專(zhuān)利名稱：蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和蛋白質(zhì)固定化電極的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)涉及蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的制造方法、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的制造方法以及蛋白質(zhì)固定化電極。更具體地講，本公開(kāi)涉及在蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的制造方法、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的制造方法和蛋白質(zhì)固定化電極中使用具有細(xì)胞色素(cytochrome)b562堿基(base)的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
期待蛋白質(zhì)成為替代半導(dǎo)體器件的下一代功能器件。半導(dǎo)體器件僅僅可以小型化到幾十納米，而蛋白質(zhì)可以在2nm至IOnm的小得多的尺寸下表現(xiàn)出高度精密的、復(fù)雜的功倉(cāng)泛。已經(jīng)提出了一種使用蛋白質(zhì)的光電轉(zhuǎn)換器件，具體來(lái)說(shuō)是使用蛋白質(zhì)固定化電極的光電轉(zhuǎn)換器件，在該蛋白質(zhì)固定化電極的結(jié)構(gòu)中通過(guò)以鋅取代馬心肌細(xì)胞色素 c (horse myocardial cytochrome c)中血紅素(heme,亞鐵血紅素)的中心金屬鐵獲得的鋅取代細(xì)胞色素c被固定在金電極上。介紹了蛋白質(zhì)固定化電極能夠產(chǎn)生光電流(參見(jiàn) JP-A-2007-220445)。作為使用蛋白質(zhì)的光電轉(zhuǎn)換器件的另一個(gè)示例，提出一種使用蛋白質(zhì)固定化電極的器件，在該蛋白質(zhì)固定化電極的結(jié)構(gòu)中鋅取代細(xì)胞色素C552被固定在金電極上(參見(jiàn) JP-A-2010-190646)。有多個(gè)關(guān)于細(xì)胞色素b562的報(bào)道，包括使用大腸桿菌的表達(dá)和純化方法(參見(jiàn) Nikkila，H.，Gennis，R. B. and Sliger，S. G. Eur. J. Biochem. 202，309 (1991))、構(gòu)象(conformation)(256B. pdb, 參見(jiàn) Mathews, F. S. , Bethge, P. H. and Czerwinski, E. ff. J. Biol. Chem. 254，1699 (1979))、用于提取血紅素的方法(參見(jiàn) Itagaki，Ε·，Palmer,
G.and Hager, L. P. J. Biol. Chem. 242，2272 (1967))、用于結(jié)合鋅卟啉的方法(參見(jiàn) Hamachi, I. , Takashima, H. , Tsukiji, S. Shinkai, S. , Nagamune, T. and Oishi, S. Chem. Lett. 1999，551 (1999))、用于將醌(quinone)結(jié)合到分子中的方法(參見(jiàn)Hay, S.， Wallace, B. B., Smith, T. A., Ghiggino, K. P. and Wydrzynski, T. Proc. Natl.Sci USA, 101,17675(2004))以及用于銀電極的固定方法(參見(jiàn) Zuo，P.，Albrecht, T. Baker, P. D.， Murgida, D. H. and Hildebrandt, P. Phys. Chem. Chem. Phys. 11, 7430 (2009))。還提出了一種使用鋅取代細(xì)胞色素C552的用于藍(lán)光的光電轉(zhuǎn)換器件，以及使用改性的鋅卟啉細(xì)胞色素C552 的用于紅光或綠光的光電轉(zhuǎn)換器件(參見(jiàn)JP-A-2010-190646)。

發(fā)明內(nèi)容
然而，在JP-A-2007-220445中提出的光電轉(zhuǎn)換器件中的鋅取代細(xì)胞色素c的制備中使用的馬心肌細(xì)胞色素c中，輔基(prosthetic group) P卜啉被共價(jià)結(jié)合到半胱胺酸殘基。這使得難以從馬心肌細(xì)胞色素c分離卟啉，并且僅僅可能以鋅或錫來(lái)置換中心鐵。這已經(jīng)嚴(yán)重地限制了可使用的蛋白質(zhì)類(lèi)型。因此，需要使用包括通過(guò)使用源自大腸桿菌(Escherichia coli)的細(xì)胞色素b562作為堿基制備的金屬取代細(xì)胞色素b562的各種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件及其制造方法。還需要使用各種蛋白質(zhì)(包括通過(guò)使用源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562作為堿基制備的金屬取代細(xì)胞色素b562)的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)及其制造方法。而且，需要蛋白質(zhì)固定化電極及其制造方法，其中，包括通過(guò)使用源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562作為堿基制備的金屬取代細(xì)胞色素b562的各種蛋白質(zhì)被固定。本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究以解決現(xiàn)有技術(shù)的上述問(wèn)題，并且發(fā)現(xiàn)使用源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562作為堿基的蛋白質(zhì)可以有效地用作用于蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的蛋白質(zhì)。細(xì)胞色素b562使得很容易將血紅素或卟啉添加或去除，并且可以容易地通過(guò)中心金屬的置換或卟啉的改性而提供多種顏色。還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素b562或使用細(xì)胞色素b562作為堿基的蛋白質(zhì)很容易被固定在金電極上。另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是將具有Π電子的氧化還原活性基團(tuán)(redox active group)導(dǎo)入到使用細(xì)胞色素b562作為堿基的蛋白質(zhì)的分子中可以放大光電流?；谟杀景l(fā)明人獨(dú)立地獲得的上述發(fā)現(xiàn)，通過(guò)由本發(fā)明人進(jìn)行的刻苦研究完成了本發(fā)明。