本發(fā)明屬于生物，涉及秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、高脂血癥是指血液中膽固醇和甘油三酯水平異常升高，被廣泛認(rèn)為是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。其發(fā)病通常伴隨代謝紊亂，主要受不良飲食習(xí)慣、遺傳因素和缺乏運(yùn)動(dòng)等影響。此外，高脂血癥常引發(fā)肥胖、腸道菌群失衡及脂質(zhì)代謝紊亂等并發(fā)癥。調(diào)節(jié)血脂水平已成為治療和預(yù)防高脂血癥的關(guān)鍵策略之一，尤其是針對因長期高脂高糖飲食導(dǎo)致的外周脂肪積累和胰島素抵抗的干預(yù)。這類飲食模式不僅會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，還會(huì)加劇脂質(zhì)代謝失衡，從而促進(jìn)代謝性疾病的發(fā)生。因此，降低高脂血癥的發(fā)生率具有重要的社會(huì)和健康價(jià)值。

2、藥食同源物品的降脂作用研究近年來發(fā)展迅速，部分藥食同源物品的降脂有效成分已被明確，而對于尚未明確有效成分的物品，研究通常集中在其提取物的作用上。在這些研究中，效能評估是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它不僅為活性物質(zhì)及藥物的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，還為功能性成分的篩選和作用機(jī)制的深入解析奠定了基礎(chǔ)。秀麗隱桿線蟲作為一種替代動(dòng)物模型，為傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物模型提供了快速且經(jīng)濟(jì)的研究優(yōu)勢，有望加速該領(lǐng)域的技術(shù)突破并促進(jìn)研究資源的高效利用。

3、秀麗隱桿線蟲是一種體型小、生命周期短且結(jié)構(gòu)簡單的模式生物，其透明體壁和高度組織化的特性便于利用熒光染料進(jìn)行精確的定位和成像分析。線蟲的腸道在脂質(zhì)合成與儲(chǔ)存方面功能類似于哺乳動(dòng)物的肝臟，是其代謝中心與免疫器官。目前，秀麗隱桿線蟲基因組已被全面測序，共識別出471個(gè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，與人類基因具有60％的同源性。因此，秀麗隱桿線蟲已成為研究脂代謝調(diào)控及相關(guān)疾病(如肥胖癥、阿爾茲海默癥和高脂血癥)的經(jīng)典模型之一。

4、然而，在基于秀麗隱桿線蟲的研究中，不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對活性物質(zhì)降脂作用的評估存在顯著差異。傳統(tǒng)方法通常從l1期培養(yǎng)至l4期后直接分析線蟲，其結(jié)果可能偏向發(fā)育期特性，難以全面反映成蟲期的生理狀態(tài)和活性物質(zhì)的長期作用效果。同時(shí)，短暫的培養(yǎng)周期可能忽略脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激的累積效應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，從l4期開始處理樣本容易錯(cuò)失早期干預(yù)窗口，使得活性物質(zhì)在脂質(zhì)代謝調(diào)控中的預(yù)防性作用難以觀察，并可能遺漏其對線蟲繁殖、代謝調(diào)控及衰老相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)影響。

5、因此，亟需一種改進(jìn)的模型構(gòu)建方法，以更全面地評估活性物質(zhì)的降脂效果并揭示其潛在機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過創(chuàng)新性地采用分階段培養(yǎng)策略，將秀麗隱桿線蟲暴露于高濃度葡萄糖環(huán)境下，模擬由脂質(zhì)過量積累引發(fā)的高脂血癥狀態(tài)；隨后，通過檢測經(jīng)膳食活性物質(zhì)或藥物處理后的線蟲體內(nèi)脂滴儲(chǔ)存水平、甘油三酯與游離脂肪酸含量，以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化，對活性物質(zhì)或藥物的降脂功效進(jìn)行精確評價(jià)；本發(fā)明構(gòu)建的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型具有穩(wěn)定性高、操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速篩選和驗(yàn)證活性物質(zhì)的降脂潛力。

2、為實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

4、s1.將同步化獲得的蟲卵置于不含大腸桿菌培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)9-12h，得到l1期秀麗隱桿線蟲；

