gè)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述h2的序列如seq?idno:4-6中至少一項(xiàng)所示。同樣地，h2的類型數(shù)量取決于檢測(cè)靶標(biāo)的數(shù)量。

10、在一個(gè)實(shí)施方案中，h3為由相同堿基組成的序列，如完全由a組成的序列、由t組成的序列、由c組成的序列、由g組成的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，h3為完全由a組成的序列。

11、h3的核苷酸的數(shù)量不限，只要能實(shí)現(xiàn)本技術(shù)的檢測(cè)功能即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述h3的核苷酸的數(shù)量為5～20個(gè)，優(yōu)選為5～15個(gè)，更優(yōu)選為8～12個(gè)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h3的序列如seq?id?no:7所示。

12、在一個(gè)實(shí)施方案中，h3具有可連接具有信號(hào)放大功能的納米材料的修飾基團(tuán)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h3的3'端修飾有巰基。

13、在一個(gè)實(shí)施方案中，h4選自與h3互補(bǔ)的核苷酸組成的序列，h4的一部分與h3完全互補(bǔ)。其中，h4的核苷酸的數(shù)量比h3的核苷酸數(shù)量至少多4個(gè)，在一個(gè)實(shí)施方案中，至少多5個(gè)，在一個(gè)實(shí)施方案中至少多10個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選多10～15個(gè)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h4的序列如seq?id?no:8所示。

14、在一些實(shí)施方案中，h5具有與h3完全互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述h5的序列如seq?id?no:9所示。

15、在一個(gè)實(shí)施方案中，h5上修飾的熒光基團(tuán)可選自6-fam、6-hex、6-tet、6-rox、6-tamra、6-joe、cy3或cy5。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h5的5'端修飾有6-fam。

16、本發(fā)明的熒光傳感器需要控制部分序列的比例，優(yōu)選地，h1與h2的摩爾比例為1:5～1:200。h4與h5的摩爾比例為1:1～1:10000，優(yōu)選為1:80～120，最優(yōu)選為1:100。

17、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述識(shí)別探針和信號(hào)探針的摩爾比例為1:0.5～1:2。

18、在本發(fā)明中，“磁性納米顆?！睘轫槾判约{米顆粒。其中，磁性納米顆粒包括但不限于由磁性元素鐵、鎳、鈷、鉻、錳、釓及其化合物組成的納米材料。在一些實(shí)施方案中，磁性納米顆粒為由鐵及其化合物組成的納米材料。在一些實(shí)施方案中磁性納米顆粒為fe3o4、γ-fe3o4、feco。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，磁性納米顆粒為fe3o4。

19、在一個(gè)實(shí)施方案中，磁性納米顆粒具有可連接h1的修飾基團(tuán)。磁性納米顆粒表面修飾常用的材料可分為有機(jī)分子和無(wú)機(jī)材料。其中有機(jī)分子的修飾又可以分為偶聯(lián)劑修飾和表面活性劑修飾。通常偶聯(lián)劑修飾的目的是在納米顆粒的表面引入便于功能化的反應(yīng)基團(tuán)，如-nh2、-cooh、-sh和鏈霉親和素等，以便后續(xù)鏈接生物分子。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，磁性納米顆粒表面修飾有鏈霉親和素，可與生物素修飾的dna序列連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，h1具有可連接磁性納米顆粒的修飾。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h1修飾有生物素，可與修飾有鏈霉親和素的磁性納米顆粒相連。

20、在本發(fā)明中，具有信號(hào)放大功能的納米材料包括但不限于金屬納米材料、量子點(diǎn)和碳納米材料。金屬納米材料可包括金納米材料和/或銀納米材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述金屬納米材料為金納米材料。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述金屬納米材料為金納米顆粒。金與疏基有很強(qiáng)的化學(xué)鍵結(jié)合，因此，金的修飾有利于在納米顆粒表面在一個(gè)實(shí)施方案中修飾生物分子。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，h3的3'端修飾有巰基，可與金納米材料連接。

21、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的熒光傳感器的制備方法法包括：將具有信號(hào)放大功能的納米材料和dna序列h3、h4、h5的復(fù)合物與磁性納米顆粒和核酸適配體h1、適配體互補(bǔ)鏈h2的復(fù)合物混合孵育。

22、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述h1、h2、h3、h4、h5的用量各自獨(dú)立地為10～100μl，濃度各自獨(dú)立地為0.1～100μmol/l。