本公開(kāi)的實(shí)施方式旨在提供一種蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其包括金電極；和固定在金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩(zinc chlorin)細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方式旨在提供一種包括蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，該器件包括金電極；和固定在金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。本公開(kāi)的又一實(shí)施方式旨在提供一種用于制造蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的方法，該方法包括將金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體固定在金電極上。本公開(kāi)的再一實(shí)施方式旨在提供一種用于制造光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的方法，該方法包括將金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體固定在金電極上。本公開(kāi)的再一實(shí)施方式旨在提供一種蛋白質(zhì)固定化電極，其包括金電極；和固定在金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。優(yōu)選地，金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體、或者細(xì)胞色素b562或其衍生物或變體以其含有的卟啉丙酸(porphyrin propionic acid)面向金電極的取向而被固定。根據(jù)要求，具有Π電子的氧化還原活性基團(tuán)被導(dǎo)入到金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。根據(jù)需要可使用并選擇已知的氧化還原活性基團(tuán)。優(yōu)選地，色氨酸或醌被用作氧化還原活性基團(tuán)。適當(dāng)?shù)剡x擇金屬取代細(xì)胞色素b562的金屬，以便獲得期望的光電轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)。示例包括鋅(Zn)、鈹(Be)、鍶(Sr)、鈮(Nb)、鋇(Ba)、镥(Lu)、鉿(Hf)、鉭(Ta)、鎘(Cd)、銻(Sb)、釷(Th)和鉛(Pb)。細(xì)胞色素b562、金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的衍生物是骨架 (主鏈)氨基酸殘基或卟啉被化學(xué)方法改性的化合物。細(xì)胞色素b562、金屬取代細(xì)胞色素b562 或者鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的變體是骨架氨基酸殘基的一部分被其他氨基酸殘基取代的化合物。光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)典型地包括響應(yīng)不同波長(zhǎng)的光的兩種以上的光電轉(zhuǎn)換器件。光電轉(zhuǎn)換器件中的至少一種是蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其包括金電極和固定在金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562、鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562、或者其衍生物或變體。根據(jù)諸如光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的使用目的等因素適當(dāng)?shù)剡x擇光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中光電轉(zhuǎn)換器件的數(shù)量。光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)是，例如，彩色成像器件或光學(xué)傳感器。除了其中金屬取代細(xì)胞色素b562、鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或者其衍生物或變體被固定在金電極上的蛋白質(zhì)固定化電極之外，蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件還可包括對(duì)電極。對(duì)電極設(shè)置在蛋白質(zhì)固定化電極對(duì)面，它們之間具有間隙。根據(jù)如上配置的本公開(kāi)的實(shí)施方式，可以比在細(xì)胞色素c中更加容易地執(zhí)行源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562的血紅素或卟啉進(jìn)出的轉(zhuǎn)移。由此，通過(guò)使用細(xì)胞色素b562作為堿基，可以容易地制備各種蛋白質(zhì)，諸如金屬取代細(xì)胞色素b562和鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562。而且，通過(guò)使用用于蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的金屬取代細(xì)胞色素b562、鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562 或者其衍生物或變體，光電轉(zhuǎn)換器件可以吸收各種不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。本公開(kāi)的實(shí)施方式可以實(shí)現(xiàn)，例如，使用各種蛋白質(zhì)(例如從用作堿基的細(xì)胞色素b562制備的金屬取代細(xì)胞色素b562)的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件、以及使用該蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的各種光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。然后利用這些器件或系統(tǒng)制造的高品質(zhì)彩色成像器件、光學(xué)傳感器或光電轉(zhuǎn)換器件可以用于實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的電子裝置。


