專利名稱：用于診斷β－地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷地中海貧血的核酸雜交膜條，具體地說(shuō)涉及用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條。
本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物。
本發(fā)明還涉及用于診斷β-地中海貧血的試劑盒。
背景技術(shù)：
地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)是一種常見(jiàn)的遺傳性疾病，世界各地都有發(fā)生，最多見(jiàn)于西自地中海區(qū)域，中經(jīng)土耳其、中東各國(guó)，東至東南亞和我國(guó)南部。地中海貧血癥的臨床表型多樣，可以從正常到需要反復(fù)輸血，甚至危及生命，導(dǎo)致患者在未成年前夭折甚至死胎。由于該病在我國(guó)南方的高發(fā)病率，對(duì)社會(huì)和家庭產(chǎn)生巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。然而，目前尚缺乏有效的治療措施，因此做好遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，阻止該類病重癥患兒的出生，對(duì)有效監(jiān)控此類疾病，提高人口素質(zhì)有重要意義。
地中海貧血分為α-地中海貧血和β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱β-地貧)。β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱β-地貧)是一種由β-珠蛋白基因異常導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由β-珠蛋白基因點(diǎn)突變所致，是我國(guó)南方各省最常見(jiàn)、危害最大的遺傳病之一。
由于地中海貧血的臨床癥狀具有較大的變異性，輕型患者及攜帶者的檢測(cè)易出現(xiàn)漏檢。隨著地中海貧血癥分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，使基因診斷成為可能。β-地中海貧血的基因缺陷絕大多數(shù)屬于非缺失型，即由于基因點(diǎn)突變?cè)斐搔?珠蛋白合成異常。β-地中海貧血癥具有種族特異性，表現(xiàn)為許多突變僅發(fā)生在某個(gè)別種族中，而且?guī)缀趺恳环N族都具有幾種常見(jiàn)的突變。到1998年，在中國(guó)β-地中海貧血群體中已發(fā)現(xiàn)23種不同的突變類型，大陸各省份共發(fā)現(xiàn)22種(其中3種僅見(jiàn)于少數(shù)民族)，臺(tái)灣共發(fā)現(xiàn)18種。在中國(guó)人群中常見(jiàn)的突變位點(diǎn)有41-42M、654M、-28M、71-72M等，其中5種突變?cè)谥袊?guó)人群中表現(xiàn)出較高的發(fā)病頻率，約占總發(fā)生率的90％以上。表1為β-地中海貧血癥各種突變類型發(fā)生頻率的統(tǒng)計(jì)。
表1 β-地中海貧血癥各種突變類型發(fā)生頻率的統(tǒng)計(jì)

β-地中海貧血癥的常用診斷技術(shù)有核酸雜交膜條法、PCR-SSCP、PCR-異源雙鏈分析、PCR-DGGE、PCR-ARMS、PCR-ASO、PCR-RFLP、PCR-錯(cuò)配化學(xué)裂解以及DNA芯片(熒光標(biāo)記玻璃芯片)法等。、申請(qǐng)?zhí)枮?2117287.0的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了用于診斷地中海貧血的DNA芯片及其制備方法，提供一種用于臨床診斷α-型和β-型地貧的DNA芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探針組成，針對(duì)迄今已知的α-和β-珠蛋白突變基因的序列，根據(jù)DNA序列特異性識(shí)別的原理設(shè)計(jì)的診斷這些突變的寡核苷酸探針。
前述DNA芯片在探針設(shè)計(jì)原理和產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)載體上都不同于本專利申請(qǐng)。在該專利申請(qǐng)中，采用玻璃片作為基底(即為載體)，即采用玻璃芯片法檢測(cè)DNA突變，并且在設(shè)計(jì)探針序列時(shí)，將突變的堿基設(shè)計(jì)在位于探針的端部。該方法的不足之處在于突變探針和正常探針在玻片的同一個(gè)位置，只是靠顏色不同來(lái)區(qū)分，這樣突變雜合子的樣品就是混合色，不好判斷；再加上此法信號(hào)的單一性較差，經(jīng)常伴有假信號(hào)，當(dāng)出現(xiàn)混合信號(hào)時(shí)有時(shí)很難區(qū)分是伴有假信號(hào)還是突變雜合子。而且用此法進(jìn)行檢測(cè)需要購(gòu)買昂貴的激光掃描儀，中國(guó)一般的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室還沒(méi)有這樣的經(jīng)濟(jì)條件。這就造成該方法產(chǎn)品在中國(guó)的推廣具有很大的局限性。
