專利名稱：短干擾核酸雜交體及其制備方法
短干擾核酸雜交體及其制備方法根據(jù)美國(guó)能源部與加利福尼亞大學(xué)之間關(guān)于美國(guó)勞倫斯利弗莫爾國(guó)家實(shí)驗(yàn)室運(yùn) 作的協(xié)議No. W-7405-ENG-48,美國(guó)政府對(duì)該發(fā)明享有權(quán)利。相關(guān)申請(qǐng)交叉參考本申請(qǐng)要求享有于2002年9月9日提交、題目為"使用DNA:RNA雜交的短干 擾分子的基因沉默"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/409,680的優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入本文。發(fā)明背景近年來，人們已經(jīng)接受RNA干擾是由表現(xiàn)出序列特異性基因沉默效應(yīng)的短干擾 RNA分子("siRNA")介導(dǎo)的。雖然siRNA基因沉默的具體機(jī)制還不完全清楚，但 可以通過引入與靶基因同源的siRNA分子從而降解細(xì)胞mRNA，來使基因沉默或喪 失功能。之前涉及使用反義分子的實(shí)驗(yàn)性工作說明了作為優(yōu)異的抗病毒載體的反義治 療，但事實(shí)上由于反義分子的半衰期非常短，從而限制了其應(yīng)用。另外，反義治療是 一種被動(dòng)的方法，因?yàn)槠渲皇呛?jiǎn)單地阻斷病毒mRNA的翻譯，而RNAi實(shí)際上降解 mRNA。涉及將產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的類似工作適合于突變研究，但是諸 如此類的積極方法對(duì)于遺傳病程如微生物感染的長(zhǎng)期保護(hù)來說并非這么有用。下列參考文獻(xiàn)涉及基因沉默技術(shù)，其整體內(nèi)容通過引用并入本文。參考文獻(xiàn)-1. R e, A" Xu， S" Mcmtgomery， MX, Kostas, S.A" Driver, S.E"旭d Mello, C.C. (1998) Potent aiKi specific gei tic intoference by double stranded RNA in CacmoduAditis ^gans. 408,325-330.2. KKuiMdeU， J.R.， and Cartfaew, R,W. (l卿)U站of dsRNA-邁ediated辟加tic int faa^ to tea咖trste that^zzfed and</>tee2Al 2 act in the wingless pathway. CeU. 95， 1017-1026.83. 鳩squitt^ L,旭d Patersoa, B .M. (1999) Targeted disruption of gene function in Drosophia by RNA intaf枕ence (RNA-i): a role for nautilus in axdsryonic somatic muscle formation. J°roc. Warf. Acai Sci KSA. 96,1451-1456.4. Ibinmoi l, S. M" Borostein, E.， B鄉(xiāng)h, D., and HaniM)n, O丄(2000) An RNA-directed抑ctease mediates post transcriptional gene silencing in Droso^iila cells. JVatom 404,293-296.5. Lehmann, J.U" Endl， I" and Bosch， T.C. (l卿)Silencing of developmental genes in Hydra. Dev. BioZ. 214， 211-214.6. W虹^di鵬,A" EUings叫S" and Fjose, A, (1999) Double stranded RNA induces specific dev^fmiental defects in zebrafish e邁byos. Bioche機(jī)Ble^hyjr.及w. Commun. 263,156*161.7. 1%), H" Tschudi, C.， Gull, K., and UUu, E. (l柳)Double stranded RNA induces mRNA ^grad^ion in Trypanosoma brucei. /Voc. Wari. Acorf. Set C/SA. 95,14687-14692.8. MMUsoraery, MIC, Xu, S,, Fire> A. (1998) RNA as a target of double stranded RNA m^iaied gmetic interference in C鄉(xiāng)(HiiaMditis elegans. Proc. TtoZ. Acad Scf. WSA. 95,15502-15507.9. Bosher, LM., Dufourcq, P., Sookh咖ea^ S" Laboues站，M. (1999) RNA interfiar^e c助target pre-mRNA. Consequoices for gene戰(zhàn)pre^don in Caraioihahiditis etegans qpcron. G enertcy. 153,1245-1256.10. A. (1999) RNA-trigg咖d gene silencing. 7Vwuis Gewf. 15,358-363.11. Sfcarp， P.A. (l卿)RNAi and double-stranded RNA. G ww Dev. 13,139-141.12. Ketting, R.F" Hareikamp, T.H" van Lu抑節(jié),H.G" and Plaster]^ R.H. (1999) Mut-7 of €. eie^ms, requiredtr咖poson silmcing and RNA intarf iice， is a ho邊ologof Wen^r syndrome hdic助e and RN鵬I. Ce仏99， 133-141.13. TibarA H., Sarkissian, M, Kelly, W.G" Fleencxr, J., Orishok, A., Tinuno加，L.， Hiv, A"抑d KMlo， C.C.. (l卿)Tlie rde-1 g咖,RNA interference and tranq>oson silencing in C.etog咖.Ce". 99,123-132.14. 2toiore, P.D" Tuschl, T.， Sharp, P.A" and Bartel, D.P. (2000) RNAi: Double stranded RNA directs the ATP dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. C H. 101,25-33.15. ^matein, E" Caudy, A.A" Hanmion4 S.M" and H咖on， G丄02001) Role for a bidbxtoteiibQinHdeaseiD the initiation step of RNA interference. Mz加w. 409,363-366.16. S" Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001) RNA interference is mediated by 21 ani 22加deotkte RNAs. Ge鵬muf Dev. 15,188-200.17. Sh邵，P.A. (2001) RNA intoference 2001. <3ot j o 4 Dev. 15,485490.18. H咖to, T.， Hunt, T" and Jackson, R. J. (1975) The characteistics of inhibition of protein synthesis by double-stranded ribonucleic acid in reticulocyte lysates.義Oe肌250,409417.W.B鵬，B.L (2001) The short咖w枕，411， 428429.20. 曰bashir, S.M" Harbor^ J" LendecteL W" Yalcin， A.， Weber， KL,祖d Tuschl, T. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured BMmnali離cdls. iVorure. 411,494498.21. C鵬on, P.E. and Frischer, H. (1966) Glocose-6-Phosphate ^hydrog節(jié)ase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. Am / o/. 41 ， 744~ 764.22. Sttmato， TD" Mackenzie, L" P嗎ani， J.M"幼d Weinstein， R. (1982) Mutagen treatoient of single Chinese Hamster Ovary ceils produce colcmies mosaic for Glucose-6-]Ao^)hatedriiydro,ase activity. Somaric CtfU Genera. 8,643~651.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種新型組合物和使用該組合物在體內(nèi)和體外抑制任意真核和原核 生物有機(jī)體或細(xì)胞中基因功能的方法。本發(fā)明的短干擾核酸或核酸類似物雜交體可以用于靶向并抑制任意基因的功能，使該基因的特異序列可以得以鑒定，不管基因的功 能或來源如何。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其中核酸或核酸類似物單鏈 的雜交互補(bǔ)部分與其他不同類型核酸或核酸類似物單鏈雜交形成具有雜交部分和至 少一個(gè)3'突出端的siHybrid。 