圖I是示出根據(jù)本公開(kāi)第一實(shí)施方式的蛋白質(zhì)固定化電極的示意圖；圖2是示出了純化的細(xì)胞色素b562的吸收光譜的示意圖；圖3A至3C是示出了細(xì)胞色素b562的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖4是示出了經(jīng)由自組單分子層(self-assembled monolayer)在金電極上如何吸附細(xì)胞色素b562的示意圖；圖5是示出了利用細(xì)胞色素b562固定化金滴電極(gold drop electrode)獲得的循環(huán)伏安圖的示意圖；圖6是示出了鋅取代細(xì)胞色素b562的吸收光譜的示意圖；圖7是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的光電流實(shí)時(shí)波形的示意圖；圖8是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的光電流作用光譜的示意圖；圖9是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的電流電壓曲線的示意圖；圖10是示出了鋅二氫卟吩的結(jié)構(gòu)的示意圖11是示出了鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的柱洗脫模式的示意圖；圖12是示出了鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的吸收光譜的示意圖；圖13是示出了利用鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的光電流作用光譜的示意圖；圖14是示出了利用鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極、鋅二氫卟吩固定化金滴電極和二氫卟吩固定化金滴電極獲得的光電流作用光譜的示意圖；圖15是示出了利用鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的電流電壓曲線的示意圖；圖16是示出了鋅取代細(xì)胞色素b562I17X/H63N的吸收光譜的示意圖；圖17是示出了如何經(jīng)由自組單分子層在金電極上吸附鋅取代細(xì)胞色素b562I17X/ H63N的示意圖；圖18是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562I17X/H63N固定化金滴電極獲得的光電流作用光譜的示意圖；圖19是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562I17X/H63N固定化金滴電極、ZnPP固定化金滴電極和野生型鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得光電流作用光譜的示意圖；圖20是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562I17X/H63N固定化金滴電極、ZnPP固定化金滴電極和野生型鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得光電流實(shí)時(shí)波形的示意圖；圖21是示出了利用鋅取代細(xì)胞色素b562I17X/H63N固定化金滴電極、ZnPP固定化金滴電極和野生型鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的光電流作用光譜的示意圖；圖22是示出了利用具有不同的甲基紫精添加量的野生型鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極獲得的電流電壓曲線的示意圖；圖23是示出了利用具有不同的甲基紫精添加量的鋅取代細(xì)胞色素b562I17W/H63N 固定化金滴電極獲得的電流電壓曲線的示意圖；圖24是在光學(xué)顯微鏡下觀察的細(xì)胞色素b562I17W/H63N晶體的相片；圖25是示出了細(xì)胞色素b562I17W/H63N晶體的晶胞的示意圖；圖26是示出了色氨酸17附近細(xì)胞色素b562I17W/H63N的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖27是在野生型細(xì)胞色素b562和細(xì)胞色素b562I17W/H63N之間比較A鏈的示意圖；圖28是在野生型細(xì)胞色素b562和細(xì)胞色素b562I17W/H63N之間比較C鏈的示意圖；圖29是示出了野生型細(xì)胞色素b562和細(xì)胞色素b562I17W/H63N在A鏈上色氨酸17 附近的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖30是示出了野生型細(xì)胞色素b562和細(xì)胞色素b562I17W/H63N在C鏈上色氨酸17 附近的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖31是示出根據(jù)本公開(kāi)第二實(shí)施方式的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的示意圖；圖32是示出了根據(jù)本公開(kāi)第二實(shí)施方式的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的第一示例性用法的示意圖；圖33是示出了根據(jù)本公開(kāi)第二實(shí)施方式的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的第二示例性用法的示意圖；圖34是示出了根據(jù)本公開(kāi)第二實(shí)施方式的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的第三示例性用法的示意圖35是示出根據(jù)本公開(kāi)第三實(shí)施方式的無(wú)液體接觸全固體型蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的截面圖；圖36是放大圖35中所示的無(wú)液體接觸全固體型蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的相關(guān)部分的截面圖；圖37是解釋根據(jù)本公開(kāi)第三實(shí)施方式的無(wú)液體接觸全固體型蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的操作的示意圖；圖38是示出了根據(jù)本公開(kāi)第四實(shí)施方式的彩色成像器件的第一示例的示意圖；圖39是示出了根據(jù)本公開(kāi)第四實(shí)施方式的彩色成像器件的第二示例的示意圖。
具體實(shí)施例方式
行描述。
下面將描述用于實(shí)現(xiàn)本公開(kāi)的模式(下文中稱為“實(shí)施方式”)。將以下述次序進(jìn)
1.第一實(shí)施方式(蛋白質(zhì)固定化電極及其制造方法)
2.第二實(shí)施方式(蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件)
3.第三實(shí)施方式(無(wú)液體接觸全固體型蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件)
