本發(fā)明屬于免疫層析檢測，具體涉及一種檢測雞蛋/肉中磷酸奧司他韋免疫層析試紙及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、磷酸奧司他韋(oseltamivir?phosphate,op)是一種乙酯原藥，廣泛用于治療和預(yù)防甲型和乙型流感病毒感染?？诜p后，op會被胃腸道吸收，并在肝臟酯酶的作用下代謝為奧司他韋羧酸(oseltamivir?carboxylic?acid,oca)。oca是一種強(qiáng)效的選擇性流感病毒抑制劑，能與病毒表面蛋白神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,na)結(jié)合并抑制其活性。對神經(jīng)氨酸酶活性的特異性抑制最終會阻止病毒從感染細(xì)胞中釋放，并減輕與感染相關(guān)的癥狀。op殘留物可能通過食物鏈進(jìn)入人體，影響人體健康。研究表明，接觸過量的op會導(dǎo)致腸胃功能紊亂、神經(jīng)精神異常癥狀和猝死。因此，檢測農(nóng)業(yè)和食品中的op對人類健康至關(guān)重要，需要建立op殘留監(jiān)測系統(tǒng)。

2、迄今為止，已有多種檢測op的分析方法被報(bào)道，包括高效液相色譜法(hplc)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(uplc-ms/ms)和液相色譜-質(zhì)譜法(lc-ms)。雖然這些方法準(zhǔn)確度和靈敏度都很高，但它們依賴于昂貴的分析儀器、復(fù)雜的預(yù)處理步驟和熟練的專業(yè)人員。此外，這些方法也不適合高通量隨即檢測和實(shí)時(shí)現(xiàn)場檢測。相反，lfist利用抗體與抗原之間的特異性相互作用，采用夾心形式或競爭形式，既快速又便于非專業(yè)人員使用。用于特異性檢測細(xì)菌、病毒、殺蟲劑、獸藥、毒素和過敏原的lfist已經(jīng)開發(fā)出來并進(jìn)行了測試。然而，目前還沒有用于檢測op的lfist。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測雞蛋/肉中磷酸奧司他韋免疫層析試紙。

2、本發(fā)明的主要目的在于還提供了檢測雞蛋/肉中磷酸奧司他韋免疫層析試紙的制備方法。

3、一種檢測雞蛋/肉中磷酸奧司他韋免疫層析試紙，包括底板，所述底板上設(shè)置有依次搭接的樣品墊、包被反應(yīng)膜和吸水墊，所述包被反應(yīng)膜為設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，所述檢測區(qū)包被有op-bsa包被抗原，質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠igg，所述結(jié)合層為膠體金標(biāo)記的抗op單克隆抗體。

4、在某些具體實(shí)施方式中，所述op-bsa通過如下方法制備：

5、將oca與n-羥基琥珀酰亞胺、1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n,n-二甲基甲酰胺，在室溫下混合，得到混合物a；

6、然后，將混合物a加入溶解牛血清白蛋白的pbs中，攪拌均勻，得到混合物b；

7、將混合物b對pbs進(jìn)行透析，離心收集，得到op-bsa。

8、在某些具體實(shí)施方式中，所述抗op單克隆抗體通過如下制備方法獲得：

9、將60μg?op-bsa與100μl磷酸緩沖鹽溶液(phosphate?buffered?saline,pbs)混合，與100μl免疫佐劑充分乳化后，經(jīng)背部皮下接種balb/c雌性小鼠；其中第一次用弗氏完全佐劑(freund's?complete?adjuvant,fca)，第2～4次免疫用弗氏不完全佐劑(freund'sincomplete?adjuvant,fia)，間隔21天，共接種4次，免疫結(jié)束后，手術(shù)摘取免疫小鼠的脾臟，將制備好的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)一系列hat培養(yǎng)基培養(yǎng)、elisa法篩選、有限稀釋法亞克隆得到分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，再將所述雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，產(chǎn)生含抗體的腹水，并使用hitrap?protein?a柱純化，得到抗op單克隆抗體。