siHybrid的雜交部分的長(zhǎng)度可以是10-100個(gè)堿基對(duì)，取 決于基因和其要應(yīng)用的生物有機(jī)體或細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種組合物，其中核酸或核酸類似物單鏈的雜交互補(bǔ)部分與其 他不同類型核酸或核酸類似物單鏈雜交形成siHybrid,所述的siHybrid具有長(zhǎng)度為 19-21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基的兩個(gè)3'突出端。另外，本發(fā)明還提供了一種組合物，其中核酸或核酸類似物單鏈的雜交互補(bǔ)部 分與其他不同類型核酸或核酸類似物單鏈雜交形成siHybrid,所述的siHybrid具有長(zhǎng) 度為21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和長(zhǎng)度為2個(gè)堿基的兩個(gè)3'突出端。本發(fā)明還提供了一種制備siHybrid組合物的方法，包括提供與其他不同類型核酸或核酸類似物的單鏈雜交形成siHybrid的核酸或核酸類似物單鏈，所述的siHybrid 具有雜交部分和至少一個(gè)3'突出端。本發(fā)明還提供了一種制備siHybrid組合物的方法，包括提供與其他不同類型核 酸或核酸類似物單鏈雜交形成siHybrid的核酸或核酸類似物單鏈，所述的siHybrid 具有長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基的兩個(gè)3'突出端。此外，本發(fā)明還提供了一種制備siHybrid組合物的方法，包括提供與其他不同 類型核酸或核酸類似物單鏈雜交形成siHybrid的核酸或核酸類似物單鏈，所述的 siHybrid具有長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和長(zhǎng)度為2個(gè)堿基的兩個(gè)3'突出端。本發(fā)明還提供了一種制備多個(gè)siHybrid組合物的方法，包括提供與其他多個(gè)不 同類型核酸或核酸類似物單鏈雜交形成多個(gè)siHybrid的一組核酸或核酸類似物單鏈， 所述的siHybrid具有長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基的兩個(gè)3' 突出端。本發(fā)明還提供了一種制備多個(gè)siHybrid組合物的方法，包括提供與其他多個(gè)不 同類型核酸或核酸類似物單鏈雜交形成多個(gè)siHybrid的一組核酸或核酸類似物單鏈， 所述的siHybrid具有長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和長(zhǎng)度為2個(gè)堿基的兩個(gè)3'突出 端。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是將所述的siHybrid直接應(yīng)用到基質(zhì)上，或使用一種 轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用于基質(zhì)上，以沉默一個(gè)基因或多個(gè)基因，所述的基質(zhì)是細(xì)胞或生物有機(jī) 體，即病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、 人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。


圖1說明siHybrid分子。圖2說明通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中非輔助性遞送siRNA和siHybrid分子實(shí)現(xiàn)的 G6PD的基因沉默。圖3是說明短干擾分子的核酸構(gòu)象改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中siRNA介導(dǎo)的基因沉默 效應(yīng)的程度和持久性的圖。圖4是說明兩種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)基因沉默效應(yīng)的程度和時(shí)間長(zhǎng)度應(yīng)答的圖。圖5說明細(xì)菌細(xì)胞的CFU形成使抗生素抗性基因沉默。 圖6說明細(xì)菌細(xì)胞的CFU形成使/o/A基因沉默。
具體實(shí)施方式
siRNA的三個(gè)最大的弱點(diǎn)是其短期效應(yīng)、對(duì)細(xì)菌無效和需要輔助遞送至細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染是將基因或其他核酸遞送到真核細(xì)胞的策略。有三類轉(zhuǎn)染技術(shù)生化方法、物理 方法和病毒介導(dǎo)的方法。所采用的轉(zhuǎn)染技術(shù)取決于轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的脅迫和方法的效率。 生化方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。物 理方法包括電穿孔法和基因槍法(biolisics)。在細(xì)菌中核酸的吸收稱作轉(zhuǎn)化。必須處 理細(xì)菌膜，以使細(xì)胞處于"感受態(tài)"，從而吸收異源核酸。兩種轉(zhuǎn)化技術(shù)是熱激和電 穿孔。siRNA短的持久性是防礙其任何有意義臨床用途的特征。包括癌癥治療、抗病 毒藥物和特定遺傳病治療的潛在應(yīng)用都需要長(zhǎng)期作用過程，以促進(jìn)遞送和效率。例如， 由于siRNA對(duì)細(xì)菌無效，排除了作為抗細(xì)菌藥進(jìn)行較短期治療的用途。本文所公開 的siHybrid構(gòu)建體解決了這兩個(gè)問題。本文公開了siHybrid分子，其具有與siRNA類似的功能，但是在基因沉默方面 更有效。siHybrid分子包括一個(gè)核酸鏈如RNA與核酸類型不同于第一鏈的第二核酸 鏈如DNA雜交，而非雙鏈RNA。兩種不同類型核酸的雜交產(chǎn)生的siHybrid具有雜交 互補(bǔ)部分和至少一個(gè)3'突出端。核酸類似物可以代替核酸使用。術(shù)語"核酸類似物" 指修飾的或非天然存在的核苷酸或骨架結(jié)構(gòu)，如肽核酸(PNA)。siHybrid的獨(dú)特功能與分子的穩(wěn)定性相關(guān)。雙鏈的RNA分子天生是不穩(wěn)定的； 其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中快速降解，在細(xì)菌中幾乎立即降解。相比之下，DNA:RNA雜交 體可能是天然材料中最穩(wěn)定的一類核酸分子，該構(gòu)建體在細(xì)胞、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物中不 降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DNA:RNA雜交體是比siRNA更強(qiáng)的基因沉默試劑。邏輯上說， 分子越穩(wěn)定,分子越可以是更強(qiáng)的基因沉默試劑。因此，包含至少一個(gè)PNA的siHybrid 或由新的合成核酸類似物構(gòu)成的分子可以和DNA:RNA雜交體同樣有效或比 DNA:RNA雜交體更強(qiáng)，如果合成siHybrid比DNA:RNA雜交體更穩(wěn)定的話。12參照?qǐng)Dl，最有效的DNA:RNA雜交體具有長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)的雜交互補(bǔ)部 分(2)和長(zhǎng)度為至少2個(gè)堿基的至少一個(gè)突出3'端(4)。分子的雜交互補(bǔ)部分可以 由最多為100個(gè)堿基對(duì)組成。通常，長(zhǎng)度越短，其特異性越低。如果siHybrid包含少 于10個(gè)堿基對(duì)，其將喪失沉默基因的特異性。另一方面，長(zhǎng)的分子難以進(jìn)入細(xì)胞， 從而不能夠使基因沉默。因此，含有超過100個(gè)堿基對(duì)的siHybrid將難以進(jìn)入細(xì)胞?？梢允褂镁哂卸鄠€(gè)基因共有序列的siHybrid來同時(shí)沉默多個(gè)基因。另外，還可 以使用多個(gè)siHybrid來沉默多個(gè)基因。多個(gè)基因沉默尤其可用于抗生素目的，因?yàn)橥?過同時(shí)沉默多個(gè)基因可以比只沉默一個(gè)基因更具選擇性、更有效地殺死細(xì)菌。多基因 沉默還可以用于人類治療目的。例如，通過抑制負(fù)責(zé)腫瘤生長(zhǎng)的多個(gè)基因，可以實(shí)現(xiàn) 抑制一個(gè)基因所不能達(dá)到的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制。siHybrid分子具有近乎萬能的潛力。它們可用于沉默任意生物有機(jī)體內(nèi)細(xì)胞中 的基因。它們可用于治療或研究目的。它們可用作抗生素、抗病毒藥物和癌癥治療藥 物，還可用于治療由基因的非必要超表達(dá)所致的各種遺傳病。另外，它們還可用在植 物中以治療植物疾病，改善植物品質(zhì)，如產(chǎn)量、顏色、環(huán)境耐受性或質(zhì)量。通過選擇 性地沉默基因，siHybrid可以用作除草劑、殺蟲劑、農(nóng)藥和殺真菌劑。siHybrid可以用于預(yù)防細(xì)胞的病毒感染。通過尋找對(duì)病毒感染獨(dú)特且必要的基 因，如蛋白酶基因或逆轉(zhuǎn)錄酶基因，構(gòu)建相應(yīng)的siHybrid,并將這些siHybrid應(yīng)用于 細(xì)胞，可以通過使基因沉默來殺死病毒，并治愈病毒感染。并且，通過使細(xì)菌菌株的 必要基因途徑沉默可以將siHybrid用作抗生素。沉默這種途徑提供了一種殺死細(xì)菌細(xì) 胞的方法。另外，siHybrid可以用于治療由基因的超表達(dá)或致病基因所致的人類或動(dòng)物疾 病。這類疾病可以包括但不局限于自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥和高血壓。