核酸雜交膜條法檢測(cè)β-地中海貧血癥應(yīng)用的是PCR加反向點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù)，該技術(shù)是在PCR-ASO技術(shù)的基礎(chǔ)上，1989年由Saiki等人提出的。該方法是將一系列已知的檢測(cè)探針固定在載體上，由檢測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物與之雜交，再通過(guò)一系列顯色反應(yīng)，檢測(cè)樣品PCR產(chǎn)物是否有與已知探針互補(bǔ)的系列。該方法具有檢測(cè)通量大，信號(hào)特異性高等特點(diǎn)。從技術(shù)原理來(lái)說(shuō)，核酸雜交膜條在本質(zhì)上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)中的一種，但它不同于一般所說(shuō)的玻璃DNA芯片，其檢測(cè)結(jié)果用肉眼就可直接判斷，而無(wú)需購(gòu)買昂貴的激光掃描儀，更易于在中國(guó)的醫(yī)院進(jìn)行臨床推廣。
以尼龍膜為基底的核酸雜交膜條技術(shù)，其主要的基本原理如下寡核苷酸探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標(biāo)記。經(jīng)活化處理的尼龍膜帶有羧基，可以與氨基形成共價(jià)結(jié)合。利用這種方法可將寡核苷酸探針按一定的排列規(guī)律牢固的固定在尼龍膜的表面。在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)病人基因組DNA樣品進(jìn)行大量快速擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物含有生物素標(biāo)記(事先標(biāo)記在PCR引物上)。PCR產(chǎn)物與膜條上的探針進(jìn)行特異性雜交后，通過(guò)生物素、鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺等一系列反應(yīng)，有PCR產(chǎn)物雜交上的相應(yīng)探針位點(diǎn)就會(huì)有藍(lán)色雜交信號(hào)顯示，據(jù)此就可判斷臨床樣品相應(yīng)位點(diǎn)突變的有無(wú)。由于膜條上的突變位點(diǎn)大都設(shè)計(jì)了相應(yīng)的正常對(duì)照，結(jié)合正常探針信號(hào)有無(wú)就可判斷相應(yīng)位點(diǎn)突變是雜合子還是純合子。其最主要優(yōu)點(diǎn)為信號(hào)特異性強(qiáng)，幾無(wú)非特異性信號(hào)。除此外，其優(yōu)點(diǎn)主要還有簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求低，儀器設(shè)備投入小，易于在發(fā)展中國(guó)家做臨床推廣等。醫(yī)院只需要購(gòu)買一臺(tái)普通的PCR儀、一臺(tái)雜交儀和其它實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備就可完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，在中國(guó)一般的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室都可以做到。
迄今為止，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)β-地中海貧血癥的以尼龍膜為基底或突變基因位于寡核苷酸探針中部的核酸雜交膜條。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于臨床診斷β-地貧的核酸雜交膜條。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供用于診斷β-地中海貧血的試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條，包括一基底；以及固定于所述基底上的特異性探針；其特征在于每一條所述的特異性探針?lè)謩e針對(duì)一個(gè)突變的β-珠蛋白基因位點(diǎn)，稱為突變探針；所述突變的β-珠蛋白基因位點(diǎn)為選自27-28M、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M、43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CAP、IntM和IVS1-5M的一個(gè)或一個(gè)以上的組合；其中每一條突變探針包含14至20個(gè)堿基的序列，在該堿基序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的突變的β-珠蛋白基因的突變堿基。
與突變位點(diǎn)在寡核苷酸探針的端部相比，突變位點(diǎn)在寡核苷酸探針的中間可明顯降低非特異性雜交信號(hào)，大大提高檢測(cè)的特異性。
在本發(fā)明中，N代表正常型，M代表突變型，在本發(fā)明中涉及到的正常或突變位點(diǎn)的含義列表如下表2

用于該核酸雜交膜條的基底可以是任何適于固定寡核苷酸探針的基底，例如尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片、微縮磁珠等。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該基底為尼龍膜。將尼龍膜用活化液預(yù)處理30分鐘后，激活表面羧基，然后活化的羧基與末端帶有氨基標(biāo)記的寡核苷酸探針的氨基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而可將探針固定在尼龍膜表面。