5、s2.將l1期秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至含有大腸桿菌培養(yǎng)液和葡萄糖的培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)24h，直至線蟲發(fā)育至l4期，得到l4期秀麗隱桿線蟲；

6、s3.將l4期秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至含有fudr、大腸桿菌培養(yǎng)液和葡萄糖的培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)70-73h，得到成蟲期的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型。

7、優(yōu)選的，步驟s2和步驟s3中所述葡萄糖為d-無水葡萄糖，所述d-無水葡萄糖的濃度為40mm。

8、優(yōu)選的，步驟s2和步驟s3中所述大腸桿菌培養(yǎng)液為op50培養(yǎng)液，所述op50培養(yǎng)液的od600為0.4-0.6。

9、第二方面，本發(fā)明提供秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

10、s1.將同步化獲得的蟲卵置于不含op50大腸桿菌培養(yǎng)液的空培養(yǎng)基中，在20℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育9-12小時(shí)，得到l1期秀麗隱桿線蟲；

11、s2.將l1期秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至含有大腸桿菌培養(yǎng)液和葡萄糖的培養(yǎng)基中，在20℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，直至線蟲發(fā)育至l4期，得到l4期秀麗隱桿線蟲；

12、s3.將l4期秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至含有fudr、大腸桿菌培養(yǎng)液和葡萄糖的培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)72h，得到成蟲期的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型。

13、第三方面，提供秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型，所述秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型由本發(fā)明所述的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

14、第四方面，提供本發(fā)明所述的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型在用于評價(jià)活性物質(zhì)在治療或預(yù)防因脂肪積累引發(fā)的高脂血癥中的應(yīng)用。

15、優(yōu)選的，所述活性物質(zhì)為魚鰾肝素類粘多糖提取物，所述活性物質(zhì)的濃度為0.25-1mg/ml。

16、更優(yōu)選的，所述活性物質(zhì)為魚鰾肝素類粘多糖。

17、在本發(fā)明中，魚鰾肝素類粘多糖的結(jié)構(gòu)為：

18、[→4glcuaβ1→3galnac(4s)β1→]

19、在本發(fā)明中，魚鰾肝素類粘多糖是一種硫酸軟骨素a類似物，其制備方法參考專利cn112107590b中的實(shí)施例1。

20、優(yōu)選的，所述活性物質(zhì)的給藥方式為液體給藥方式。

21、優(yōu)選的，所述活性物質(zhì)能夠緩解由高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累，包括油紅o染色中脂滴密度的顯著降低，以及甘油三酯和游離脂肪酸含量的顯著下降。

22、優(yōu)選的，所述活性物質(zhì)能夠上調(diào)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

23、優(yōu)選的，所述脂質(zhì)代謝相關(guān)基因包括nhr-49基因、fat-5基因、fat-6基因和fat-7基因。

24、第五方面，提供本發(fā)明所述的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型在篩選具有降脂功效的候選物質(zhì)中的應(yīng)用。

25、第六方面，提供本發(fā)明所述的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型在用于評價(jià)藥物在治療或預(yù)防因脂肪積累引發(fā)的高脂血癥中的應(yīng)用。

26、現(xiàn)有技術(shù)有將l4期秀麗隱桿線蟲使用海藻糖培養(yǎng)，也有通過秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪染色觀察脂滴積累，但是這種培養(yǎng)方式可能存在以下問題：1)僅針對l4期處理，無法模擬脂質(zhì)積累從秀麗隱桿線蟲早期開始到成蟲期的完整病理過程，降低了模型對活性物質(zhì)長期作用的評估能力；2)主要通過秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪染色觀察脂滴積累，未全面評估秀麗隱桿線蟲肥胖模型的病理狀態(tài)及潛在機(jī)制，影響模型對活性物質(zhì)篩選的適用性；3)海藻糖是一種非還原性糖，需經(jīng)過海藻糖酶分解成葡萄糖才能被代謝利用；海藻糖的代謝速率較慢且易受秀麗隱桿線蟲體內(nèi)酶活性和環(huán)境條件(如溫度、菌液成分)影響，導(dǎo)致脂肪積累的程度波動(dòng)較大，影響模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；4)現(xiàn)有技術(shù)中多采用24孔板液體培養(yǎng)，首先，需要使用搖床進(jìn)行培養(yǎng)，操作繁瑣且增加實(shí)驗(yàn)誤差的可能性。其次，秀麗隱桿線蟲處于懸浮狀態(tài)，與外源物質(zhì)(如海藻糖、活性物質(zhì))的接觸不均勻，容易導(dǎo)致誘導(dǎo)效果不穩(wěn)定。