10、在某些具體實(shí)施方式中，所述膠體金標(biāo)記的抗op單克隆抗體通過如下制備方法獲得：

11、用1％檸檬酸鈉(w/v)還原氯化金制備金，用0.2mol/l碳酸鈉調(diào)節(jié)膠體金溶液的ph值至8.2；將50μl抗op?mab溶液在雙蒸水(doubledistilled?water,ddw)中2倍連續(xù)稀釋，與200μl膠體金溶液混合，然后在室溫下加入200μl?10％氯化鈉溶液，以確定膠體金溶液和抗op?mab溶液的最佳比例；8分鐘后，隨著抗op?mab濃度的降低，溶液顏色由鮮紅色變?yōu)樗{(lán)色；膠體金標(biāo)記mab的最合適濃度是顏色發(fā)生改變的mab溶液的最低濃度；將兩者按最佳比例進(jìn)行混合，即制得膠體金標(biāo)記的抗op單克隆抗體。

12、在某些具體實(shí)施方式中，所述oca、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的質(zhì)量比為(50-60)：(20-30)：(40-50)。

13、在某些具體實(shí)施方式中，所述oca與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為(50-60):(100-110)。

14、進(jìn)一步：所述oca與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為55:105。

15、在某些具體實(shí)施方式中，其中所述包被反應(yīng)膜的制備方法包括以下步驟：以硝酸纖維素膜為反應(yīng)膜，用包被緩沖液將所述包被抗原調(diào)節(jié)濃度至0.9～1.1mg/ml，得到檢測包被抗原溶液；并用包被緩沖液將羊抗鼠igg調(diào)節(jié)濃度至0.9～1.1mg/ml，得到質(zhì)控包被抗原溶液；按照0.8～1.2μl/cm的膜液量，分別將檢測包被抗原溶液和質(zhì)控包被抗原溶液噴到反應(yīng)膜對應(yīng)的檢測區(qū)和控制區(qū)，檢測區(qū)和控制區(qū)之間間隔為5.0mm，放置45℃烘箱處理30min，即得；所述包被緩沖液為含有1wt％蔗糖、0.05wt％疊氮化鈉的0.1m?pb緩沖液，ph＝7.4。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

17、1)本發(fā)明所提供的種檢測雞蛋/肉中磷酸奧司他韋免疫層析試紙，包括底板，底板上設(shè)置有依次搭接的樣品墊、包被反應(yīng)膜和吸水墊，包被反應(yīng)膜為設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，檢測區(qū)包被有op-bsa包被抗原，質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠igg；結(jié)合層為膠體金標(biāo)記的抗op單克隆抗體。經(jīng)證實(shí)，本技術(shù)中的免疫層析試紙，檢測雞蛋和雞肉樣品的靈敏度(半數(shù)抑制濃度，ic50)分別為2.56和2.63μg/kg，檢測限(limit?detection,lod)分別為0.43和0.42μg/kg。在批內(nèi)和批間重現(xiàn)性方面，op加標(biāo)樣品的回收率為82.8％～91.2％，變異系數(shù)(coefficients?of?variations,cv)小于5.67％(批內(nèi))和6.52％(批間)。在雞蛋樣品和雞肉樣品的平行測試中，lfist的性能可與高效液相色譜法(high?performance?liquidchromatography,hplc)相媲美；lfist檢測時(shí)間不到5分鐘，無需依賴專業(yè)人員，因此可用作現(xiàn)場檢測op殘留的監(jiān)測工具，具有較高的社會和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

18、2)本發(fā)明的制備方法，通過采用活性酯法對奧司他韋羧酸(oseltamivircarboxylic?acid,oca)進(jìn)行化學(xué)修飾，制備得到高質(zhì)量的免疫原，免疫小鼠后，得到的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得的單克隆抗體用于elisa檢測特異性強(qiáng)，ic50值為2.35ng/ml。本發(fā)明還建立了檢測雞蛋/肉中磷酸奧司他韋op的膠體金免疫層析技術(shù)，快速、便捷地實(shí)現(xiàn)雞蛋/肉中磷酸奧司他韋op的定性檢測，在實(shí)際樣本中的檢測靈敏度達(dá)0.42μg/kg，穩(wěn)定性好，滿足市場應(yīng)用中的保存、運(yùn)輸和使用要求。