siHybrid 還可用來抑制正常表達(dá)的基因，以用作治療目的。例如，為了能夠成功進(jìn)行器官移植， 可以抑制與排斥反應(yīng)免疫應(yīng)答相關(guān)的基因。 配方和施用途徑siHybrid可以配制成藥學(xué)上可接受的任意劑型。例如，可以是一種適合人體靜 脈用藥的劑型。所述劑型可以包括本領(lǐng)域已知的、藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩 沖液、滲透劑等。所述配方可以包括用于聯(lián)合治療的其他藥用活性成分。所述配方還可以針對(duì)特定用途設(shè)計(jì)成粉末、固體、液體或氣體形式。siHybrid可以口服、皮下、 靜脈內(nèi)、大腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、髓內(nèi)、腸道外、經(jīng)皮、經(jīng)鼻或經(jīng)直腸施用。使用的siHybrid 形式至少部分取決于它們的施用途徑。 實(shí)驗(yàn)如下文所述對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的 siHybrid濃度以終濃度計(jì)為10嗎/1"06細(xì)胞—25嗎/1><106細(xì)胞。用在細(xì)菌細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 中的siHybrid濃度以終濃度計(jì)為0.25 pg/ml—4 pg/ml。雖然這些實(shí)驗(yàn)說明了在沉默基 因方面有效的范圍，但實(shí)際的最低有效濃度可以遠(yuǎn)低于10 ^/1"06細(xì)胞或0.25 fag/ml。哺乳動(dòng)物細(xì)胞概述建立了用于驗(yàn)證siHybrid對(duì)各種癌基因和腫瘤抑制因子基因的效應(yīng)的方法。目 的是建立長(zhǎng)期關(guān)閉特定基因的一種途徑，并觀察效果。使用siHybrid來沉默人體或倉 鼠來源的正?；虬┳兗?xì)胞中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)基因。結(jié)果表明和siRNA 相比，siHybrid在抑制G6PD基因表達(dá)的量和持久性上都較強(qiáng)。結(jié)果還表明siHybrid 的效力不依賴于DNA:RNA的取向。在siRNA和siHybrid基因沉默實(shí)驗(yàn)中，只使用 了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染涉及將待遞送入細(xì)胞的核酸用結(jié)合核酸分子的陽離子脂 質(zhì)包覆。人造膜和同樣由脂質(zhì)組成但帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜融合。對(duì)于非輔助性的遞送實(shí) 驗(yàn)來說，構(gòu)建體直接加到培養(yǎng)基中。不需要使用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基或試劑；只需要將siHybrid 加入到培養(yǎng)基中即可。圖2說明了通過siRNA和siHybrid分子的非輔助性遞送使 G6PD的基因沉默。在不同的實(shí)驗(yàn)中，siHybrid加入到分裂細(xì)胞中，然后生長(zhǎng)至少8天。在8天中 的各間隔，誘導(dǎo)G6PD基因，觀察到了少于40%的基因表達(dá)。對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出正常的 G6PD活性，加入傳統(tǒng)siRNA分子的細(xì)胞表現(xiàn)出正常的G6PD活性，兩天內(nèi)返回到 100%的基因表達(dá)。這些觀察結(jié)果說明siHybrid可以用于沉默哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的幾乎 所有基因。該功能可以用于抑制任意致病基因超表達(dá)，從而提供對(duì)疾病的有效治療。 細(xì)菌細(xì)胞概述在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上使用siHybrid的顯著基因沉默效果暗示了其在細(xì)菌細(xì)胞上的 用途，其邏輯前提是其在哺乳動(dòng)物中的顯著持久性能夠使它在細(xì)菌中發(fā)揮類似功能。第一個(gè)靶點(diǎn)是簡(jiǎn)單的位于轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的質(zhì)粒上的抗生素抗性基因。當(dāng)在含抗生素 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，只有這些質(zhì)粒上所含基因的活性使細(xì)胞存活。使用大腸桿菌 (E.coU)進(jìn)行所有的細(xì)菌試驗(yàn)，因?yàn)樗鼈円子诘玫?，并可安全使用。由于?xì)菌降解 siRNA的機(jī)制在所有細(xì)菌中都是相同的，因此認(rèn)為這種試驗(yàn)是合理的。在一系列實(shí)驗(yàn)中，對(duì)兩種常用抗生素氨芐青霉素和氯霉素提供抗性的基因得到了沉默。在所有情況下，當(dāng)對(duì)抗抗生素抗性基因的siHybrid加入到培養(yǎng)基中時(shí)，易于在含抗生素培養(yǎng)基中 生長(zhǎng)的細(xì)菌死亡。不需要轉(zhuǎn)化步驟，也不需要轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基或試劑。只需要將siHybrid 簡(jiǎn)單加入到培養(yǎng)基中即可。另外，當(dāng)將不靶向表達(dá)基因的siHybrid加入到培養(yǎng)基中時(shí)， 沒有這種效應(yīng)；細(xì)菌就象沒有加入任何東西一樣生長(zhǎng)。這說明所觀察到的是一種直接 效應(yīng)，而不是大規(guī)模的、非特異性的殺傷細(xì)胞。為了證明細(xì)菌中的基因沉默效應(yīng)，對(duì)在細(xì)菌中產(chǎn)生DHFR并提供嘌呤合成的 /0/A基因進(jìn)行靶向。在供有嘌呤的"富集"培養(yǎng)基中，基因產(chǎn)物是非必需的。當(dāng)將沉 默DHFR的siHybrid加入到在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌時(shí)，沒有所述效應(yīng)。但是， 在不提供有嘌呤或嘧啶的基本培養(yǎng)基中，DHFR蛋白是細(xì)胞存活所必需的。它使得細(xì) 胞從其他分子合成嘌呤，如胸苷或腺嘌呤。在基本培養(yǎng)基中，如果/o/A基因沒有功 能，則細(xì)胞不能進(jìn)行DNA合成，從而會(huì)變得靜息，不能生長(zhǎng)。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入嘌 呤或嘧啶(核苷)如腺嘌呤或胸苷時(shí)，細(xì)胞將再次生長(zhǎng)，因?yàn)镈HFR蛋白質(zhì)不再為 嘌呤合成所必需。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，我們向培養(yǎng)基中加入了siHybrid/o/A拮抗劑，然后加 入氨芐青霉素。獲得siHybrid的所有細(xì)胞都停止分裂；而未獲得siHybrid的細(xì)胞都被 只殺死分裂細(xì)胞的氨芐青霉素殺死。將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)出含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，重懸于不 含siHybrid、氨芐青霉素和核苷的基本培養(yǎng)基。在將嘌呤加入到培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)胞就 開始以正常速率生長(zhǎng)。再次加入不靶向非必需或不表達(dá)基因的siHybrid則沒有效應(yīng)。 加入與siHybrid具有相同序列的siRNA分子也沒有效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)說明基因沉默是 特異而非致死的，用傳統(tǒng)的siRNA治療是不可能的。該實(shí)驗(yàn)中描述的結(jié)果表明對(duì) 于特定的細(xì)菌來說，通過選擇獨(dú)特的、細(xì)菌存活所必需的基因，siHybrid可以通過使 基因沉默來充當(dāng)那些特定細(xì)菌的抗生素。由于細(xì)菌具有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明siHybrid可以直接應(yīng)用于哺 乳動(dòng)物細(xì)胞以產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)，而不需使用轉(zhuǎn)染手段，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞僅具有細(xì)胞膜，易于siHybrid透過，且siHybrid比siRNA更為穩(wěn)定。因此，除了通過轉(zhuǎn)染手 段如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)和核酸序列將siHybrid遞送到細(xì)胞中，還可以不使用轉(zhuǎn)染試劑， 直接使用siHybrid進(jìn)行疾病治療。 艦糊纖為了研究由siRNA介導(dǎo)的RNAi能力，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來轉(zhuǎn)錄后沉默培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的可誘導(dǎo)性內(nèi)源基因，并測(cè)定這種效應(yīng)的持久性。