固定于基底上的探針則是針對(duì)如上所述的β-珠蛋白突變檢測(cè)基因的序列，根據(jù)DNA序列特異性識(shí)別的原理設(shè)計(jì)的診斷這些突變的寡核苷酸探針，通過(guò)點(diǎn)樣裝置將探針按照一定規(guī)律排列在基底，如尼龍膜等上，經(jīng)過(guò)固定和相關(guān)處理后就制成了核酸雜交膜條。
設(shè)計(jì)突變探針時(shí)根據(jù)GC含量的不同設(shè)計(jì)大約14至20個(gè)堿基的探針，但每個(gè)探針都必須包含有相應(yīng)的突變位點(diǎn)，一般在中間。
所述的突變探針選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.17中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA，覆蓋了β-珠蛋白17個(gè)突變位點(diǎn)。在選擇探針時(shí)，可以根據(jù)需要任選一組或多組，然后從每組中任選一條。設(shè)計(jì)的探針序列見(jiàn)表3表3 突變探針的DNA序列

注SEQ ID NO.9探針I(yè)VS1-1M序列中的W＝A/T。
進(jìn)一步的，所述核酸雜交膜條還包括固定于所述基底上的針對(duì)β-珠蛋白正?；虻奶禺愋蕴结?，稱為正常探針，其與突變探針?lè)謩e固定于基底的不同位置上。
所述的正常探針，是作為對(duì)照，以利于更準(zhǔn)確的判斷突變類型。以上探針也都可以是反向互補(bǔ)的序列。正常和突變探針還可以是不同的區(qū)段。
所述的正常探針選自SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.24中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA；每一個(gè)正常探針都分別對(duì)應(yīng)于一個(gè)或幾個(gè)突變的β-珠蛋白基因位點(diǎn)；具體見(jiàn)表4和表5表4正常探針針對(duì)的突變位點(diǎn)


表5 正常探針的DNA序列

進(jìn)一步的，上述突變探針和/或正常探針可在5’端或3’端進(jìn)一步進(jìn)行氨基或oligo(T)等方式標(biāo)記，以使探針可以與基底更好地結(jié)合。不標(biāo)記而用紫外聯(lián)法，也可以固定探針。
上述用于診斷β-地貧的核酸雜交膜條的制備方法包括合成探針，將合成的探針及相應(yīng)的對(duì)照組DNA按一定的順序點(diǎn)樣并排列于基底上，將點(diǎn)樣后的探針DNA固定于基底上而制備得到核酸雜交膜條。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物。所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有可與β-珠蛋白突變檢測(cè)探針(其中的一部分正常和/或突變探針)發(fā)生特異性雜交的DNA序列，所述引物包括兩對(duì)引物，分別為SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；其中SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的擴(kuò)增產(chǎn)物可與654N和/或654M雜交，用于檢測(cè)654位點(diǎn)突變；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)除654位點(diǎn)外的其它位點(diǎn)的突變。
表6 不同長(zhǎng)度的β-珠蛋白基因PCR引物DNA序列

對(duì)上述引物中的部分或全部進(jìn)行生物素或放射性、熒光(如CY5、CY3、TAMRA)等方式標(biāo)記，使得擴(kuò)增的產(chǎn)物中含有相應(yīng)的標(biāo)記，以便可以在雜交后對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)β-地中海貧血癥的試劑盒，其中它包含上述的用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條；以及上述的用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR反應(yīng)液；核酸雜交的反應(yīng)溫度是40℃～46℃，其最佳反應(yīng)溫度為42℃～44℃。
該試劑盒用于檢測(cè)β-地中海貧血癥時(shí)，包括以下步驟1)將來(lái)自待檢樣品的DNA用本發(fā)明所述的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；2)將獲得的產(chǎn)物與本發(fā)明所述用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條進(jìn)行雜交；3)檢測(cè)結(jié)果。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，制備本發(fā)明所述核酸雜交膜條并利用其檢測(cè)樣品的方法簡(jiǎn)述如下1、膜條的制作尼龍膜經(jīng)活化液預(yù)處理30分鐘后，激活表面羧基；同時(shí)，將在5’或3’端帶有氨基標(biāo)記的探針用緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群?，按陣列順序點(diǎn)加于尼龍膜相應(yīng)位置上，此時(shí)，氨基與活化的羧基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面；最后，用封阻液處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面羧基，膜條制作完成。