4.第四實(shí)施方式(彩色成像器件)〈L第一實(shí)施方式〉[蛋白質(zhì)固定化電極]圖I示出了根據(jù)第一實(shí)施方式的蛋白質(zhì)固定化電極。如圖I中所示，蛋白質(zhì)固定化電極包括金電極11和其上固定的蛋白質(zhì)12。蛋白質(zhì)12是源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562、金屬取代細(xì)胞色素b562、鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或者它們的衍生物或變體。雖然圖I中所示的蛋白質(zhì)12是一個(gè)分子，但是可根據(jù)需要決定金電極11上固定的蛋白質(zhì)12的數(shù)量。通常，多個(gè)蛋白質(zhì)12被固定作為單分子膜(monomolecuIar film,單分子層)或多分子膜。而且，盡管圖I中所示的金電極11具有平坦表面，但是金電極11可具有任意表面形狀，例如包括，凹陷表面、凸起表面和不規(guī)則表面。不管是什么表面形狀，都可以容易地固定蛋白質(zhì)12。而且，金電極11整體上可具有任意形狀，例如包括，平板形狀和滴狀。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)12以血紅素或卟啉丙酸在金電極11側(cè)的方式而固定。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)12的血紅素或卟啉丙酸位點(diǎn)具有大的負(fù)電荷，所以當(dāng)金電極11的表面帶正電時(shí)通過(guò)靜電吸引力可以在金電極11上吸附蛋白質(zhì)12?？梢允褂酶鞣N已知方法使金電極11的表面帶正電，這可根據(jù)需要而進(jìn)行選擇。例如，可以使用以允許正電荷在金電極11出現(xiàn)在最外表面上的方式形成自組單分子層(SAM)的方法。[蛋白質(zhì)固定化電極的制造方法]例如，通過(guò)使金電極11的表面帶正電并將金電極11浸潰在溶解了蛋白質(zhì)12的緩沖液中以在金電極11的表面上吸附蛋白質(zhì)12，可以制造蛋白質(zhì)固定化電極。[實(shí)施例I]a.源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562的表達(dá)和純化方法制備結(jié)合了源自大腸桿菌的細(xì)胞色素b562的結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒(Cyt_b562/PKK223-3)，并轉(zhuǎn)化為大腸桿菌 JM109 株。按照 Nikkila, H.，Gennis, R. B.，and Sliger,
S.G. Eur. J. Biochem. 202，309 (1991)中描述的方法表達(dá)和純化。在37°C的LB-Amp培養(yǎng)基(IOOmL)中培養(yǎng)過(guò)夜的預(yù)培養(yǎng)液(preculture)被轉(zhuǎn)移到極品肉湯(Terrific broth) 4L(2LX 2)中，并且在37°C培養(yǎng)5至6個(gè)小時(shí)。在添加O. 2mM IPTG之后，將細(xì)胞在25°C進(jìn)一步培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)。結(jié)果，獲得紅色的細(xì)菌(70g)。將細(xì)菌冷凍，然后懸浮在含有ImM EDTAUmM PMSF、0. 2mg/mL溶解酶、DTT(適量)和DNase (適量)的 IOmM Tris-HCKpH 8. 0,200mL)中。然后通過(guò)超聲波粉碎細(xì)胞。在離心分離之后將2M磷酸添加到上清液以將pH調(diào)整到4. 5，并且通過(guò)離心分離析出不需要的蛋白質(zhì)。所得樣本通過(guò)CM52陰離子交換柱色譜(柱容積80mL，50mM至150mM KCl線性梯度/50mM磷酸鉀(pH4. 55))以及通過(guò)S印hadex G50 Finegel過(guò)濾色譜(柱容積480mL，50mM Tris-HCl，O. ImM EDTA, pH 8. O)來(lái)純化。結(jié)果，獲得大約80mg的細(xì)胞色素
V)
u562°圖2示出了純化的細(xì)胞色素b562的吸收光譜。對(duì)浸潰在IOmM磷酸鈉(pH 7. O)緩沖液中的純化的細(xì)胞色素b562進(jìn)行測(cè)量。如圖2所示,純化狀態(tài)的細(xì)胞色素b562為氧化形式，在418nm和532nm具有吸收峰。在將少量連二亞硫酸鹽添加到緩沖液中獲得的還原形式中，證實(shí)在426nm、531nm和562nm處具有吸收峰。細(xì)胞色素b562具有下面的氨基酸序列。在該氨基酸序列中，血紅素的配體蛋氨酸7 和組氨酸102 (下劃線部分)、和異亮氨酸17具有重要作用，將在下文中描述。ADLEDNMETL NDNLKVIEKA DNAAQVKDAL TKMRAAALDA QKATPPKLED KSPDSPEMKD FRHGFDILVG QIDDALKLAN EGKVKEAQAA AEQLKTTRNA YHQKYRb.在金滴電極上固定細(xì)胞色素b562圖3A、3B和3C示出了 1979年通過(guò)X射線晶體結(jié)構(gòu)分析確定的細(xì)胞色素b562 晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn) Mathews, F. S. , Bethge, P. H. , and Czerwinski, E. ff. J. Biol. Chem. 254, 1699(1979))。圖3A示出了帶狀模型(ribbon model)，血紅素和配體氨基酸以棒狀模型 (rod model)顯示。圖3B示出了如圖3A中取向的細(xì)胞色素b562的電荷分布。通過(guò)虛線圈定的橢圓區(qū)域是具有最強(qiáng)負(fù)電荷的血紅素丙酸暴露表面(在圖3C中同樣如此)。圖3C示出了從圖3B所示的狀態(tài)繞豎直軸旋轉(zhuǎn)180°的細(xì)胞色素b562的電荷分布(圖3B所示的細(xì)胞色素b562的背面)。如圖3A、3B和3C所示,細(xì)胞色素b562具有4螺旋束(helix bundle) 結(jié)構(gòu)，并且有一個(gè)輔基血紅素分子。血紅素丙酸從分子伸出而被暴露。在圖3B的電荷分布中，可以看到強(qiáng)負(fù)電荷出現(xiàn)在血紅素的丙酸位點(diǎn)處。由此，當(dāng)使金電極11的表面帶正電時(shí)， 細(xì)胞色素b562可以在血紅素的丙酸位點(diǎn)處吸附在金電極11上。圖4圖示了該狀態(tài)(僅血紅素以棒狀模型示出)。在此實(shí)施例中，在金電極11上形成在最外表面上具有正電荷的自組單分子層13，并且通過(guò)在自組單分子層13的帶正電的最外表面和細(xì)胞色素b562的帶負(fù)電的血紅素丙酸位點(diǎn)之間作用的靜電引力將細(xì)胞色素b562吸附在自組單分子層13上。具有2mm直徑的金滴電極形成為金電極11。用熱濃硫酸(120°C )洗滌金滴電極，以及通過(guò)在濃硫酸中的氧化還原循環(huán)處理來(lái)粗糙化金滴電極的表面(形成更加不規(guī)則表面)。在室溫下將金滴電極浸入0. ImM 11-氨基i^一硫醇(H2N-C11-SH)/乙醇溶液至少16個(gè)小時(shí)，以形成H2N-C11-SH膜作為金滴電極的表面上的自組單分子層13。用壓縮空氣干燥具有H2N-C11-SH膜的金滴電極，并且在50 μ M細(xì)胞色素b562/4. 4mM磷酸鉀溶液(pH 7. 20) (60 μ L)浸泡之后，在4°C培養(yǎng)一晝夜。圖5示出了通過(guò)將培養(yǎng)后的金滴電極浸潰在IOmM磷酸鈉(pH 7. O)中測(cè)量的循環(huán)伏安圖。電位掃描速度是lV/s。如圖5所示，獲得吸附循環(huán)伏安圖。