使用siRNA來沉默CHOAA8 細(xì)胞系中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)基因，其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可誘導(dǎo)的內(nèi)源 性基因。G6PD在動(dòng)物組織內(nèi)的戊糖磷酸途徑中起到重要的作用，以產(chǎn)生還原形式的 尼古酰胺二核苷三磷酸、NADPH和用于形成核苷酸的核糖-5-磷酸(參見Carson，P.E. and Frischer, H. (1966) Glucose-6隱Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. 4 n JMed 41, 744-764.)。葡萄糖-6-磷酸進(jìn) 入該途徑，為G6PD所氧化，產(chǎn)生NAPDH和6-磷酸-glucno-S-內(nèi)酯(參見Carson, P.E. and Frischer, H. (1966) Glucose-6-Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway.爿w /A/ed 41， 744-764.)。該反應(yīng)的氧化還原 性質(zhì)可以和細(xì)胞暴露于葡萄糖-6-磷酸時(shí)使用的四唑基組織化學(xué)染料聯(lián)用，作為比色 分析以定量由細(xì)胞中的G6PD酶活性所表示的G6PD基因沉默程度。改變短干擾分子的核酸組成，進(jìn)行siRNA介導(dǎo)的基因沉默分析來測(cè)試其對(duì)這種 基因沉默模式所改變的參數(shù)的影響。這些因素包括基因沉默效應(yīng)的程度和持久性，以 及恢復(fù)的基因表達(dá)的量。使用哺乳動(dòng)物G6PD基因，這些參數(shù)的改變?nèi)Q于細(xì)胞所暴 露的短干擾分子的核酸組成。為了說明哺乳動(dòng)物細(xì)胞間這些觀察結(jié)果的普遍性，進(jìn)行 了人類細(xì)胞與倉鼠細(xì)胞之間的比較分析。 材料與方法短干擾分子制備.從G6PD基因序列中隨機(jī)選擇21 bp的序列。使用與倉鼠和人 G6PD基因中共有序列同源的第二區(qū)域進(jìn)行倉鼠-人類比較研究。在John Hopkins大學(xué) 的DNA合成核心機(jī)構(gòu)(DNA Synthesis Core Facility)構(gòu)建反義和正義鏈，其具有2 個(gè)核苷酸3'尿苷突出端。siDNA序列含有2個(gè)核苷酸3'胸苷突出端。siRNA序列是 非純化的，siDNA序列為RP cartridge純化。在10 mM Tris-HCl (pH 8.0)的存在下， 以等摩爾量于94'C變性5分鐘、53'C重新退火3 h并緩慢冷卻至室溫，使正義和反義鏈退火在一起。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染.中國(guó)倉鼠卵巢(CHO) AA8細(xì)胞在添加有10%胎牛血清 (FBS)、 1% L-谷氨酰胺和1°/。抗生素-抗真菌劑的F-12 Nutrient Mixture Ham (Life Technologies, New York)中于37。C增殖。人HCF-7細(xì)胞在添加有10% FBS、 1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素、1%MEM非必需氨基酸溶液、P/。丙酮酸鈉和2。/。BME 氨基酸溶液的DMEM/F-12 (Life Technologies)中增殖。FBS于56'C加熱30分鐘滅 活以去除核酸酶活性。細(xì)胞每周傳代3次，以維持指數(shù)生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì) 胞用lxPBS洗3次，胰酶處理，以"106/板鋪在35 mm組織培養(yǎng)皿中不含有抗生素 的2ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，于37。C孵育。使用10叫核酸、使用Lipofectamine試劑(Life Technologies, New York)并根據(jù)生產(chǎn)商對(duì)貼壁細(xì)胞的操作方案進(jìn)行短干擾分子的轉(zhuǎn) 染。細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物一起孵育5 h。為了防止細(xì)胞毒性，吸出復(fù)合物，用完全的生 長(zhǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞洗兩次，并在含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中于37'C孵育，直至準(zhǔn)備進(jìn)行 G6PD酶活性分析。G6PD比色分析和酶活性的定量.如Stamato(參見Stamato， T.D.， Mackenzie, L.， Pagani， J.M.， and Weinstein, R. 1982, Mutagen treatment of single Chinese Hamster Ovary cells produce colonies mosaic for Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. S固Wc Ce// Ge"幼'c;y. 8， 643-651 )所述監(jiān)測(cè)G6PD酶活性。簡(jiǎn)而言之，將單層細(xì)胞用2 ml 0.14M NaCl/0.012% Triton-X 100溶液處理，并在2 ml含2.5 mg/ml葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽， pH 6.5、 0.17 mg/ml吩嗪硫酸甲酯、0.33 mg/ml硝基四氮唑蘭、0.14 MNaCl、0.17 mg/ml NADP和0.012% Triton-X 100的溶液中孵育1 h。將細(xì)胞用2 ml 10%醋酸緩沖的福爾 馬林固定15min，洗滌并氮?dú)飧稍?。為了定量酶活性，獲得細(xì)胞的平均像素強(qiáng)度，以 表示與G6PD活性水平相關(guān)的細(xì)胞顏色深淺。在Zeiss Axiophot上使用亮視野光以20x 觀察細(xì)胞。在存在有單層細(xì)胞的區(qū)域中獲取板的圖象。獲得單個(gè)細(xì)胞和顯示背景的不 含細(xì)胞區(qū)域的平均像素強(qiáng)度差。使用Smart Capture VP軟件進(jìn)行圖象分析。點(diǎn)雜交.轉(zhuǎn)染有短干擾分子的CHOAA8細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后0、 6、 12、 18和24小時(shí) 的時(shí)間點(diǎn)上用lxPBS洗滌3次而取出(lifted),并和胰酶一起孵育5分鐘。將細(xì)胞用 1xPBS洗滌，并重懸于lxPBS中。將細(xì)胞懸液(約105細(xì)胞)于95t:煮IO分鐘以獲 得細(xì)胞裂解物。如Gibco的Blugene非放射性核酸檢測(cè)系統(tǒng)(Gibco，s BlugeneNonradioactive Nucleic Acid Detection System)中所述進(jìn)行雜交過程，以檢測(cè)裂解物中 短干擾分子的存在。所用的探針是生物素化的反義G6PDDNA序列。統(tǒng)計(jì).CHO AA8 siRNA和siDNA時(shí)間實(shí)驗(yàn)中的值是5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，雜 交實(shí)驗(yàn)為3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。倉鼠-人類比較時(shí)間實(shí)驗(yàn)中的值為兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 平均值。通過將陽性對(duì)照條件的平均值表示為100%、將實(shí)驗(yàn)條件下的平均值除以平 均陽性對(duì)照值而獲得相對(duì)值。誤差條線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。 實(shí)驗(yàn)銪果使用陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行的短干擾分子的轉(zhuǎn)染不一致地導(dǎo)致細(xì)胞毒性，導(dǎo)致低轉(zhuǎn) 染效率。CHOAA8和人MCF-7細(xì)胞用陽離子脂質(zhì)體來轉(zhuǎn)染短干擾分子。不論用何種 轉(zhuǎn)染試劑，活細(xì)胞計(jì)數(shù)(vital count)表明暴露于轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞有50%死亡。測(cè) 試了 5種不同的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，以使細(xì)胞的毒性和死亡最小，其中 Lipofectamine (Life Technologies)產(chǎn)生最低水平的細(xì)胞死亡。只對(duì)轉(zhuǎn)染后看起來健康 的細(xì)胞進(jìn)行G6PD活性分析。在分析G6PD酶活性時(shí)，根據(jù)細(xì)胞顏色，在35mm板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大約有40-50n/。 轉(zhuǎn)染了短干擾分子。如細(xì)胞顏色指示，單層培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞傾向于發(fā)生在 離散的批次間。只有轉(zhuǎn)染區(qū)的細(xì)胞用于分析基因沉默。在G6PD活性未受到抑制的對(duì) 照板中，不存在細(xì)胞顏色深淺不同的區(qū)域，說明G6PD分析不產(chǎn)生這種效應(yīng)。比色分析提供了檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中G6PD基因沉默存在的有效方法.G6PD基因是 研究siRNA介導(dǎo)的基因沉默的首選。