專利名稱：納豆芽孢桿菌nt-6菌株生產的復合抗菌肽及其生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種納豆芽孢桿菌NT-6菌株生產的復合抗菌肽及其方法，屬于生物技術領域。該方法生產的抗菌脂肽具有廣譜的抗菌活性和生物表面活性，在醫(yī)藥、農業(yè)、食品和環(huán)境治理等領域有廣泛的應用前景。
背景技術：
細菌性豆豉(在日本稱為納豆)在中國是一種非常普遍的富含風味物質的大豆發(fā)酵食品，已有2000多年的歷史。其發(fā)酵菌株是納豆芽孢桿菌(feciBm natto)。納豆芽孢桿菌能產生許多功能因子，使發(fā)酵產品對人體具有許多有益功能。目前，國內外針對納豆菌的研究，主要集中在具有溶栓作用的代謝產物納豆激酶。而其產生的抗菌作用，近些年來才受到人們重視。據文獻報道，納豆菌對細菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙門氏菌、傷寒菌、痢疾菌及大腸桿菌等致病菌的作用，其抗菌譜較廣，而且具有一定的耐熱性(鐘青萍等，食品科學，2002，23 (10) 109- 112)。盡管對納豆菌的抗菌性已有一些研究報道，但對其產生的抗菌物質多沒有明確的研究報告。有研究者認為產生的抗菌物質是2，6-吡啶羧酸，也有人認為是多粘菌素或桿菌肽或抗菌蛋白，但沒有鑒定的資料(紀寧等，食品研究與開發(fā)，2006，27 (1): 138-142);曹小紅等對feciB^s natto TK-I菌株產生的抗菌物質進行了研究，發(fā)現了一種有抗菌活性的分子量為1036Da的脂肪酸鏈上有15 個碳的環(huán)狀脂肽surfactin (曹小紅等，中國生物工程志，2009，29 (2) :54-58).除此之外未見其它相關納豆菌抗菌物質的鑒定文獻，特別是未見一種菌株同時產生二十多種抗菌脂肽同系物的文獻報道。抗菌脂肽具有生物表面活性和廣譜的抗菌活性，對細菌、真菌、原蟲和癌細胞具有很強的殺傷作用，在醫(yī)藥、農業(yè)、食品及化妝品、石油開采和環(huán)境治理等領域有重要的應用前景。特別是由于抗菌脂肽具有無毒、無殘留、不產生耐藥性的特點，符合當今綠色安全食品生產的要求，在食品防腐、飼料添加劑、動物防病和農業(yè)生物防治等領域受到廣泛的關注。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的是利用納豆芽孢桿菌{Bacillus natto)通過深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵及下游工藝生產一種復合抗菌脂肽，此抗菌肽具有廣譜的抗菌活性、PH適應范圍廣、耐熱性能好、安全，可作為食品防腐劑、飼料添加劑、農用生物防治劑、動物防病劑和環(huán)境治理劑等。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案是
1.本發(fā)明利用納豆芽孢桿菌(feciBm /^ ο) NT-6菌株產生的抗菌肽，特征如下 該抗菌肽主要含有三組抗菌物質，它們的分子量分別為一組10432、1057.2、 1071. 0,1071. 0 ； 二組1491. 7、1492. 5、1505. 7、1519. 7 ；三組994. 3、1009. 0、1008. 8、 1009.9,1008. 7,1022.7,1022.6,1036.8,1036.5,1036. 6,1051. 8,1050. 6,1051. 2,1051. 6、1065.8,1080.2 (LC-MS圖譜見附圖1)。該抗菌肽為抗菌脂肽類物質，由一系列同系物組成，第一組物質為iturin系列，第二組物質為fengycin系列，第三組為surfactin系列；它們的比例分別是10 20%、25 35%和5(Γ60% ；純品為黃色粘稠物；在水中溶解性好；能耐受 IOO0C 30min的加熱；在pH 2_12活性不喪失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有較高安全性；有廣譜的抗菌活性，它對食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血鏈球菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌、大腸桿菌0157、單增李斯特氏菌、沙門氏菌等具有很好的抑制作用；對食品腐敗細菌，如藤黃微球菌、大腸埃希氏桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、腸膜明串珠菌等，食品腐敗霉菌， 如黑曲霉、米曲霉、少根根霉、青霉、鐮孢菌、黃曲霉等抑制作用較好；對許多植物致病菌，如擴展青霉、點青霉、稻瘟病菌、水稻紋枯病、小麥紋枯病菌、八角炭疽病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等顯示了很強的抑制作用；對動物致病菌，如豬腸炎沙門氏菌、溶血性大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、水霉、鰓霉、鏈弧菌等也有較好的抑制作用。 2.本發(fā)明生產上述復合抗菌肽是通過以下方法實現的
該方法采用的生產菌株為納豆芽孢桿菌feciBm natto NT-6菌株，16SrRNA基因序列 GenBank 登錄號為 JN180628 ； 所用培養(yǎng)基的組成為
1)種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨8.(Tl2.0g，酵母膏3.0 8.0g，NaCl3.0 7.0g，水 IOOOmL, ρΗ7· 0 7· 5 ；
2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基-1:葡萄糖8.(Tl2.0g，谷氨酸鈉3.(T7.0g，MgS04 0. 3 0. 7g, KCl 0. 3 0. 7g, KH2PO4 0. 8 1. 2g, FeSO4 0. 10 0· 20mg, MnSO4 3. 0 7· Omg, CuSO4 0. 15 0· 18mg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5 7· 0;或培養(yǎng)基-2:葡萄糖 8 12g，土豆 80 120g，水 IOOOmL ；
3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基稻殼或甘蔗渣5(T80g，麩皮15 25g，谷氨酸鈉;T7g，葡萄糖 3 7g，水 150mL ；
方法一將納豆芽孢桿菌mcillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴
大培養(yǎng)，接種量為種子培養(yǎng)基體積的洲，28 35°C，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵30 48 h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調整pH到2，靜置后離心， 沉淀用甲醇或乙醇進一步提取，提取物經賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；
方法二將納豆芽孢桿菌iBacillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴
大培養(yǎng)，接種量為種子培養(yǎng)基體積的洲，28 35°C，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵30 48 h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后將上清液濃縮，經甲醇或乙醇提取后，濃縮干燥，經賦型劑吸附、得抗菌肽成品；
方法三將納豆芽孢桿菌iBacillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴
大培養(yǎng)，接種量為種子培養(yǎng)基體積的2%，觀 35°C，在液體培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵 30 48 h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后將上清液濃縮，賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品； 方法四將納豆芽孢桿菌^Bacillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴
大培養(yǎng)，將5-10%接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，在觀 37°C的條件下培養(yǎng)2 4天后，再經甲醇或乙醇提取后，干燥，賦型劑吸附，混勻，得抗菌肽成品；或發(fā)酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。上述的復合抗菌肽在食品防腐、飼料添加劑、醫(yī)藥和農用生物防治等方面的應用。本發(fā)明的主要優(yōu)點和積極效果如下
1.本發(fā)明首次利用納豆芽孢桿菌mcillus natto)生產抗菌肽，用于食品防腐和動物飼料添加劑、農用生物防治劑、動物防病劑等。目前實踐中應用的天然抗菌肽如Msin、天蠶素、爪蟾素(magainins)等，其抗菌譜和pH適應范圍相對較窄，使用范圍受到一定限制。 而本發(fā)明的復合抗菌肽抗菌譜廣(對多株革蘭氏陰性、陽性細菌和霉菌有明顯的抑制作用， 其中包括食源性致病菌、食品腐敗菌、植物病原菌和動物病原菌等。)，在PH 2-12活性不喪失，因此，其適應范圍較現使用的抗菌肽廣。該抗菌肽能耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解，在動物消化道內仍能保持活性；且在100°C條件下加熱30min活性不喪失，顯示了能耐受食品加工及飼料制粒的高溫處理的優(yōu)越性。2.納豆芽孢桿菌來源于食品，且其產生的抗菌肽經小鼠口服毒性試驗證實無毒， 因此，在實際使用中具有極高的安全性。目前科學家經過實驗證實，抗菌肽作為一種新型的食品防腐劑、飼料添加劑、農用生物防治劑和動物防病劑，具有無毒、無殘留、不產生耐藥性的特點，符合當今綠色安全食品生產及對環(huán)境友好的要求。3.本發(fā)明采用納豆菌生產抗菌肽，可大規(guī)模工業(yè)化生產，生產周期短，且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響，相對于動物來源的抗菌肽具有明顯優(yōu)勢。4.本發(fā)明方法簡便，成本低。


圖1NT-6菌株發(fā)酵提取物的LC-MS離子流譜圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1
通過種子的擴大培養(yǎng)，再于發(fā)酵罐28 35°C，進行液體深層發(fā)酵30 48h，積累抗菌代謝產物，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調整pH到2，靜置后離心，沉淀用3-5倍甲醇或乙醇進一步提取，提取物經賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品，通過高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。實施例2
納豆芽孢桿菌(Bacillus菌株通過上述種子培養(yǎng)基的擴大培養(yǎng)后，于發(fā)酵
罐在上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵觀 35°C，積累抗菌代謝產物30 48h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后上清液經濃縮、干燥，得抗菌肽成品，通過高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。實施例3
納豆芽孢桿菌(Bacillus菌株通過上述種子培養(yǎng)基的擴大培養(yǎng)后，于發(fā)酵
罐在上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵觀 35°C，積累抗菌代謝產物30 48h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后上清液經濃縮、3-5倍甲醇提取、干燥，得抗菌肽成品，通過高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于500g/kg。實施例4
納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)m-&菌株通過種子的擴大培養(yǎng)，5_10%接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經觀 37°C的培養(yǎng)2 4天后，經甲醇提取后，干燥，賦型劑吸附，混勻，得抗菌肽成品，通過高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于100g/kg。實施例5