23、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光傳感器的制備方法包括向孵育完成后的mnps-h1-h2溶液中加入aunps-h3-h4-h5復(fù)合物溶液孵育一段時(shí)間，形成mnps-h1-h2-h3-h4-h5-aunps復(fù)合物(簡(jiǎn)稱為mnps-ssdna-aunps)。

24、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述mnps-h1-h2與aunps-h3-h4-h5復(fù)合溶液的孵育時(shí)間為5～25min。在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方案中，所述mnps-h1-h2與aunps-h3-h4-h5復(fù)合溶液的孵育時(shí)間為18～22min，最優(yōu)選為20min。

25、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有信號(hào)放大功能的納米材料為金納米顆粒aunps，其制備方法包括以下步驟：

26、(1)將haucl4和去離子水混合，加熱攪拌；

27、(2)待溶液回流時(shí)，加入檸檬酸鈉得到aunps溶液。

28、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有信號(hào)放大功能的納米材料和dna序列h3、h4、h5的復(fù)合物的制備方法包括以下步驟：

29、(1)將aunps溶液和巰基修飾的h3混勻后冷凍孵育得到aunps-h3；

30、(2)將h4和熒光基團(tuán)修飾的h5混合后與aunps-h3溶液混勻得到aunps-h3-h4-h5。

31、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述h4與h5的比例為1:1～1:10000。在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方案中，所述h4與h5的比例為1:100。

32、在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述aunps為平均粒徑8～14nm的金納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述aunps為晶格條紋寬度0.235nm的金納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述的巰基修飾的dna序列h3的用量為100μmol/l、10～20μl。

33、在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述的冷凍孵育的條件為-20℃～-80℃、1～2h。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中所述的dna序列h4的用量為1μmol/l、10～20μl。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中所述的fam熒光基團(tuán)修飾的dna序列h5的濃度為1～10000μmol/l。

34、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述磁性納米顆粒和核酸適配體h1、適配體互補(bǔ)鏈h2的復(fù)合物的制備方法包括以下步驟：

35、(1)混合表面修飾鏈霉親和素的磁性納米顆粒重懸液和生物素標(biāo)記的核酸適配體h1的溶液，得到適配體功能化的磁性納米顆粒mnps-h1；

36、(2)混合步驟(1)得到的mnps-h1重懸液和靶標(biāo)適配體互補(bǔ)鏈h2，得到mnps-h1-h2復(fù)合物。

37、在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述的表面修飾鏈霉親和素的磁性納米顆粒為平均粒徑200～480nm的磁性納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述的表面修飾鏈霉親和素的磁性納米顆粒的用量為100μl，10mg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述生物素標(biāo)記的適配體序列h1為用buffer?i溶解，buffer?i是包含10mmol/l?tris-hcl，1mol/lnacl，1mmol/l?edta，0.1％?tween-20的緩沖液。

38、在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)中所述的生物素標(biāo)記的適配體序列h1的濃度為0.1～4μmol/l。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中所述mnps-h1的用量為100μl，濃度為0.2～1.4mg/ml。

39、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微流控芯片設(shè)置有進(jìn)樣區(qū)、液道區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)；所述進(jìn)樣區(qū)通過(guò)所述液道區(qū)與所述反應(yīng)區(qū)連通，所述檢測(cè)區(qū)與所述反應(yīng)區(qū)數(shù)量相同且對(duì)應(yīng)設(shè)置；所述進(jìn)樣區(qū)內(nèi)設(shè)置有所述熒光傳感器的信號(hào)探針；所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)設(shè)置有所述熒光傳感器的識(shí)別探針。

40、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述進(jìn)樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)、檢測(cè)區(qū)均為多個(gè)且為圓孔型，每個(gè)進(jìn)樣區(qū)通過(guò)多個(gè)液道區(qū)分別連通多個(gè)反應(yīng)區(qū)。

41、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述進(jìn)樣區(qū)的數(shù)量為兩個(gè)且靠近芯片中心對(duì)稱設(shè)置；多個(gè)所述液道區(qū)均等長(zhǎng)且呈放射狀分布，每個(gè)液道區(qū)一端連通進(jìn)樣區(qū)、另一端連通反應(yīng)區(qū)；每個(gè)檢測(cè)區(qū)設(shè)置在相對(duì)應(yīng)反應(yīng)區(qū)的外側(cè)。設(shè)置兩組對(duì)稱的進(jìn)樣區(qū)-液道區(qū)-反應(yīng)區(qū)-檢測(cè)區(qū)可實(shí)現(xiàn)對(duì)照組、以及多組靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。