為了將轉(zhuǎn)染效率和siRNA研究分割開，重要的 是能夠分析單個(gè)細(xì)胞，而非獲得群體平均值。為此，使用Stamato等(22)建立的比 色分析法分析G6PD蛋白的酶活性。之前Elbashir等(20)使用siRNA來沉默培養(yǎng)的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的工作也使用熒光染色和熒光酶活性的比色技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。在轉(zhuǎn) 染之后，細(xì)胞和含有葡萄糖-6-磷酸(G6P)和尼古酰胺二核苷三磷酸(NAPD)的四 唑基組織化學(xué)染料一起孵育。向細(xì)胞中加入G6P激活G6PD基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。 G6PD的酶活性將G6P的氧化和NADP到NADPH的還原相偶聯(lián)，以產(chǎn)生從白到紫 的細(xì)胞顏色變化。如果與G6PD基因序列具有序列同源性的siRNA的加入誘導(dǎo)CHO AA8細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，則合成不足量的G6PD蛋白，導(dǎo)致G6PD酶活性缺 乏和抑制顏色變化反應(yīng)。暴露于siRNA分子的中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞中存在的誘導(dǎo)性G6PD酶活性下降.通過將細(xì)胞的顏色強(qiáng)度和同樣與組織化學(xué)染料孵育的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的顏色強(qiáng)度相比較，測(cè) 定siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中G6PD活性的相對(duì)變化。為了保證轉(zhuǎn)錄后基因沉默是siRNA的 特異效應(yīng)，還測(cè)定了轉(zhuǎn)染有非同源核苷酸序列、T7引物的CHO AA8細(xì)胞以及暴露于 不含載體的陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞中的酶活性。不存在G6P的條件下和組織化學(xué)染料 一起孵育的CHOAA8細(xì)胞用作分析的陰性對(duì)照。孵育后獲得細(xì)胞的圖象，測(cè)定基于 單個(gè)細(xì)胞顏色的像素強(qiáng)度，以測(cè)定G6PD活性的相對(duì)變化。通過將G6PD所致的葡萄糖-6-磷酸的氧化與NAPD的還原和四唑基組織化學(xué)染 料相偶聯(lián)，可以檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的G6PD活性。s汲NA誘導(dǎo)G6PD基因沉默的動(dòng)力學(xué).為了確定siRNA對(duì)G6PD轉(zhuǎn)錄后基因沉 默的動(dòng)力學(xué)，在5小時(shí)的轉(zhuǎn)染之后跨越長(zhǎng)達(dá)96小時(shí)的特定時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行比色分析， 以測(cè)定G6PD酶活性的存在。siRNA介導(dǎo)的基因沉默在轉(zhuǎn)染后的前24小時(shí)提供G6PD 活性的約為60%的下降。在48小時(shí)，細(xì)胞開始重新表達(dá)G6PD基因，在轉(zhuǎn)染后96 小時(shí)表現(xiàn)出完全的表達(dá)。參照屈3， (A)轉(zhuǎn)染siRNA分子的CHOAA8細(xì)胞；(B)暴露于siDNA分子的 細(xì)胞；(C)導(dǎo)入短干擾雜交分子DNAs:RNAa和(D) RNAs:DNAa。對(duì)照反應(yīng)轉(zhuǎn)染 具有T7噬菌體啟動(dòng)子引物序列(T)的si分子(RNA:RNA、RNA:DNA或DNA:DNA)， 或暴露于不含載體(B)的陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。暴露于對(duì)照試驗(yàn)的所有細(xì)胞都表現(xiàn) 出100%的基因表達(dá)和酶活性。轉(zhuǎn)染siDNA分子的細(xì)胞表現(xiàn)出最低程度的基因沉默效 應(yīng)，而siRNA分子提供了對(duì)基因表達(dá)的較大抑制作用。對(duì)于轉(zhuǎn)染siRNA或siDNA分 子的細(xì)胞來說，沉默時(shí)間長(zhǎng)約24小時(shí)。DNAs:RNAa和RNAs:DNAa構(gòu)象的短干擾雜 交分子表現(xiàn)出對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的最大程度和持久的抑制作用。該效應(yīng)一直持續(xù)96小 時(shí)。圖A和B是從5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，圖C和D的數(shù)據(jù)為從3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲 得的數(shù)據(jù)。當(dāng)*鼷于不同核酸組成的短干擾分子時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)出在G6PD基因沉默方面的差 異性應(yīng)答.由于siRNA介導(dǎo)的RNAi的機(jī)制不清楚，不清楚轉(zhuǎn)錄后基因沉默是否是由 RNA組成的短干擾序列的特異效應(yīng)，核酸組成不同的siRNA分子是否能提供基因沉 默效應(yīng)。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，序列同所用siRNA載體相同的siDNA序列和由RNA與DNA組成的短干擾雜交分子轉(zhuǎn)染到CHO AA8細(xì)胞中，再次在轉(zhuǎn)染后跨越長(zhǎng)為96小 時(shí)的設(shè)定時(shí)間點(diǎn)分析G6PD酶活性。構(gòu)建了兩種不同的雜交分子，其中組成正義鏈和 反義鏈的核酸不同。對(duì)細(xì)胞的分析表明在所用的不同短干擾分子間存在不同的G6PD 沉默應(yīng)答。轉(zhuǎn)染siDNA分子的細(xì)胞表現(xiàn)出最低程度的基因沉默，直到轉(zhuǎn)染后12小時(shí) 都未見對(duì)表達(dá)的最大抑制。轉(zhuǎn)染siRNA分子的對(duì)照細(xì)胞早在轉(zhuǎn)染后0小時(shí)就表現(xiàn)出 表達(dá)下降，與siDNA分子相比，具有較大程度的沉默。siDNA和siRNA分子的效應(yīng) 都持續(xù)約24小時(shí)，在96小時(shí)達(dá)到正常表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染DNAs:RNAa和RNAs:DNAa短干擾雜交分子的CHO AA8細(xì)胞都表現(xiàn)出 G6PD酶活性的最大下降，持久性最長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染DNAs:RNAa的細(xì)胞早在轉(zhuǎn)染后O小時(shí) 就表現(xiàn)出G6PD下降，相對(duì)活性百分比約為20%。這些效應(yīng)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)程中持續(xù)， 剰余活性量約為20%或更低。轉(zhuǎn)染RNAs:DNAa分子的細(xì)胞也觀察到了類似的效應(yīng)。 參照?qǐng)D3，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中剩余的酶活性百分比約為20%或約20%以下。進(jìn)行點(diǎn)雜交以 檢測(cè)短干擾雜交分子的存在。但未檢測(cè)到，說明分子的細(xì)胞內(nèi)濃度太低以致檢測(cè)不到。在轉(zhuǎn)染后120-192小時(shí)之間，每24小時(shí)分析暴露于雜交分子的細(xì)胞中G6PD的 存在，以確定雜交構(gòu)建體的效應(yīng)能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。在120小時(shí)，存在的G6PD活性增 加至約40%，但是直到192小時(shí)都保持在該水平。進(jìn)行點(diǎn)雜交以檢測(cè)短干擾雜交分子 的存在。但未檢測(cè)到，說明分子的細(xì)胞內(nèi)濃度太低以致檢測(cè)不到。不同核酸組成的siRNA介導(dǎo)的基因沉默的差異性應(yīng)答可能存在于所有的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中。為了說明差異性應(yīng)答不是倉鼠細(xì)胞的特異效應(yīng)，在人細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞中進(jìn) 行了核酸組成各異的短干擾分子的比較時(shí)程研究。本實(shí)驗(yàn)還說明了改變短干擾分子與 之同源的基因序列的效應(yīng)。所述分子與倉鼠和人G6PD編碼區(qū)中的序列相同。圖4 顯示差異性應(yīng)答也存在與人MCF-7細(xì)胞中，說明該應(yīng)用對(duì)所有培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的可能通用性。轉(zhuǎn)染siDNA分子的細(xì)胞表現(xiàn)出最低程度的基因沉默，而siRNA分子 提供對(duì)基因表達(dá)的較大程度的抑制作用。在轉(zhuǎn)染后約24小時(shí)siRNA和siDNA的沉默 效應(yīng)都表現(xiàn)出喪失，在96小時(shí)重新獲得完全的表達(dá)。在人類細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞中雜交 分子都提供了基因沉默方面的最大下降，和對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的長(zhǎng)期抑制。