金滴電極表面上的細(xì)胞色素b562具有L 7±0· 6pmol/cm2的有效表面積。氧化還原電位是· · 4±llmV vs Ag/ AgCl，并且細(xì)胞色素b562和金滴電極之間的電子轉(zhuǎn)移速度常數(shù)是90±12S'當(dāng)在金滴電極的表面上形成的11-氨基十一硫醇中混合0%至10%的羥基十一硫醇時(shí)，也獲得相同的吸附效果。圖5還示出了 11-氨基i^一硫醇和10%羥基十一硫醇的混合物的循環(huán)伏安圖。[實(shí)施例2]a.鋅取代細(xì)胞色素b562的制備在 Hamachi et al. (Hamachi, I. , Takashima, H. , Tsukiji, S. Shinkai, S., Nagamune, T. and Oishi, S. Chem. Lett. 1999,551(1999))中報(bào)告了用于制備鋅取代細(xì)胞色素b562的方法，因此，根據(jù)該刊物中描述的方法制備了鋅取代細(xì)胞色素b562。首先，將IM鹽酸添加到3mL的細(xì)胞色素b562水溶液(33 μ Μ)以調(diào)整pH至2 3。 然后，將3mL的水冷的2-丁酮添加到細(xì)胞色素b562水溶液，并且平緩地?cái)嚢杌旌衔镆詮募?xì)胞色素b562萃取血紅素。通過(guò)移液去除丁酮層。重復(fù)該萃取過(guò)程直到丁酮層不帶有任何顏色。 然后在重復(fù)的血紅素萃取過(guò)程之后將微量IM Tris-HCKpH 8.0)添加到水溶液，以調(diào)整pH 至7 8,并且用超純水透析該溶液(2LX5次)以獲得脫血紅素細(xì)胞色素(apocytochrome)
V)
u562°在二甲亞砜中溶解鋅原卟啉IX(ZnPP)，并且以兩等份被添加到脫血紅素細(xì)胞色素 b562 溶液。使用以 50mM Tris-HCl (pH 8.0)和 O. ImM EDTA 平衡的 Bio-gel PlO 脫鹽柱來(lái)收集蛋白質(zhì)懼分(fraction),并且獲得純化的鋅取代細(xì)胞色素b562 (Zn-Cyt b562)。圖6示出了鋅取代細(xì)胞色素b562的吸收光譜。對(duì)浸潰在IOmM磷酸鈉(pH 7. 0)緩沖液中的鋅取代細(xì)胞色素b562進(jìn)行測(cè)量。如圖6所示，吸收峰出現(xiàn)在280nm、357nm、429nm、 554nm和593nm處，與Hamachi等報(bào)告的位置一致。在429nm波長(zhǎng)的吸光率與在554nm波長(zhǎng)的吸光率的比(A429/A554)為11.05。b.在金滴電極上固定鋅取代細(xì)胞色素b562以及光電流測(cè)量具有2mm直徑的金滴電極形成為金電極11。用熱濃硫酸(120°C )洗滌金滴電極，并且通過(guò)在硫酸中的氧化還原循環(huán)處理來(lái)粗糙化金滴電極的表面(形成更不規(guī)則表面)。在室溫下將金滴電極浸入0. ImM 11-氨基十一硫醇(H2N-C11-SH)/乙醇溶液中至少16個(gè)小時(shí)，以形成H2N-C11-SH膜作為金滴電極表面上的自組單分子層13。用壓縮空氣干燥具有H2N-C11-SH膜的金滴電極，并且在50 μ M鋅取代細(xì)胞色素b562/4. 4mM磷酸鉀(pH 7.2)溶液(60 μ L)中浸泡后，在4°C下培養(yǎng)一晝夜。使用Ag/AgCl作為參考電極以及Pt網(wǎng)狀(mesh)電極作為對(duì)電極，在以氮凈化的 IOmM磷酸鈉(pH 7.0)中測(cè)量光電流。圖7示出了在300mV、0mV和"SOOmV的偏壓下測(cè)量的光電流(光電流實(shí)時(shí)波形)。 在圖7中，用420nm波長(zhǎng)的光照射30秒、然后停止照射10秒時(shí)相對(duì)時(shí)間繪制電流值。如圖7 所示，在該偏壓范圍中觀察的光電流都是陰極的(cathodic)。圖8示出了光電流作用光譜。 如圖8所示，峰電流波長(zhǎng)是418nm至420nm、550nm和586nm,明顯不同于圖6所示的鋅取代細(xì)胞色素b562溶液紫外可見(jiàn)吸收光譜中的吸收最大波長(zhǎng)429nm、554nm和593nm。在418nm至420nm波長(zhǎng)的光電流與在550nm波長(zhǎng)的光電流之比是3. 7，該值遠(yuǎn)小于圖6的吸收光譜中的光電流比11. 05。圖9示出了相對(duì)電勢(shì)E繪制的在420納米波長(zhǎng)的光電流值。在圖9中， 電流電壓曲線上的數(shù)字表示數(shù)據(jù)獲取的次序。根據(jù)JP-A-2007-220445，對(duì)于金電極上固定的鋅取代細(xì)胞色素c，在WOmVGs Ag/AgCl)附近出現(xiàn)閾值，并且在該電位出現(xiàn)光電流的反轉(zhuǎn)。然而，這在圖9中所示的鋅取代細(xì)胞色素b562中并未看到。而且，與JP-A-2007-220445 中不同，添加亞鐵氰化鉀不會(huì)增強(qiáng)光電流。[實(shí)施例3]a.鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的制備以與實(shí)施例2中相同的方式獲得脫血紅素細(xì)胞色素b562。根據(jù)Mennenga, A. , Gartner, ff. , Lubitz, ff. and Gorner, H. Phys. Chem. Chem. Phys. 8,5444(2006)合成鋅二氫卟吩(ZnCe6,圖 10)。25mM 甘氨酸和 50mM 氯化鈉(pHIO ； 下文中稱作“緩沖液A”)用作化合物溶解緩沖液。制備IOmM 二氫卟吩e6 (50 μ L)、緩沖液 A (45 μ L)和IOOmM無(wú)水醋酸鋅(5 μ L)的混合物，并在冰中培養(yǎng)至少30分鐘(就ZnCe6而言500nmol)。深綠溶液變?yōu)榱辆G。然后,將等量的55. 6μ M脫血紅素細(xì)胞色素b562添加到溶液(脫血紅素細(xì)胞色素 b562 5. I nmol)，并且將混合物在冰中培養(yǎng)至少30分鐘。然后將混合物裝填到Econo-Pac IODG 脫鹽柱(Biorad)，并且用 pH 7. 2 的 50mMKPi 和 IOOmM KCl 洗脫。pH 7. 2 的 500mM KPi 和IOOmM KCl用作緩沖液。收集IiL部分的餾分，并在280nm、412nm和634nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光率。圖11示出了洗脫模式。如圖11中所示，在底部曲線中觀察到兩個(gè)單獨(dú)的帶。色素吸收也出現(xiàn)在第一蛋白質(zhì)餾分中(4mL至SmL的洗脫體積)。IOmL以上的洗脫體積由色素引起。在鋅存在的情況下色素吸收并不出現(xiàn)在蛋白質(zhì)餾分中。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)于色素的結(jié)合，鋅和細(xì)胞色素b562之間的配位鍵很重要。在鋅膽綠素b562的制備中也觀察到該趨勢(shì)。圖12示出了純化的鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的吸收光譜。對(duì)浸潰在IOmM NaPi (pH 7.0)緩沖液中的鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562進(jìn)行測(cè)量。