2、待檢樣品DNA的制備采用煮沸裂解法或全血DNA快速提取試劑盒提取法從血液中提取人基因組DNA。
3、PCR擴(kuò)增待檢樣品擴(kuò)增的PCR片段包含待測(cè)基因片段，且在PCR產(chǎn)物5’端帶有生物素標(biāo)記。
4、雜交將標(biāo)記后的待測(cè)產(chǎn)物與固定在膜條上的探針進(jìn)行雜交，其雜交原理與普通核酸雜交相同。雜交溫度與探針和標(biāo)記后的待測(cè)樣品的長(zhǎng)度、GC含量、鹽濃度、甲酰胺等有關(guān)。在本發(fā)明的體系中42℃孵育1.5～4小時(shí)后可獲得滿意的雜交結(jié)果。
5、洗脫非特異性結(jié)合物利用不同的洗脫條件，如溫度、鹽濃度等最大限度的去除非特異性雜交。
6、顯色標(biāo)記有過(guò)氧化物酶(POD)的鏈霉親和素(鏈霉抗生物素蛋白)與PCR產(chǎn)物5’端帶有的生物素特異結(jié)合，并在過(guò)氧化氫和棕色底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)的存在下發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng)，膜條上相應(yīng)探針位置顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。
7、檢測(cè)結(jié)果經(jīng)肉眼觀察即可判斷檢測(cè)結(jié)果。也可經(jīng)閱讀儀閱讀后，對(duì)信號(hào)與背景進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，由相應(yīng)的軟件系統(tǒng)分析獲得最終的雜交結(jié)果，并自動(dòng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行保存和統(tǒng)計(jì)。
本發(fā)明所述的用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條，其固定于基底的用于檢測(cè)樣本的探針包含了與β-地貧發(fā)生相關(guān)的主要突變位點(diǎn)，探針序列中將突變的堿基包含在整個(gè)序列的大致中間位置，并且突變探針與正常探針?lè)謩e排列在基底的不同位置上，對(duì)正常、突變雜合子、突變純合子都很容易判斷，且信號(hào)特異性非常好，可提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低成本、縮短診斷時(shí)間，降低成本，易于在醫(yī)院推廣。
為了更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，下面結(jié)合附圖，通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說(shuō)明但不限制本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明以尼龍膜為基底的核酸雜交膜條的檢測(cè)結(jié)果圖，其中，由上至下依次為核酸雜交膜條A～C的三個(gè)結(jié)果圖，每個(gè)圖中，第一排由左至右依次為41-42N、654N、-28N、71-72N、17N、βEN、31N、27-28M，第二排由左至右依次為41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M，第二排由左至右依次為43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CAP、IntM、IVS1-5M；圖2為以玻璃片為基底的DNA芯片的檢測(cè)結(jié)果圖，其中，圖(A)為正常人的樣品，圖(B)為發(fā)生突變的樣品，兩個(gè)圖中，-28位點(diǎn)均在第一排左起第二個(gè)，41-42位點(diǎn)均在第二排左起第四個(gè)；圖3為本發(fā)明以尼龍膜為基底的核酸雜交膜條的檢測(cè)結(jié)果圖，其中，由上至下依次為核酸雜交膜條D和E的結(jié)果圖，每個(gè)圖中，探針的位置同圖1。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品。
實(shí)施例1用于檢測(cè)β-地貧的核酸雜交膜條的制備1、探針的制備按照表3中的序列合成探針，反向互補(bǔ)序列的探針具有與表中序列相同的效果，在此表中不再一一列出。對(duì)探針的5’端或3’端進(jìn)行氨基標(biāo)記具有相同的效果，合成的方法為常規(guī)的DNA合成法。
表3 突變探針的DNA序列

注SEQ ID NO.9探針I(yè)VS1-1M序列中的W＝A/T。
表5 正常探針的DNA序列

2、核酸雜交膜條的制作完成寡核苷酸探針的合成之后，需進(jìn)行直接寡核苷酸探針的固定。先將尼龍膜裁成一定的大小，并在其上打印好格子和相應(yīng)格子的探針名稱，經(jīng)活化液預(yù)處理30分鐘后，激活表面羧基；同時(shí)，將在5’或3’端帶有氨基標(biāo)記的探針用探針稀釋液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群螅命c(diǎn)樣裝置將各個(gè)探針點(diǎn)加于相應(yīng)的格子上。探針末端的氨基與膜表面活化的羧基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而將探針固定在尼龍膜上。最后，用封阻液處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面羧基，核酸雜交膜條制作完成。