只使用了由 RNA正義鏈和DNA反義鏈組成的雜交分子，因?yàn)樵诖酥皟H涉及倉鼠細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中 兩種雜交分子獲得了類似的結(jié)果。圖示為轉(zhuǎn)染(A) siRNA分子；(B) siDNA分子和(C) RNAs:DNAa組成的短 干擾雜交分子的CHO AA8和人MCF-7細(xì)胞。由于此處所用的序列與CHOAA8細(xì)胞 中的第一系列實(shí)驗(yàn)中所用序列不同，這些結(jié)果說明不同的應(yīng)答不是細(xì)胞特異的效應(yīng)， 也不是序列特異的效應(yīng)。導(dǎo)入siDNA分子導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)的最低抑制，而siRNA分 子提供較大程度的基因沉默。兩種細(xì)胞系中的兩種效應(yīng)都在轉(zhuǎn)染后持續(xù)約24小時(shí)。 短干擾雜交分子表現(xiàn)出對(duì)G6PD基因表達(dá)的最大程度和持久性，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)程。 所有3個(gè)圖中的數(shù)據(jù)是從兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)。除了說明該應(yīng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的潛在用途，這些實(shí)驗(yàn)還表明存在的差異性 應(yīng)答和短干擾分子與之同源的編碼區(qū)序列無關(guān)。在倉鼠細(xì)胞中驗(yàn)證核酸組合物效應(yīng)的 初步實(shí)驗(yàn)使用了與人類-倉鼠比較實(shí)驗(yàn)所不同的短干擾序列，兩種序列都與編碼鏈的 非區(qū)分區(qū)同源。但二者都導(dǎo)致基因沉默，具有雜交分子提供的差異性應(yīng)答和長(zhǎng)期抑制。 細(xì)菌細(xì)胞只采用了 siHybrid的非輔助性遞送。非輔助性遞送涉及將siHybrid直接加到細(xì) 菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中。1.有效劑量的cW siHybrid:UltraMAX DH5a-FT感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Carlsbad, California)通過熱激轉(zhuǎn)化編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性蛋白(c加基因)的 pBC SK+質(zhì)粒(Promega， Madison， WI)。轉(zhuǎn)化子在c加siHybrid構(gòu)建體存在下在含 25嗎/ml氯霉素抗生素(Sigma, St. Louis， MO)的2 ml Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)。為了確定c加siHybrid的有效劑量，細(xì)胞在0.125、 0.25、 0.50、 1.0、 2.0、 4.0 和8.0嗎/ml構(gòu)建體的存在下生長(zhǎng)。siHybrid長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)，與pBC SK+質(zhì)粒中 W基因編媽區(qū)的特異序列同源。根據(jù)Tuschl等的指導(dǎo)設(shè)計(jì)構(gòu)建體(參見"ThesiRNA user guide",網(wǎng)址為mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/sirna.html)。正義鏈由序列為 5， CGGUGGUAUAUCCAGUGAUUUUU 3'(Dharmacon， Lafayette, CO)的RNA組成。 反義鏈由序列為5' AAATCACTGGATATACCACCGTT 3' (Sigma Genosys, The Woodlands, TX)的DNA組成。對(duì)照條件包括陽性對(duì)照，其含有在LB-氯霉素培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)的細(xì)胞，在序列與siHybrid相同的4嗎/ml siRNA存在下的LB-氯霉素培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。為了說明siHybrid的作用是序列特異性的，還使用了與大腸桿 菌基因組中任意區(qū)域都不同源的siHybrid構(gòu)建體(NH)。正義鏈由序列為5，CUGGCCAGCCACAUAGGAGUUUU 3， (Dharmacon)的RNA組成。反義鏈由序列 為5'AACTCCTATGTGGCTGGCCAGTT3， (SigmaGenosys)的DNA組成。培養(yǎng)物 在搖床(shaker)上于37°C以250rpm孵育過夜。孵育后，將培養(yǎng)物以1:1000稀釋至 LB培養(yǎng)基中，將10 pi稀釋物鋪到添加有25 pg/ml氯霉素抗生素的LB/瓊脂板上。為 了在板上獲得均勻的菌落，將直徑為5 nun的鈉鈣玻璃(soda lime glass)珠(VWR， Westchester, PA)涂到板上，用手搖晃。將板面朝上于37'C孵育過夜。為了對(duì)siHybrid 所致基因沉默活性的基因沉默發(fā)生進(jìn)行定量，利用下列公式計(jì)算菌落形成單位 (CFU):[(菌落數(shù)/鋪板10ml) x (稀釋系數(shù))x (2000 pi)]。參照?qǐng)D5,測(cè)定caf siHybrid活性，并表示為107菌落形成單位。對(duì)照、非同源 siHybrid和siRNA條在36.0-43.0xl07 CFU的面積中都表現(xiàn)出類似的生長(zhǎng)。該結(jié)果表 明菌落生長(zhǎng)與cW siHybrid濃度成反比。2.0嗎/ml、4.0嗎/ml和8.0 pg/ml的siHybrid 濃度在菌落形成方面與對(duì)照相比都表現(xiàn)出72.2%的下降。每增加一個(gè)劑量的orf siHybrid,菌落生長(zhǎng)平均下降23.6%。對(duì)于這里的所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)，誤差百分比都計(jì)算 為約5%。2.使用siHybrid沉默/o/A基因.MG1655大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物在與/o/A基因 編碼區(qū)序列同源的4 pg/ml siHybrid存在下于2 ml M9基本培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)，所述 /o/A基因的蛋白產(chǎn)物是二氫葉酸還原酶。正義鏈由序列為5' UCUCGCCUGGUUUAAACGCAAUU 3， (Johns Hopkins Synthesis Facility, Baltimore, Maryland)的RNA組成。反義鏈由序列為5， TTGCGTTTAAACCAGGCGAGATT 3' (Johns Hopkins Synthesis Facility)的DNA組成。/o/A基因的沉默阻礙大腸桿菌細(xì) 胞在基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈儾荒芎铣舌堰屎袜奏?。有六種實(shí)驗(yàn)條件，包括含 有基本培養(yǎng)基中細(xì)胞的陽性對(duì)照，4 pg/ml /o/A siHybrid構(gòu)建體存在下基本培養(yǎng)基中 的細(xì)胞、具有4 jLig/ml/o/A siRNA (序列與siHybrid相同)構(gòu)建體的基本培養(yǎng)基中的 細(xì)胞、具有4 pg/ml非同源siHybrid構(gòu)建體的基本培養(yǎng)基中的細(xì)胞，和具有4 pg/ml/o/A siHybrid并添加有20 mM胸苷、胞苷、腺苷和鳥苷(Sigma)的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)在添加有50ng/ml三甲氧芐二氨嘧啶(Sigma)的基本培養(yǎng)基中，三 甲氧芐二氨嘧啶是一種特異性抑制二氫還原酶作用的抗生素，充當(dāng)藥理對(duì)照。培養(yǎng)物 于37'C生長(zhǎng)過夜，并以250rpm搖培。次日，將培養(yǎng)物稀釋至1:1000和1:100,000，并鋪板。對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的CFU。參照?qǐng)D6，將從陽性對(duì)照(只在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞)獲得的CFU值設(shè)定 為100%,所有其他條件都相對(duì)于該值表示。對(duì)于/o/AsiHybrid存在下生長(zhǎng)的培養(yǎng)物 來說CFU形成方面有超過80%的顯著下降。在陽性對(duì)照、/o/A siRNA存在下生長(zhǎng)的 培養(yǎng)物和非同源/o/AsiHybrid存在下生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中形成CFU的量之間差異不顯著。 /o/AsiHybrid以及嘌呤與嘧啶(siHybrid/營(yíng)救)存在下生長(zhǎng)的培養(yǎng)物表現(xiàn)出超過100% 的CFU形成。己經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)確定(數(shù)據(jù)未示出)這是由于營(yíng)救培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率顯 著快于陽性對(duì)照的生長(zhǎng)速率所致。