專利名稱：漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法，特別涉及漏聲表面波
(leaky surface acoustic wave, LSAW )核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因快速檢測已成為臨床病原學(xué)早期診斷的 重要手段之一。核酸傳感器由于具有高效、靈敏、特異、結(jié)構(gòu)小巧、經(jīng)濟實用 等特點，將在基因快速檢測中發(fā)揮重要作用。
LSAW核酸傳感器是利用壓電晶體的特殊切向(如Y方向切割36度旋轉(zhuǎn)， X方向傳播的LiTa03晶體)激勵出LSAW，當(dāng)LSAW傳播路徑表面的質(zhì)量負載 發(fā)生微小改變即晶體表面固定的纟笨針與靶序列發(fā)生雜交反應(yīng)時，晶體表面的邊 界條件將發(fā)生改變，導(dǎo)致LSAW傳播的相位發(fā)生相應(yīng)改變，此時從傳感器輸出 換能器提取的電信號的相位變化，即可敏感地檢測出與晶體表面固定的探針發(fā) 生特異性反應(yīng)的耙序列。
科學(xué)準(zhǔn)確地進行雜交反應(yīng)起點和終點的判定，是LSAW核酸傳感器應(yīng)用于 生物醫(yī)學(xué)檢測的基礎(chǔ)。只有在正確地判斷雜交反應(yīng)起點和終點的前提下，才能 得到準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)，才能準(zhǔn)確反映數(shù)據(jù)本身代表的生物學(xué)意義，進而進行各 種分析統(tǒng)計。
在雜交反應(yīng)初始階段，探針和乾序列的結(jié)合使傳感器的質(zhì)量負載發(fā)生改變， 傳感器的相位變化增大，隨著雜交反應(yīng)的進行，探針和靶序列的結(jié)合逐漸達到 飽和，在反應(yīng)終點附近，傳感器的相位變化趨于平穩(wěn)。在^r測過程中，影響傳 感器相位變化的因素眾多，使傳感器相位曲線的形態(tài)呈多樣性表現(xiàn)，這給雜交 反應(yīng)終點的判定帶來一定的困難。此外，傳統(tǒng)的雜交反應(yīng)終點的判斷主要依靠目測，往往造成檢測結(jié)果的人為誤差，從而極大地影響了傳感器檢測結(jié)果的準(zhǔn) 確性和重復(fù)性。
文獻報道了壓電核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的兩種判定方法基于指數(shù)衰減 才莫型的最大擬合曲率法(Method-maximal curvature of fitting curve ， MCF )和反 S曲線擬合法(inverse S-fitting determination method, ISF )。 MCF法判斷結(jié)果存 在尾段飄逸現(xiàn)象，即當(dāng)雜交反應(yīng)的檢測數(shù)據(jù)末段長度不同時，結(jié)果會發(fā)生偏差， 因此，該法并不完全符合傳感器在雜交反應(yīng)中的響應(yīng)規(guī)律，這將明顯影響雜交 反應(yīng)終點的判定，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。ISF法直接采用將原檢
測數(shù)據(jù)末^a延長或刪減若干的辦法，避免了儀器和傳感器本身質(zhì)量差異、操作 方法差異等因素對終點判定的干擾，使終點判定誤差只來源于判斷模型，從而
使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性大大提高，但ISF法采用二次函數(shù)擬合，計算繁瑣復(fù)雜， 且不能在傳感器檢測過程中實時使用，使其實用性和簡便性大打折扣。
因此，建立 一種簡便快速、實時準(zhǔn)確的LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的 判定方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種簡便快速、實時準(zhǔn)確的LSAW核酸 傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法，可以避免目測判定中主觀因素造成的人為誤 差，極大地提高傳感器檢測的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度。