27、相對的，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：通過同步化培養(yǎng)，覆蓋從l1期到成蟲期的完整發(fā)育周期，確保線蟲的生理狀態(tài)一致性。采用分階段培養(yǎng)策略，確保脂質(zhì)積累誘導(dǎo)的漸進(jìn)性與生理狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化觀察。該模型穩(wěn)定性與動(dòng)態(tài)響應(yīng)能力，可用于多維度指標(biāo)評估，篩選和驗(yàn)證活性物質(zhì)的降脂作用，同時(shí)支持進(jìn)一步研究其機(jī)制。葡萄糖是細(xì)胞能量代謝的核心物質(zhì)，在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)主要通過糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)進(jìn)行代謝，產(chǎn)生atp供能。葡萄糖的代謝途徑穩(wěn)定、效率高，對外界環(huán)境(如溫度、菌液成分)的敏感性較低。因此，直接采用葡萄糖造模，有利于模型的可重復(fù)性和結(jié)果的可比性。此外，本發(fā)明采用固體培養(yǎng)基處理，能夠使外源物質(zhì)分布均勻且易于標(biāo)準(zhǔn)化，較好地模擬秀麗隱桿線蟲攝食行為和代謝狀態(tài)更加接近自然生理?xiàng)l件，具有操作簡單、成本低廉的特點(diǎn)。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具備下述的有益效果或優(yōu)點(diǎn)：

29、(1)本發(fā)明提出了一種基于分階段處理的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型構(gòu)建方法，為評估活性物質(zhì)或藥物的降脂作用提供了穩(wěn)定高效的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。相比僅將秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)至l4期的傳統(tǒng)方法，本發(fā)明通過覆蓋秀麗隱桿線蟲從l1期至成蟲期的完整發(fā)育周期，能夠全面反映其生理和生化狀態(tài)。本發(fā)明方法優(yōu)化了高脂血癥模型的構(gòu)建策略，兼顧早期誘導(dǎo)和長期觀察，有助于準(zhǔn)確評估活性物質(zhì)或藥物對脂質(zhì)代謝紊亂的預(yù)防性和持續(xù)性作用，為深入探討脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。

30、(2)通過油紅o染色實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明構(gòu)建的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型表現(xiàn)出顯著的脂肪積累特征，脂肪含量較正常組(空白組)上升了62.25％。進(jìn)一步的生化檢測表明，模型組甘油三酯和游離脂肪酸含量分別增加了163.97％和42.71％。分子層面分析顯示，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。上述結(jié)果表明，該方法成功誘導(dǎo)了秀麗隱桿線蟲的脂質(zhì)代謝紊亂，模擬了高脂血癥的病理狀態(tài)，進(jìn)一步驗(yàn)證了高脂血癥模型的成功構(gòu)建，為脂質(zhì)代謝研究及疾病機(jī)制探索提供了可靠的模型工具。

31、(3)利用構(gòu)建的秀麗隱桿線蟲高脂血癥模型，評估魚鰾肝素類粘多糖提取物的降脂活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該提取物能夠顯著降低模型組線蟲的脂滴水平，同時(shí)減少甘油三酯和游離脂肪酸的積累。基因表達(dá)分析表明，魚鰾肝素類粘多糖提取物可顯著上調(diào)脂肪酸β-氧化調(diào)控基因nhr-49的表達(dá)，并促進(jìn)δ9脂肪酸去飽和酶基因fat-5、fat-6和fat-7的表達(dá)?？梢?，該提取物通過多途徑協(xié)同作用改善脂質(zhì)代謝紊亂，發(fā)揮顯著的降脂效果。