如圖12中所示，吸收峰出現(xiàn)在425nm 和641nm波長(zhǎng)處。b.在金滴電極上固定鋅二氫P卜吩細(xì)胞色素b562和光電流測(cè)量具有2mm直徑的金電極形成為金電極11。用熱濃硫酸(120°C )洗滌金滴電極，并且通過(guò)在硫酸中的氧化還原循環(huán)處理來(lái)粗糙化金滴電極的表面(形成更不規(guī)則表面)。金滴電極被浸入O. ImM 11-氨基十一硫醇鹽酸鹽/乙醇溶液中，并且在室溫中培養(yǎng)至少16個(gè)小時(shí)。然后用乙醇沖洗金滴電極，并通過(guò)浸入50 μ M鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562/4. 4mM KPi (pH 7. 2)溶液(60 μ L)中在4°C中培養(yǎng)一晝夜。除了鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極之外，也制備僅僅將其浸入在鋅二氫卟吩(ZnCe6)和二氫卟吩(Ce6)中的金滴電極。使用Ag/AgCl作為參考電極以及Pt網(wǎng)狀電極作為對(duì)電極，在用氮凈化的IOmM磷酸鈉(pH 7.0)中測(cè)量光電流。圖13示出了 200mV至· · 200mV的偏壓處的光電流作用光譜。對(duì)浸潰在IOmM NaPi (pH 7.0)緩沖液中的鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極進(jìn)行測(cè)量。如圖13 所示，在鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極中觀察到陰極光電流。除了藍(lán)色帶的420nm,在紅色帶的636nm處也觀察到電流響應(yīng)。這是世界第一例在鋅卩卜啉蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件中觀察到紅光響應(yīng)光電流。圖14比較鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極與僅僅固定鋅二氫卟吩 (ZnCe6)和僅僅固定二氫卟吩(Ce6)的金滴電極之間的光電流作用光譜。偏壓是· · 200mV vs Ag/AgCl。如圖14所示，與鋅二氫卟吩固定化金滴電極的光譜相比，鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極的光電流作用光譜朝紅色偏移(紅色偏移)了大約2nm。而且，在 460nm波長(zhǎng)附近的膨脹沒(méi)有出現(xiàn)在鋅二氫卟吩固定化金滴電極的光譜中。因此，認(rèn)為對(duì)于鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562和鋅二氫卟吩,色素的周?chē)h(huán)境是不同的。對(duì)于鋅二氫卟吩固定化金滴電極的光電流量大于對(duì)于鋅二氫B卜吩細(xì)胞色素b562固定化金滴電極的光電流量。這被認(rèn)為是因?yàn)榻鸬坞姌O對(duì)鋅二氫卟吩的吸附大于對(duì)鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562的吸附。圖15是示出了相對(duì)電勢(shì)E繪制的在420nm和636nm的光電流值的圖。如圖15所示，即使在施加正電壓的情況下也觀察不到陽(yáng)極電流。圖15所示的電流電壓曲線顯示出二極管狀行為。對(duì)于鋅二氫卟吩固定化金滴電極和二氫卟吩固定化金滴電極也觀察到相同的趨勢(shì)。在實(shí)施例2的鋅取代細(xì)胞色素b562固定化金滴電極中也觀察到該趨勢(shì)(參見(jiàn)圖9)。[實(shí)施例4]a.細(xì)胞色素b562的色氨酸和半胱氨酸變體的制備使用QuickChange Lightning Site 定向突變?cè)噭┖?Stratagene),將實(shí)施例 I 的表達(dá)質(zhì)粒和下面的引物(劃線部分為突變位點(diǎn))用于制備I17W/H63N(從異亮氨酸17變?yōu)樯彼幔约皬慕M氨酸63變?yōu)樘於０?變體和I17C/H63N (從異亮氨酸17變?yōu)榘腚装彼?，以及從組氨酸63變?yōu)樘於０?變體質(zhì)粒。注意H63N突變是為了避免在鋅卟啉重構(gòu)期間鋒卩卜啉與組氨酸形成配位鍵(參見(jiàn)Mennenga, A. , Gartner, ff. , Lubitz, ff. and Gorner,
H.Phys. Chem. Chem. Phys. 8,5444(2006))。除了異亮氨酸17外的氨基酸殘基可被變?yōu)樯彼?。I17ff_sen :5'-CAATTTAAAAGTGTGGGAAAAAGCGGATAAC-3/
I17ff_an s:5,-CCGCTTTTTCCCACACTTTTAAATTGTCGTTGAGG-3
I17C_sen :5'-CAATTTAAAAGTGTGCGAAAAAGCGGATAAC-3/
I17C_an s:5,-CCGCTTTTTCGCACACTTTTAAATTGTCGTTGAGG-3
H63N_sen :5'-GATTTCCGCAACGGTTTCGACATTCTG-3'
H63N_an s:5,-GTCGAAACCGTTGCGGAAATCTTTC-3’這些質(zhì)粒可轉(zhuǎn)化為大腸桿菌JM109，并且在實(shí)施例I的培養(yǎng)以及表達(dá)和純化步驟之后，制備細(xì)胞色素b562_117W/H63N和細(xì)胞色素b562_117C/H63N。b.導(dǎo)入醌的脫血紅素細(xì)胞色素b562變體的制備使用如實(shí)施例2中的酸-丁酮法將純化的細(xì)胞色素b562_I17C/H63N脫血紅素 (deheme)，并且用超純水(2LX3 次)、lmM DTT(2LX I 次)、ImM醋酸鈉(pH 5.0)以及 IOOmM KC1(2LX1次)透析以制備脫輔基蛋白。然后以5倍摩爾量將對(duì)苯醌(BQ)或2，3_ 二甲氧基-5-甲基對(duì)苯醌(CoQ)添加到脫輔基蛋白，并在室溫下將混合物載50mM磷酸鈉(pH 7.0)中培養(yǎng)30分鐘。用ImM磷酸鈉 (pH 7. O) (1LX2次)和超純水(1LX I次)透析反應(yīng)溶液以制備醌改性的產(chǎn)品。BQ和CoQ 產(chǎn)品分別為淺洋紅和淺黃。