42、在一個(gè)實(shí)施方案中，更優(yōu)選地，所述進(jìn)樣區(qū)的直徑為1～3mm，深度為7～9mm，兩個(gè)進(jìn)樣區(qū)之間的距離為8～9mm，反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)的圓孔直徑各自獨(dú)立地為5～10mm，深度為7～9mm，反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)的間距為3～5mm。

43、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微流控芯片由硅片制備的芯片制成。

44、本發(fā)明第二方面提供了一種基于鏈量放大增強(qiáng)熒光的高通量金黃色葡萄球菌腸毒素微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：

45、(1)采用光刻法制備微流控芯片；

46、(2)將所述熒光傳感器的識(shí)別探針添加至微流控芯片的反應(yīng)區(qū)，將信號(hào)探針添加至微流控芯片的進(jìn)樣區(qū)。

47、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：

48、(1)微流控芯片的設(shè)計(jì)：由進(jìn)樣區(qū)、液道區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)四個(gè)部分組成；

49、(2)微流控芯片的制作：等離子處理硅片后加光刻膠，勻膠、烘烤；曝光后顯影，清洗吹干后加熱，加三甲基氯硅烷溶液抗粘附；將二甲基硅氧烷和固化劑混合物倒入模具，烘烤固化，剝離出來(lái)按設(shè)計(jì)要求進(jìn)行切割、打孔；將二甲基硅氧烷溝道面與待鍵合的玻璃放入到等離子清洗機(jī)內(nèi)處理，按壓鍵合，烘烤成型。

50、本發(fā)明的第三方面提供一種基于鏈量放大增強(qiáng)熒光的高通量金黃色葡萄球菌腸毒素微流控芯片檢測(cè)方法，采用本發(fā)明所述的微流控芯片進(jìn)行，包括以下步驟：

51、(1)將待測(cè)樣品與熒光傳感器的識(shí)別探針混合，再加入信號(hào)探針混合孵育；

52、(2)混合孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行磁分離、去上清、復(fù)溶、dna雙鏈解離、再次磁分離，吸取上清液并檢測(cè)熒光；

53、(3)將步驟(2)得到的熒光值代入毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品中毒素的濃度；所述毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)步驟(1)、(2)的方法測(cè)定一系列毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液建立；

54、在一個(gè)實(shí)施方案中，識(shí)別探針和信號(hào)探針用量摩爾比例為1:0.5～1:2。

55、在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)包括對(duì)上清液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行裸眼可視和/或熒光光譜分析。例如，對(duì)上清液在激發(fā)光波長(zhǎng)470nm處，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為500-700nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定分析。

56、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，檢測(cè)方法包括以下步驟：

57、(1)將待測(cè)樣品加入熒光微流控芯片的進(jìn)樣區(qū)中；使待測(cè)樣品經(jīng)由液道區(qū)分別進(jìn)入不同的反應(yīng)區(qū)，與反應(yīng)區(qū)內(nèi)的識(shí)別探針混合；

58、(2)然后將信號(hào)探針溶液加入微流控芯片的進(jìn)樣區(qū)中，使信號(hào)探針經(jīng)由液道區(qū)分別進(jìn)入不同的反應(yīng)區(qū)，進(jìn)行混合孵育；

59、(3)混合孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行磁分離、去上清、復(fù)溶、dna雙鏈解離、再次磁分離，將上清液吸取入檢測(cè)區(qū)，檢測(cè)其熒光；

60、(4)將步驟(3)得到的熒光值代入毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品中毒素的濃度；所述毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)步驟(1)-(3)的方法測(cè)定一系列毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液建立。

61、在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中所述的孵育反應(yīng)的時(shí)間為5～30min。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，步驟(2)中所述的孵育反應(yīng)的時(shí)間為15min。

62、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光微流控芯片如圖13a所示，所述方法包括以下步驟：

63、(1)在反應(yīng)區(qū)預(yù)加載適配體功能化的磁性納米顆粒mnps-h1和靶標(biāo)適配體互補(bǔ)鏈h2，磁分離，棄去上清，右側(cè)進(jìn)樣區(qū)加入待測(cè)樣品和aunps-h3-h4-h5復(fù)合物，左側(cè)進(jìn)樣區(qū)加入aunps-h3-h4-h5復(fù)合物，右側(cè)進(jìn)樣區(qū)孵育得到mnps-ssdna-aunps復(fù)合物；

64、(2)將步驟(1)得到的mnps-ssdna-aunps復(fù)合物復(fù)融、混勻、磁分離、取上清液體至檢測(cè)區(qū)進(jìn)行熒光成像，分析熒光值。