人們假設(shè)生長(zhǎng)速率較快是由于營(yíng)救培養(yǎng)物中的細(xì)胞 不需要合成它們自己的嘌呤和嘧啶，因此能夠以較快的速率發(fā)生分裂。上面說明書中提到的所有出版物和專利都通過引用并入本文。在不背離本發(fā)明的 范圍和實(shí)質(zhì)的條件下，對(duì)本發(fā)明的所述方法和系統(tǒng)進(jìn)行各種修改和變動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域的 技術(shù)人員來說將是顯而易見的。雖然聯(lián)系特定的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)該理解， 所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)局限于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)實(shí)施本發(fā)明的所述方 式所作的、對(duì)于分子生物學(xué)領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的各種修改也屬于附 加的權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包括一種siHybrid，其包括(1)雜交互補(bǔ)部分和(2)至少一個(gè)突出的3’端部分，所述的siHybrid具有相雜交的第一單鏈核酸或核酸類似物序列和第二單鏈核酸或核酸類似物序列，其中所述的第二單鏈序列的核酸或核酸類似物類型與第一單鏈序列不同。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、 RNA 和PNA。
3. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述組合物的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
4. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的突出3'端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基。
5. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
6. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述的siHybrid具有兩個(gè)突出的3'端。
7. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿基，組合 物的雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
8. —種組合物，包括一種siHybrid，其包括(1)長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)的雜交互補(bǔ)部分和(2)每個(gè) 長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基的兩個(gè)突出的3'端，所述的siHybrid具有相雜交的第一單鏈核酸或 核酸類似物序列和第二單鏈核酸或核酸類似物序列，其中所述第二單鏈序列的核酸或 核酸類似物類型與第一單鏈序列不同。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、 RNA 和PNA。
10. —種組合物，包括一種siHybrid，包括(1)長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)的雜交互補(bǔ)部分和(2)每個(gè)長(zhǎng)度 為2個(gè)堿基的兩個(gè)突出的3'端，所述的siHybrid具有相雜交的第一單鏈核酸或核酸類 似物序列與第二單鏈核酸或核酸類似物序列，其中所述第二單鏈序列的核酸或核酸類 似物類型與第一單鏈序列不同。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、RNA 和PNA。
12. —種方法，包括 提供第一單鏈核酸或核酸類似物序列；提供第二單鏈核酸或核酸類似物序列，其核酸或核酸類似物類型與所述的第一單 鏈序列不同；和使所述的第一單鏈序列和所述的第二單鏈序列雜交，以制備siHybrid，其包括(l) 雜交互補(bǔ)部分和(2)至少一個(gè)3'突出端。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、 RNA 和PNA。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述siHybrid的雜交部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的突出3'端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中siHybrid的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
17. 權(quán)利要求12的方法，其中所述siHybrid的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿 基，siHybrid的所述雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
18. 權(quán)利要求12的方法，其還包括使所述的siHybrid直接與基質(zhì)接觸，或者使用轉(zhuǎn)染試劑使所述的siHybrid與基質(zhì) 接觸，以沉默至少一個(gè)基因。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述siHybrid的雜交部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的突出3'端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述siHybrid的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述siHybrid的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿 基，siHybrid的所述雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的基質(zhì)是生物有機(jī)體或細(xì)胞。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的生物有機(jī)體是病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生 物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
25. —種方法，包括提供一種siHybrid，其具有相雜交的第一單鏈核酸或核酸類似物序列和第二單鏈 核酸或核酸類似物序列，所述的第二單鏈序列的核酸或核酸類似物類型與第一單鏈序 列不同，其中所述的siHybrid具有(l)雜交互補(bǔ)部分和(2)至少一個(gè)突出的3'端；和使所述的siHybrid直接與基質(zhì)接觸，或者使用轉(zhuǎn)染試劑使所述的siHybrid與基質(zhì) 接觸，以沉默至少一個(gè)基因。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、 RNA 和PNA。
27. 權(quán)利要求25的方法，其中所述siHybrid的雜交部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
28. 權(quán)利要求25的方法，其中所述的突出3'端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基。
29. 權(quán)利要求25的方法，其中所述siHybrid的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
30. 權(quán)利要求25的方法，其中所述siHybrid的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿 基，siHybrid的所述雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
31. 權(quán)利要求25的方法，其中所述的基質(zhì)是生物有機(jī)體或細(xì)胞。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述的生物有機(jī)體是病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生 物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
33. —種方法，包括 提供第一單鏈核酸或核酸類似物序列，所述的序列是多個(gè)基因所共有的； 提供第二單鏈核酸或核酸類似物序列，其核酸或核酸類似物類型與所述的第一單鏈序列不同；和使所述的第一單鏈序列和所述的第二單鏈序列雜交，以制備siHybrid，其具有(l) 雜交互補(bǔ)部分和(2)至少一個(gè)3'突出端。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、 RNA 和PNA。
35. 權(quán)利要求33的方法，其還包括使所述的siHybrid直接與基質(zhì)接觸，或者使用轉(zhuǎn)染試劑使所述的siHybrid與基質(zhì) 接觸，以沉默所述的多個(gè)基因。
36. 權(quán)利要求33的方法，其中所述siHybrid的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
37. 權(quán)利要求33的方法，其中所述的3'突出端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基，所述的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