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關(guān)于該方法，報(bào)道了醌結(jié)合到游離半胱氨酸殘基，如圖17的右側(cè)所示(下文中描述)。認(rèn)為醌結(jié)合到半胱氨酸17，在該蛋白質(zhì)中存在的唯一半胱氨酸。 c.鋅取代細(xì)胞色素b562_117C/H63N的制備以導(dǎo)入醌的脫輔基蛋白的2. 2至2. 5倍量將鋅卟啉(ZnPP)添加到導(dǎo)入醌的脫輔基蛋白，并且使用 Bio-rad EconoPaclO DG 脫鹽柱(50mM Tris-HCl (pH 8. O)和 O. ImM EDTA 用作緩沖液)來(lái)收集蛋白質(zhì)餾分。圖16示出了鋅取代細(xì)胞色素b562_I17C/H63N的吸收光譜。在圖16的右上方插入的是野生型(WT)的吸收光譜。d.在金滴電極上固定鋅取代細(xì)胞色素b562變體和光電流測(cè)量如同實(shí)施例I 一樣，使用11-氨基十一硫醇將如上獲得的鋅取代細(xì)胞色素13562_ I17C/H63N固定在金滴電極上。圖17是在金電極11 (金滴電極)上形成的自組單分子層 13上吸附的鋅取代細(xì)胞色素b562_I17C/H63N的示意圖。在圖17中，以棒狀模型示出氨基酸 17 (W，BQ, CoQ)和天冬酰胺63(H63N)。將光照射在鋅取代細(xì)胞色素b562_I17C/H63N固定化金滴電極上使得電子(e_)朝向分子表面躍出電極，如虛線所指示。圖17還示出了色氨酸 (Trp)、連接至半胱酰胺(Cys)的對(duì)苯醌(BQ)以及連接至半胱酰胺的2，3-二甲氧基-5-甲基對(duì)苯醌(CoQ)的結(jié)構(gòu)。使用Ag/AgCl作為參考電極以及Pt網(wǎng)狀電極作為對(duì)電極，在用氮凈化的IOmM磷酸鈉(pH 7.0)中測(cè)量光電流。圖18示出了固定鋅取代細(xì)胞色素b562_I17C/H63N(X = CoQ, W，BQ)和野生型鋅取代細(xì)胞色素b562的金滴電極的光電流作用光譜。偏壓是· · 300πιν vs Ag/AgCl。如圖18 所示，在生成的陰極電流中I17W、I17CoQ和I17BQ變體的光電流是野生型的光電流的2至 3倍。因此，認(rèn)為這些變體殘基增加了光電流。圖19示出了相對(duì)電勢(shì)E繪制的420nm波長(zhǎng)下光電流值的圖。在圖19中，電流電壓曲線上的數(shù)字表示獲取數(shù)據(jù)的次序。Shih, C. , Museth, A. K. , Abrahamsson, M. , Blanco-Rodriguez, A. M. , Bilio, A. J.D. and 8 others, Science, 320,1760 (2008)報(bào)道了通過(guò)將色氨酸導(dǎo)入以錸絡(luò)合物改性的銅蛋白質(zhì)和天青蛋白(2170. pdb)，錸銅電子轉(zhuǎn)移速度提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。然而，在該公開(kāi)中，色氨酸被設(shè)置在蛋白質(zhì)分子的表面上。另一方面，實(shí)施例4為在世界上第一次報(bào)道導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子中的色氨酸提高了光電流。在實(shí)驗(yàn)中使用金滴電極獲得的50nA至80nA的光電流值相當(dāng)于大約是 JP-A-2007-220445中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所獲得的光電流值的50至80倍的值。圖20示出了在300mV的偏壓下(vs Ag/AgCl)，鋅取代細(xì)胞色素b562_I17X/H63N固定化金滴電極的測(cè)得的光電流(光電流實(shí)時(shí)波形)，以及僅僅固定野生型鋅取代細(xì)胞色素 b562和僅僅固定ZnPP的金滴電極的測(cè)得的光電流。作為緩沖液，使用IOmM磷酸鈉(pH7. O)。 在圖20中，在用具有420nm波長(zhǎng)的光照射30秒、然后停止照射10秒的方式，相對(duì)時(shí)間繪制電流值。如圖20所示，與生成陰極光電流(雖然小)的鋅取代細(xì)胞色素b562_I17X/H63N固定化金滴電極相比，ZnPP固定化金滴電極沒(méi)有生成任何陰極光電流。圖21示出了在OmV(vs Ag/AgCl)偏壓下，鋅取代細(xì)胞色素b562_I17X/H63N固定化金滴電極的光電流作用光譜，以及僅固定野生型鋅取代細(xì)胞色素b562或ZnPP的金滴電極的光電流作用光譜。作為緩沖液，使用IOmM磷酸鈉(pH 7.0)。如圖21中所示，對(duì)于單獨(dú)的 ZnPP和鋅取代細(xì)胞色素b562_117X/H63N中的內(nèi)含物，光電流作用光譜是不同的。由此，可以說(shuō)在圖18中觀察到的光電流來(lái)源于蛋白質(zhì)。[甲基紫精在通過(guò)鋅取代細(xì)胞色素b562產(chǎn)生光電流中的效果]根據(jù)JP-A-2007-220445，將中介物(mediator)氰亞鐵酸鹽/氰鐵酸鹽(E0 =360mV vs NHE)添加到鋅取代細(xì)胞色素c固定化電極增強(qiáng)了光電流。光致輻照 (photoirradiation)激發(fā)卩卜啉電子,并且與光致激發(fā)關(guān)聯(lián)的分子軌道(4個(gè)Gourterman軌道)的兩個(gè)占用的軌道(卟啉Π軌道和鋅-硫Π結(jié)合軌道的雜化)中生成空穴?？昭◤?qiáng)烈地與位于蛋白質(zhì)的外殼氨基酸上的分子軌道耦合，并且在色素上生成的空穴移動(dòng)到蛋白質(zhì)外殼(溶液側(cè))。由此，該公開(kāi)提出了一種模型，其中氰亞鐵酸鹽/氰鐵酸鹽填充空穴。然而，在使用鋅取代細(xì)胞色素b562的一系列實(shí)驗(yàn)中添加氰亞鐵酸鹽/氰鐵酸鹽對(duì)光電流并沒(méi)有影響。事實(shí)上，從鋅取代細(xì)胞色素b562固定化電極僅僅觀察到陰極光電流。而且，根據(jù)二極管狀行為認(rèn)為，激發(fā)的電子朝分子表面移動(dòng)。為了對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，根據(jù) Yasutomi, S. , Morita, T. , Imanishi, Y. and Kimura, S. Science, 304,1944 (2004),通過(guò)添加具有激發(fā)電子增強(qiáng)效果的甲基紫精(EO = -440mV vs NHE)來(lái)測(cè)量光電流。圖22示出了甲基紫精(MV)在固定野生型鋅取代細(xì)胞色素b562的金滴電極生成光電流的效果。圖23示出了甲基紫精在固定鋅取代細(xì)胞色素b562_I17W/H63N的金滴電極生成光電流的效果。在圖22和23中，水平軸(偏壓)和豎直軸(420nm波長(zhǎng)下的光電流值) 被反轉(zhuǎn)以幫助了解增加的陰極光電流。如圖22和23所示，添加甲基紫精增加了野生型以及色氨酸突變體中的光電流量。由此，鋅取代細(xì)胞色素b562光電流很可能來(lái)源于激發(fā)電子的移動(dòng)，而不是空穴移動(dòng)。該現(xiàn)象也可以通過(guò)鋅取代細(xì)胞色素b562的全電子計(jì)算來(lái)解釋。[色氨酸突變體細(xì)胞色素b562的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析]將細(xì)胞色素b562_I17W/H63N 溶液(IOmM 醋酸鈉，pH 5. O ；30mg/mL)與等量的 O. IM Bis-Tris (pH 6. 5)、以及45%聚(丙二醇)P400 (索引-58 (Index-58))混合，并且使用坐滴蒸汽擴(kuò)散(sitting drop vapor diffusion)技術(shù)和懸滴蒸汽擴(kuò)散(hanging drop vapor diffusion)技術(shù)將混合物在20°C培養(yǎng)兩天。結(jié)果，獲得細(xì)胞色素b562_I17W/H63N晶體，如圖24所示。圖24中箭頭之間的長(zhǎng)度是O. 1mm。晶體是空間群Pl的孿晶，并且以2.53 A分辨率獲得衍射數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)值在表I中示出。表I :_Cyt b562 I17W/H63N