表7 核酸雜交膜條點(diǎn)樣的陣列順序

注43M和41-42M可同時(shí)以41-42N為參照，-32M、-30M、-29M及-28M均可以-28N為正常對(duì)照，14-15M和17M可以17N作參照。
實(shí)施例2用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的引物的設(shè)計(jì)根據(jù)β-地中海貧血癥基因突變的序列資料，用兩對(duì)特異性的、具有不同長(zhǎng)度和Tm值、并且在5’端含有生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增β-珠蛋白基因的兩個(gè)片段。這兩對(duì)引物的核苷酸序列見(jiàn)表6。該表中，SEQIDNO.27和SEQIDNO.28的擴(kuò)增產(chǎn)物可與654N和/或654M雜交，用于檢測(cè)654位點(diǎn)突變；SEQIDNO.25和SEQIDNO.26的擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)除654位點(diǎn)外的其它位點(diǎn)的突變。
表6 不同長(zhǎng)度的β-珠蛋白基因PCR引物DNA序列

實(shí)施例3待檢樣品DNA的檢測(cè)一、試驗(yàn)用儀器及試劑1、試驗(yàn)用儀器PCR儀、DNA電泳儀、分子雜交箱、搖床2、試驗(yàn)用試劑(1)3％H2O2(2)20×SSC(pH7.0)取NaCl175.3g，檸檬酸鈉88.2g，加H2O溶至1000mL，用pH計(jì)調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。
(3)10％SDS(pH7.0)將20g SDS加H2O180mL溶解，用HCl調(diào)pH至7.0，最后定容至200mL。
(4)A液(2×SSC，0.1％SDS，pH7.4)取20×SSC100mL、10％SDS 10mL，加H2O溶至1000mL，調(diào)pH至7.4。
(5)B液(0.5×SSC，0.1％SDS，pH7.4)取20×SSC25mL、10％SDS10mL，加H2O溶至1000mL，調(diào)pH至7.4。
(6)C液(0.1M檸檬酸鈉，pH5.4)取檸檬酸鈉14.7g，溶于450mL水，用濃HCl調(diào)pH至5.0，最后定容至500mL。
(7)鏈霉親合素-過(guò)氧化物酶(streptavidin-POD)(8)四甲基聯(lián)苯胺的(TMB)二、待檢樣品DNA的檢測(cè)1、待檢樣品DNA的制備取三份血樣(分別記為A、B、C)，選用以下兩種方法的任一種進(jìn)行提取。
(1)煮沸裂解法取100μL抗凝全血，加1mL無(wú)菌水，充分混勻，室溫放置5分鐘以裂解紅細(xì)胞，13000rpm離心1分鐘，棄上清可見(jiàn)管底有一白色沉淀；重復(fù)此操作1～2次，直至白色沉淀塊中幾乎見(jiàn)不到血紅色。吸干上清液，加入裂解液50μL，充分混勻，于100℃水浴煮10分鐘；13000rpm離心5分鐘，取上清液即可作為β-地貧PCR模板。
(2)全血DNA快速提取試劑盒提取法使用Qiagen全血提取試劑盒或亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司的全血DNA快速提取試劑盒從抗凝全血中抽提人基因組DNA。
2、目的基因的PCR擴(kuò)增取PCR-Mix反應(yīng)管三支，在管壁上做好標(biāo)記，并于5000rpm離心2秒，而后分別加入已提取的待測(cè)樣品DNA2μL(含基因組DNA約50～100ng)，此時(shí)反應(yīng)總體系為25μL。
β-PCR Mix-I 23μLDNA模板 2μL(50-100ng)Total25μL按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增50℃ 15min95℃ 10min
35循環(huán)72C 5min擴(kuò)增的PCR片段包含有待測(cè)基因片段，且在PCR產(chǎn)物5’端帶有生物素標(biāo)記。
3、雜交取15mL塑料離心管，標(biāo)明待檢樣品編號(hào)，放入同樣標(biāo)有待檢樣品編號(hào)的核酸雜交膜條(由實(shí)施例1制備)，加入A液5-8mL及PCR產(chǎn)物，將蓋擰上。將塑料管放入沸水中加熱10分鐘(確保雜交液液面完全位于水浴液面之下)，取出擰緊蓋子，放入42℃雜交-箱雜交1.5～4小時(shí)。取一只50mL塑料管，加入40mLB液于雜交箱或溫箱中預(yù)熱至42℃。
4、洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL管中，于42℃輕搖洗滌15分鐘。通過(guò)上述操作，可最大限度的去除非特異性雜交。
5、顯色用A液配制12000的鏈霉親合素-過(guò)氧化物酶(streptavidin-POD)溶液。先將膜條用該streptavidin-POD溶液室溫輕搖浸泡30分鐘，棄去streptavidin-POD溶液；再用A液室溫輕搖洗膜兩次，每次5分鐘；然后用C液室溫洗膜1～2分鐘，同時(shí)配制顯色液(顯色液需新鮮配制。按順序加入19mL0.1M檸檬酸鈉、1mLTMB、10μL3％H2O2，配制而成。)。將膜條浸泡于顯色液中，避光顯色10～15分鐘即可見(jiàn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)。標(biāo)記有過(guò)氧化物酶(POD)的鏈霉親和素(鏈霉抗生物素蛋白)與PCR產(chǎn)物5’端帶有的生物素特異結(jié)合，并在過(guò)氧化氫和棕色底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)的存在下發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng)。這樣，有雜交產(chǎn)物的膜條相應(yīng)探針位置就會(huì)顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。