38. 權(quán)利要求33的方法，其中所述siHybrid的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿 基，siHybrid的所述雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
39. 權(quán)利要求35的方法，其中所述的基質(zhì)是生物有機(jī)體或細(xì)胞。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述的生物有機(jī)體是病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生 物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
41. 一種方法，包括提供每個(gè)具有不同序列的一組siHybrid，所述siHybrid的每一個(gè)包含相雜交的第 一單鏈核酸或核酸類似物序列和第二單鏈核酸或核酸類似物序列，所述的第二單鏈序 列的核酸或核酸類似物類型與第一單鏈序列不同，其中每個(gè)siHybrid具有(l)雜交互 補(bǔ)部分和(2)至少一個(gè)3'突出端；和使所述的一組siHybrid直接與基質(zhì)接觸，或者使用轉(zhuǎn)染試劑使所述的一組 siHybrid與基質(zhì)接觸，以沉默至少一個(gè)基因。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中所述的第一單鏈序列和第二單鏈序列選自DNA、 RNA 禾B PNA。
43. 權(quán)利要求41的方法，其中所述siHybrid的雜交部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
44. 權(quán)利要求41的方法，其中所述的突出3'端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基。
45. 權(quán)利要求41的方法，其中所述siHybrid的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
46. 權(quán)利要求41的方法，其中所述siHybrid的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿 基，siHybrid的所述雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
47. 權(quán)利要求41的方法，其中所述的基質(zhì)是生物有機(jī)體或細(xì)胞。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中所述的生物有機(jī)體是病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生 物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
49. 一種方法，包括 提供第一組單鏈核酸或核酸類似物序列，其中每個(gè)具有不同的序列； 提供第二組單鏈核酸或核酸類似物序列，其中所述第二組單鏈的核酸或核酸類似物類型和所述第一組單鏈不同；和使所述的第一組單鏈和所述的第二組單鏈雜交，以制備一組siHybrid，其中每個(gè)siHybrid具有(l)雜交互補(bǔ)部分和(2)至少一個(gè)3'突出端部分。
50. 權(quán)利要求49的方法，其還包括使所述的一組siHybrid直接與基質(zhì)接觸，或者使用轉(zhuǎn)染試劑使所述的一組 siHybrid與基質(zhì)接觸，以沉默至少一個(gè)基因。
51. 權(quán)利要求49的方法，其中所述siHybrid的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為10-100個(gè)堿基對(duì)。
52. 權(quán)利要求49的方法，其中所述的3'突出端長(zhǎng)度為2-3個(gè)堿基。
53. 權(quán)利要求49的方法，其中所述的雜交互補(bǔ)部分長(zhǎng)度為19-21個(gè)堿基對(duì)。
54. 權(quán)利要求49的方法，其中每個(gè)siHybrid的兩個(gè)突出3'端的每一個(gè)長(zhǎng)度為2個(gè)堿 基，所述一組siHybrid的雜交部分長(zhǎng)度為21個(gè)堿基對(duì)。
55. 權(quán)利要求50的方法，其中所述的基質(zhì)是生物有機(jī)體或細(xì)胞。
56. 權(quán)利要求55的方法，其中所述的生物有機(jī)體是病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生 物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
57. —種方法，包括提供單鏈DNA，其具有23個(gè)堿基，5'端的前21個(gè)堿基序列與耙基因互補(bǔ)； 提供單鏈RNA，其具有23個(gè)堿基，5'端的前21個(gè)堿基序列與所述單鏈DNA5'端的所述前21個(gè)堿基序列互補(bǔ)；將所述的單鏈DNA與所述的單鏈RNA雜交，以形成siHybrid，其具有(1)21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和(2)位于每個(gè)3'端的兩堿基突出部分。
58. 權(quán)利要求57的方法，其還包括使所述的siHybrid與細(xì)胞或生物有機(jī)體接觸，所述的生物有機(jī)體選自病毒、原核 生物、細(xì)菌、真核生物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、 植物、昆蟲或真菌。
59. —種方法，包括提供單鏈DNA與單鏈RNA，雜交以形成siHybrid，其中所述的單鏈DNA具有 23個(gè)堿基，5'端的前21個(gè)堿基序列與靶基因互補(bǔ)，所述的單鏈RNA具有23個(gè)堿基， 5'端的前21個(gè)堿基序列與所述單鏈DNA 5'端的所述前21個(gè)堿基序列互補(bǔ)，所述的 siHybrid具有(1) 21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和(2)位于每個(gè)3'端的兩堿基突出部分; 禾口使所述的siHybrid與基質(zhì)相接觸。
60. 權(quán)利要求59的方法，其中所述的基質(zhì)是細(xì)胞或生物有機(jī)體，所述的生物有機(jī)體 選自病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、 人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
61.提供單鏈RNA，其具有23個(gè)堿基，5'端的前21個(gè)堿基序列與靶基因互補(bǔ)； 提供單鏈DNA，其具有23個(gè)堿基，5'端的前21個(gè)堿基序列與所述單鏈RNA5'端的所述前21個(gè)堿基序列互補(bǔ)；將所述的單鏈RNA與所述的單鏈DNA雜交，以形成siHybrid，其具有(1) 21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和(2)位于每個(gè)3'端的兩堿基突出部分。
62. 權(quán)利要求61的方法，其還包括使所述的siHybrid與細(xì)胞或生物有機(jī)體接觸，所述的生物有機(jī)體選自病毒、原核 生物、細(xì)菌、真核生物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類、人類細(xì)胞、 植物、昆蟲或真菌。
63. —種方法，包括提供單鏈RNA與單鏈DNA，雜交以形成siHybrid，其中所述的單鏈RNA具有 23個(gè)堿基，5'端的前21個(gè)堿基序列與靶基因互補(bǔ)，所述的單鏈DNA具有23個(gè)堿基， 5'端的前21個(gè)堿基序列與所述單鏈RNA 5'端的所述前21個(gè)堿基序列互補(bǔ)，所述的 siHybrid具有(1) 21個(gè)堿基對(duì)的雜交部分和(2)位于每個(gè)3'端的兩堿基突出部分； 和使所述的siHybrid與基質(zhì)相接觸。
64. 權(quán)利要求63的方法，其中所述的基質(zhì)是細(xì)胞或生物有機(jī)體，所述的生物有機(jī)體 選自病毒、原核生物、細(xì)菌、真核生物、真核細(xì)胞、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、 人類、人類細(xì)胞、植物、昆蟲或真菌。
全文摘要
本文公開了用于基因沉默的siHybrid。siHybrid是一種短的雙鏈分子，包括退火在一起的一個(gè)DNA鏈和一個(gè)RNA鏈，在其每個(gè)3’端具有2-堿基突出端。除了DNA和RNA，其還可包含PNA或其他核酸類似物。和siRNA相比，siHybrid可以更大量且更持久地使基因沉默，它們還可以沉默細(xì)菌基因，而siRNA不能。siHybrid是用于治療由過表達(dá)基因或癌基因所致疾病的藥物和治療劑的理想候選物。當(dāng)靶向關(guān)鍵而獨(dú)特的細(xì)菌基因時(shí)，它們還可以用作抗生素。siHybrid可以用作抗病毒藥物、殺真菌劑、除草劑或殺蟲劑?？梢栽O(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)膕iHybrid以沉默任意生物有機(jī)體內(nèi)任意細(xì)胞中的任意基因。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101405390SQ03821315
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日
發(fā)明者艾倫·T·克里斯蒂, 賈內(nèi)爾·S·蘭伯頓 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)