數(shù)據(jù)匯集_
空間群 a, b, c (A) α，β, γ(°)
孿晶分?jǐn)?shù)(Twin fractions )
分辨率(A)
冗余
完整性(％)
Rmerge (%)
Ι/σΙ_分辨率(A)20.0-2.53
反射數(shù)21,554
R/Rfree25.8/29.2
原子數(shù)
蛋白質(zhì)5061
異質(zhì)(Hetero)258
水28 平均β因子
蛋白質(zhì)29.3
異質(zhì)26.8
水27.3 均方根偏差
鍵長(zhǎng)(A)0.010
鍵角_1.139括號(hào)內(nèi)的數(shù)字是高分辨率單元(cell)的統(tǒng)計(jì)值僅使用野生型細(xì)胞色素b562 (256B.pdb)的結(jié)構(gòu)中的鏈A(血紅色素除外的異質(zhì)分子(heteiOmolecule，非主要分子)，二聚物中的鏈B的刪除的坐標(biāo)數(shù)據(jù))作為模板，用程序 Molrep/CCP4來(lái)實(shí)現(xiàn)分子置換。如圖25所示，細(xì)胞色素b562_I17W/H63N結(jié)晶的每個(gè)晶胞包含六個(gè)分子。圖26是細(xì)胞色素b562_I17W/H63N中色氨酸17附近結(jié)構(gòu)的立體圖，示出了晶胞的所有六個(gè)分子彼此重疊。色氨酸17(Trpl7)側(cè)鏈的取向?qū)τ谒蟹肿邮窍嗤?。程序Refmac5/CCP4 用于剛體(Rigidbody)—限制(Restrained) — TLS 精修(TLS refinement)(全部使用基于振幅的孿晶精修(amplitude based twin refinement)),并且用Coot構(gòu)建手動(dòng)模型。結(jié)合I17W和H63N突變體。詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)值在表I中示出。圖27是比較細(xì)胞色素b562_I17W/H63N和野生型細(xì)胞色素b562之間A鏈(晶胞的六個(gè)分子之一)的示圖。圖28是比較細(xì)胞色素b562_I17W/H63N和野生型細(xì)胞色素b562之間C 鏈(晶胞的六個(gè)分子之一)的示圖。在圖27和28中，以棒狀模型示出血紅素和色氨酸17。 如圖27和28所示，細(xì)胞色素b562_I17W/H63N的全部結(jié)構(gòu)保持了野生型細(xì)胞色素b562的4螺旋束結(jié)構(gòu)。在圖27和28中，色氨酸17對(duì)面的螺旋IV被朝向分子的外側(cè)(虛箭頭)推開(kāi)。 在野生型細(xì)胞色素b562和細(xì)胞色素b562_I17W/H63N之間，氨基酸α碳的r.m. s(均方根)偏
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，包括金電極；和固定在所述金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562或所述鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體以其包含的卟啉丙酸面向所述金電極的取向而被固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其中，具有Π電子的氧化還原活性基團(tuán)被導(dǎo)入到所述金屬取代細(xì)胞色素b562或所述鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其中，所述氧化還原活性基團(tuán)是色氨酸或醌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562是鋅取代細(xì)胞色素b562。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562的金屬選自鋅(Zn)、鈹(Be)、鍶(Sr)、鈮(Nb)、鋇(Ba)、镥(Lu)、鉿(Hf)、鉭(Ta)Jg (Cd)、銻 (Sb)、釷(Th)和鉛(Pb)。
7.一種光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，包括蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件，所述器件包括金電極；和固定在所述金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體以其包含的卟啉丙酸面向所述金電極的取向而被固定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，其中，具有Π電子的氧化還原活性基團(tuán)被導(dǎo)入到所述金屬取代細(xì)胞色素b562或所述鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，其中，所述氧化還原活性基團(tuán)是色氨酸或醌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562是鋅取代細(xì)胞色素b562。
12.一種用于制造蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件的方法，所述方法包括將金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體固定在金電極上。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體以其包含的卟啉丙酸面向所述金電極的取向而被固定。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，具有Π電子的氧化還原活性基團(tuán)被導(dǎo)入到所述金屬取代細(xì)胞色素b562或所述鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述氧化還原活性基團(tuán)是色氨酸或醌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述金屬取代細(xì)胞色素b562是鋅取代細(xì)胞色素V)u562°
17.—種用于制造光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的方法,所述方法包括將金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體固定在金電極上。
18.—種蛋白質(zhì)固定化電極,包括金電極；和固定在所述金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或它們的衍生物或變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和蛋白質(zhì)固定化電極。該蛋白質(zhì)光電轉(zhuǎn)換器件包括金電極；和固定在該金電極上的金屬取代細(xì)胞色素b562或鋅二氫卟吩細(xì)胞色素b562或其衍生物或變體。
文檔編號(hào)H01G9/20GK102593361SQ20121000222
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者中丸啟, 后藤義夫, 山田齊爾, 戶木田裕一, 羅瑋 申請(qǐng)人:索尼公司