65、本發(fā)明的第四方面提供所述微流控芯片的下述任一應(yīng)用：

66、(i)在檢測(cè)毒素中的應(yīng)用；

67、(ii)在制備用于檢測(cè)毒素引起疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

68、在本發(fā)明中，毒素是一種天然存在的有機(jī)毒物，由活細(xì)胞或生物體的代謝活動(dòng)產(chǎn)生。毒素尤其以蛋白質(zhì)或結(jié)合蛋白的形式出現(xiàn)，可以對(duì)人類、動(dòng)物和植物造成嚴(yán)重的損害。毒素可包括真菌毒素、細(xì)菌毒素、植物和動(dòng)物毒素，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，毒素可以是細(xì)菌毒素、真菌毒素。其中，細(xì)菌毒素包括但不限于金黃色葡萄球菌腸毒素、白喉毒素、破傷風(fēng)痙攣毒素、肉毒毒素、霍亂腸毒素及綠膿桿菌外毒素a。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌毒素選自金黃色葡萄球菌腸毒素。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌腸毒素包括sea、seb和sec1。其中，真菌毒素可由包括但不限于曲霉菌屬(主要分泌黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等)、青霉菌屬(主要分泌橘霉素等)、麥角菌屬(主要分泌麥角毒素)、鐮孢菌屬分泌。在一些實(shí)施方案中，真菌毒素由曲霉菌屬、鐮孢菌屬分泌。在一些實(shí)施方案中，真菌毒素為afb1、zen、ota、fb1。

69、本發(fā)明將熒光適配體傳感器與微流控芯片相結(jié)合，基于aunps和mnps組合的“三明治”夾層結(jié)構(gòu)體系，構(gòu)建食品中sea、seb和sec1高通量檢測(cè)技術(shù)。其原理如圖18所示，鏈霉親和素修飾的mnps與生物素修飾的核酸適配體序列h1結(jié)合，在靶標(biāo)存在情況下，適配體互補(bǔ)鏈h2與靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)與適配體結(jié)合。其次，被巰基標(biāo)記的dna序列h3與aunps通過(guò)金巰鍵相結(jié)合，不同比例的h4和被fam熒光基團(tuán)標(biāo)記的h5序列與h3序列堿基配對(duì)，利用aunps的鏈量放大作用以實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)增強(qiáng)。最后，將mnps-ssdna復(fù)合物和aunps-ssdna復(fù)合物混合孵育以形成mnps-ssdna-aunps三明治夾層結(jié)構(gòu)體系。微流控芯片設(shè)計(jì)了四個(gè)區(qū)域，分別是進(jìn)樣區(qū)、液道區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)。在反應(yīng)區(qū)預(yù)加載適配體功能化磁珠后磁性分離，左側(cè)進(jìn)樣區(qū)加入緩沖液，右側(cè)進(jìn)樣區(qū)加入目標(biāo)毒素，左右兩側(cè)進(jìn)樣區(qū)加入帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的aunps，通過(guò)加熱使dna雙鏈結(jié)構(gòu)解離。利用mnps優(yōu)異的超順磁性分離出大量熒光標(biāo)記的信號(hào)分子，移取上清液體至檢測(cè)區(qū)進(jìn)行熒光成像分析。在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，熒光微流控芯片的每三個(gè)編號(hào)預(yù)加載一種se的識(shí)別探針，每種毒素可以在單個(gè)芯片內(nèi)同時(shí)檢測(cè)三次，該芯片允許對(duì)三種毒素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行熒光值分析。此外，微流控芯片可以通過(guò)簡(jiǎn)單的手動(dòng)操作完成所有樣品的檢測(cè)過(guò)程并通過(guò)image?j軟件分析熒光值。該芯片檢測(cè)系統(tǒng)可以對(duì)三種ses進(jìn)行高通量檢測(cè)，是一種便攜式、低成本且操作簡(jiǎn)單的定量分析檢測(cè)技術(shù)。

70、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：

71、本發(fā)明制備了高通量快速檢測(cè)毒素的熒光傳感器，所述熒光傳感器包括信號(hào)探針aunps-h3-h4-h5和識(shí)別探針mnps-h1-h2，將所述熒光傳感器與微流控芯片結(jié)合，建立了一種靈敏快速檢測(cè)毒素的方法，所述方法具有裸眼可視化、檢測(cè)目標(biāo)物多、檢出限低、線性范圍廣、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、能夠滿足對(duì)毒素高靈敏和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求等優(yōu)點(diǎn)，是一種直觀高靈敏檢測(cè)毒素的方法。

72、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。