三份樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖所示，在膜條A中，71-72N和M及654N、M同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明待檢樣品A為71-72及654雙重雜合子；在膜條B中，βEN無(wú)斑點(diǎn)，而βEM出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明待檢樣品B為βEM純合子；在膜條C中，在41-42N和M同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明待檢樣品C為41-42雜合子。
6、結(jié)果判定通過(guò)膜條的顯色結(jié)果即可判斷基因突變的類型，還可進(jìn)一步經(jīng)閱讀儀閱讀后對(duì)信號(hào)與背景進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，直接給出雜交結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行保存和統(tǒng)計(jì)分析。
實(shí)施例4核酸雜交膜條法與玻璃芯片法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)1、玻璃芯片法玻璃芯片法為采用以玻璃片為基底的DNA芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。用于診斷β-地貧基因突變的以玻璃片為基底的DNA芯片的制備方法及檢測(cè)方法參見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)枮?2117287.0的中國(guó)專利申請(qǐng)。
利用該DNA芯片進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖2。在圖2中，A圖為正常人樣品(簡(jiǎn)稱1號(hào)樣品)，B圖為發(fā)生突變的樣品(簡(jiǎn)稱2號(hào)樣品)。正常人樣品的相應(yīng)位點(diǎn)為紅色，突變均為綠色信號(hào)。
如圖所示，1號(hào)樣品的-28位點(diǎn)和41-42位點(diǎn)都為紅色；2號(hào)樣品的41-42位點(diǎn)為綠色信號(hào)，發(fā)生了突變，-28為黃色信號(hào)(紅與綠混合信號(hào))，無(wú)法判斷該樣品-28位點(diǎn)是否突變，然后，經(jīng)測(cè)序法檢測(cè)該樣品，證實(shí)-28位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生突變。
玻璃芯片法的突變探針和正常探針在同一個(gè)位點(diǎn)，只是靠顏色不同來(lái)區(qū)分，這樣突變雜合子的樣品就是混合色，不好判斷；再加上此法信號(hào)的單一性較差，經(jīng)常伴有假信號(hào)，當(dāng)出現(xiàn)混合信號(hào)時(shí)有時(shí)很難區(qū)分是伴有假信號(hào)還是突變雜合子。
2、核酸雜交膜條法核酸雜交膜條法為采用以尼龍膜為基底的膜條進(jìn)行檢測(cè)的方法。用于診斷β-地貧基因突變的以尼龍膜為基底的核酸雜交膜條的制備方法及檢測(cè)方法參見(jiàn)上述實(shí)施例1～3。
利用該雜交膜條進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖3。在圖3中，D圖為正常人樣品(簡(jiǎn)稱4號(hào)樣品)，E圖為發(fā)生突變的樣品(簡(jiǎn)稱5號(hào)樣品)。如圖所示，4號(hào)樣品膜條的突變探針位置均未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明4號(hào)樣品未發(fā)生突變；5號(hào)樣品膜條的-28M和N同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明5號(hào)樣品為-28雜合子。
在核酸雜交膜條法中，由于其探針的設(shè)計(jì)原理不同與如上玻璃芯片法，突變探針與正常探針?lè)謩e在不同位置上，對(duì)正常、突變雜合子、突變純合子都很容易判斷，且信號(hào)特異性非常好。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，這些改變和變形均應(yīng)屬于本發(fā)明后附的權(quán)利要求所定義的范圍。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司<120>用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒<130>