納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)m-&菌株通過種子的擴大培養(yǎng)，5_10%接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，經觀 37°C的培養(yǎng)2 4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品，通過高效液相色譜測定，抗菌肽含量不小于5g/kg，可用于動物飼料添加劑。
權利要求
1.納豆芽孢桿菌NT-6菌株生產的復合抗菌肽，其特征在于該復合抗菌肽是由 iturins、fengycins和surfactins三類抗菌脂肽同系物的混合物組成，它們的比例分別是10 20%、25 35%和50 60% ；其中iturins同系物分子量分別為10432、1057. 2、1071. 0、 1071. 0 ；Fengycins 同系物分子量分別為1491. 7、1492. 5、1505. 7、1519. 7 ；Surfactins 同系物分子量分別為:994. 3、1009. 0、1008. 8、1009. 9、1008. 7、1022. 7、1022. 6、1036. 8、 1036. 5,1036. 6,1051. 8,1050. 6,1051. 2,1051. 6,1065. 8,1080. 2 道爾頓(Da)，該復合抗菌肽為黃色粘稠物，水溶性好；能耐受100°c 30min的加熱；在PH 2 12活性不喪失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有較高安全性；能抑制多種革蘭氏陽性、陰性致病或腐敗細菌，尤其對霉菌具有良好的抑制作用。
2.納豆芽孢桿菌NT-6菌株生產的復合抗菌肽的生產方法，其特征在于該方法采用的生產菌株為納豆芽孢桿菌徹以natto NT-6菌株，16SrRNA基因序列GenBank登錄號為 JN180628 ；所用培養(yǎng)基的組成為1)種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨8.(Tl2.0g，酵母膏3.0 8.0g，NaCl3.0 7.0g，水 IOOOmL, ρΗ7· 0 7· 5 ；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基-1:葡萄糖8.(Tl2.0g，谷氨酸鈉3.(T7.0g，MgS04 0. 3 0. 7g, KCl 0. 3 0. 7g, KH2PO4 0. 8 1. 2g, FeSO4 0. 10 0· 20mg, MnSO4 3. 0 7· Omg, CuSO4 0. 15 0· 18mg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5 7· 0;或培養(yǎng)基-2:葡萄糖 8 12g，土豆 80 120g，水 IOOOmL ；3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基稻殼或甘蔗渣5(T80g，麩皮15 25g，谷氨酸鈉;T7g，葡萄糖 3 7g，水 150mL ；方法一將納豆芽孢桿菌mcillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴大培養(yǎng)，接種量為種子培養(yǎng)基體積的洲，28 35°C，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵30 48 h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調整pH到2，靜置后離心， 沉淀用甲醇或乙醇進一步提取，提取物經賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法二將納豆芽孢桿菌iBacillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴大培養(yǎng)，接種量為種子培養(yǎng)基體積的洲，28 35°C，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵30 48 h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后將上清液濃縮，經甲醇或乙醇提取后，濃縮干燥，經賦型劑吸附、得抗菌肽成品；方法三將納豆芽孢桿菌iBacillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴大培養(yǎng)，接種量為種子培養(yǎng)基體積的2%，觀 35°C，在液體培養(yǎng)基中進行液體深層發(fā)酵 30 48 h，發(fā)酵液經離心去除菌體，然后將上清液濃縮，賦型劑吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法四將納豆芽孢桿菌^Bacillus菌株通過種子培養(yǎng)基進行種子的擴大培養(yǎng)，將5-10%接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，在觀 37°C的條件下培養(yǎng)2 4天后，再經甲醇或乙醇提取后，干燥，賦型劑吸附，混勻，得抗菌肽成品；或發(fā)酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。
3.根據權利要求1所述的納豆芽孢桿菌NT-6菌株生產的復合抗菌肽，其特征在于所述的復合抗菌肽在食品防腐、飼料添加劑、醫(yī)藥和農用生物防治等方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納豆芽孢桿菌產生的復合抗菌肽及其生產方法，該復合抗菌肽產品為抗菌脂肽類物質iturins、fengycins和surfactins三類同系物的混合物，它們的比例分別是10~20%、25~35%和50~60%；該抗菌肽純品為黃色粘稠物，能耐受100℃30min的加熱，在pH2-12活性不喪失，對細菌、真菌具有廣譜的抗菌活性，對原蟲和癌細胞也具有強烈的殺傷作用，實驗證實具有較高的安全性；本發(fā)明還公開了該復合抗菌肽的生產方法，用此法生產工藝簡單、成本相對較低，可作為食品防腐劑、飼料添加劑、農用生物防治劑、醫(yī)藥和動物防病劑等。
文檔編號A01P1/00GK102321182SQ20111028301
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權日2011年9月22日
發(fā)明者劉喚明, 孫力軍, 徐德峰, 王雅玲, 聶芳紅 申請人:廣東海洋大學