<160>28<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtgaggccc ctgg14<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2caaaggactc aacctctgg 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>3attgctatta ccttaaccc 19<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>4ccctgacttc tatgccc 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>5ggtgccttta agtgatg 17<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>6tgtggggcta ggtgaac 17<210>7<211>16
<212>DNA<213>人工序列<400>7ttggtggtaa ggccct16<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>8cttaggtgct ggtggt16<210>9<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>9ctgggcagwt tggtat16<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>10ggttctttta gtcctttgg 19
<210>11<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>11cctgactttt attccca 17<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>12ccctgacttt catgccc 17<210>13<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>13cctgactttt gtgccc16<210>14<211>16<212>DNA<213>人工序列
<400>14ccctggtggg gcaagg16<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>15catggtgtct gaggttg 17<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16ggtgcaccct ggtgtct 17<210>17<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>17gcaggttgct atcaag16<210>18
<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18cagaggttct ttgagtcctt 20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>19gggttaaggc aatagcaat 19<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>20tgggcataaa agtcaggg 18<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>21
tcggtgcctt tagtgat 17<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>22tgtggggcaa ggtgaac 17<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>23cagggcctca ccacca 16<210>24<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>24cttaggctgc tggtgg 16<210>25<211>19<212>DNA
<213>人工序列<400>25cacttagacc tcaccctgt 19<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>26tgacatgaac ttaaccatag 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>27taacagtgat aatttctggg 20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28ccagtttagt agttggactt 20
權(quán)利要求
1.一種用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條，包括一基底；以及固定于所述基底上的特異性探針；其特征在于每一條所述的特異性探針?lè)謩e針對(duì)一個(gè)突變的β-珠蛋白基因位點(diǎn)，稱為突變探針；所述突變的β-珠蛋白基因位點(diǎn)為選自27-28M、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M、43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CAP、IntM和IVS1-5M的一個(gè)或一個(gè)以上的組合；其中每一條突變探針包含14至20個(gè)堿基的序列，在該堿基序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的突變的β-珠蛋白基因的突變堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸雜交膜條，其特征在于所述的突變探針選自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.17中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2之一所述的核酸雜交膜條，其特征在于還包括固定于所述基底上的針對(duì)β-珠蛋白正?；虻奶禺愋蕴结?，稱為正常探針，其與突變探針?lè)謩e固定于基底的不同位置上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸雜交膜條，其特征在于所述的正常探針選自SEQ IDNO.18～SEQ ID NO.24中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA；每一個(gè)正常探針都分別對(duì)應(yīng)于一個(gè)或幾個(gè)突變的β-珠蛋白基因位點(diǎn)，其中，SEQ IDNO.18針對(duì)的突變位點(diǎn)為41-42M和43M；SEQ ID NO.19針對(duì)的突變位點(diǎn)654M；SEQ IDNO.20針對(duì)的突變位點(diǎn)為-28M、-29M、-30M和-32M；SEQ ID NO.21針對(duì)的突變位點(diǎn)為71-72M；SEQ ID NO.22針對(duì)的突變位點(diǎn)為17M和14-15M；SEQ ID NO.23針對(duì)的突變位點(diǎn)為BEM；SEQ ID NO.24針對(duì)的突變位點(diǎn)為31M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的核酸雜交膜條，其特征在于所述的基底選自尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片或微縮磁珠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸雜交膜條，其特征在于所述突變探針在5’端或3’端進(jìn)行氨基標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的核酸雜交膜條，其特征在于所述正常探針在5’端或3’端進(jìn)行氨基標(biāo)記。
8.用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物，其特征在于所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有可與β-珠蛋白突變檢測(cè)探針(其中的一部分探針)發(fā)生特異性雜交的DNA序列，所述引物包括兩對(duì)引物，分別為SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；其中SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的擴(kuò)增產(chǎn)物可與654N和/或654M雜交，用于檢測(cè)654位點(diǎn)突變；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)除654位點(diǎn)外的其它位點(diǎn)的突變。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PCR引物，其特征在于所述引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
10.一種用于診斷β-地中海貧血的試劑盒，其特征在于它包含權(quán)利要求1所述的用于診斷β-地中海貧血的核酸雜交膜條；以及權(quán)利要求8所述的用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR反應(yīng)液；核酸雜交的反應(yīng)溫度是40℃～46℃。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于臨床診斷β－地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒。所述核酸雜交膜條包括一基底；以及固定于所述基底上的特異性探針；每一條所述的特異性探針?lè)謩e針對(duì)一個(gè)突變的β－珠蛋白基因位點(diǎn)，稱為突變探針；所述突變的β－珠蛋白基因位點(diǎn)為選自27－28M、41－42M、654M、－28M、71－72M、17M、β EM、31M、IVS1－1M、43M、－32M、－29M、－30M、14－15M、CAP、IntM和IVS1－5M的一個(gè)或一個(gè)以上的組合；其中每一條突變探針包含14至20個(gè)堿基的序列，在該堿基序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的突變的β－珠蛋白基因的突變堿基。本發(fā)明所述用于β－地中海貧血疾病診斷的核酸雜交膜條，對(duì)正常、突變雜合子、突變純合子都很容易判斷，且信號(hào)特異性非常好，可提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低成本，且易于在醫(yī)院進(jìn)行推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1718742SQ20051003401
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日
發(fā)明者曲敬, 廖生赟, 周逸, 歐陽(yáng)理 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司