為達到此目的，本發(fā)明的LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法，當(dāng) 傳感器采集的相位值在第(n-9)分鐘至第n分鐘內(nèi)的相位變化差值不超過0.2deg 時，則判定第n分鐘為雜交反應(yīng)終點；其計算公式為AP= |Pn-P(n-9)|《 0.2deg,式中A戶表示相位變化差值，尸n表示第n分鐘的相位值，P(n-9)表示第(n-9) 分鐘的相位#_, n為不小于9的正整數(shù)。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明為LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定 提供了一種統(tǒng)一、客觀、科學(xué)的方法，可以避免傳統(tǒng)目測判定中主觀因素造成 的人為誤差，極大地提高傳感器的檢測準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度，且具有簡便、
4快速、實時的特點，有著重要的實際應(yīng)用價值，為后期自動判讀軟件的編寫和傳感器的臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。


圖1為LSAW核酸傳感器對HPV基因的實時檢測結(jié)果；圖2為LSAW核酸傳感器對陰性對照實驗的實時檢測結(jié)果。
具體實施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述。一、實驗材料
1、 雙端對諧4展型LSAW傳感器
在同 一塊LiTa03晶體上制備檢測和參比兩個通道，每個通道由一個LSAW諧振器構(gòu)成。LiTa03晶體為Y方向切割36度旋轉(zhuǎn)、X方向傳播LSAW。金膜和LiTa03晶體之間是金屬鉻。叉指換能器是用真空鍍膜的方法先在基片表面鍍制一層金屬膜，再利用光刻技術(shù)刻出叉指電極的圖形。
2、 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及相位記錄分析軟件
使用多功能網(wǎng)絡(luò)分析儀(日本ADVANTEST公司R3767CG型)采集實驗數(shù)據(jù)；自行研發(fā)的相位記錄分析軟件BSMS l.O具有實時記錄變化，自動繪制相位變化趨勢圖及分析結(jié)果等功能。
3、 主要試劑
人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因雙體肽核酸(bis-PNA)探針序列5'-SH-(CH2)6-(Lys)3-ttttcttcct-(egl)3陽tccttctttt-Lys-3， ( SH為5克基，Lys為賴氨酉吏，egl為linker分子)，由成都川抗派德生物醫(yī)藥科技有限公司合成。
pBR322-HPV18質(zhì)粒購自ATCC公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自博大泰克公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；限制性核酸內(nèi)切酶￡coR I購自TaKaRa公司。PBS》爰沖液Na+濃度為20mmol/L, pH為6.6,含有濃度為lmmol/L的乙二胺四乙酸。piranha液將質(zhì)量百分濃度為30%的過氧化氫和濃112804按體積比為1 : 3混勻即得。
二、實-驗方法
1、 LSAW傳感器晶振金膜表面的預(yù)處理
在LiTa03晶振金膜表面滴加少許piranha液，浸泡10分鐘，超純7jc反復(fù)清洗，再依次用濃度為lmol/L的NaOH和濃度為lmol/L的HC1各浸泡10分鐘，超純水反復(fù)清洗，氮氣吹干，備用。
2、 LSAW傳感器的穩(wěn)定性檢測
將預(yù)處理后的LSAW傳感器以同軸電纜線聯(lián)入多功能網(wǎng)絡(luò)分析儀，室溫下檢測兩個諧振器的插入損耗，將兩個諧振器的插入損耗調(diào)整至最小。
3、 LSAW傳感器對HPV基因的實時^r測
(1) HPV基因的抽提pBR322-HPV18質(zhì)粒含有HPV基因，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pBR322-HPV18質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用￡coR I酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒切膠回收純化HPV基因，具體操作按試劑盒說明書進行。
(2) HPV基因bis-PNA探針的固定將LSAW傳感器在空氣中穩(wěn)定30分鐘后，檢測通道和參比通道各加入PBS緩沖液2(VL,穩(wěn)定30分鐘，檢測通道再加入終濃度為2pmol/L的HPV基因bis-PNA探針5pL，室溫下反應(yīng)1小時使探針固定在金膜表面，吸干溶液，去離子水清洗3次，氮氣吹干，備用。參比通道不固定任何探針。
(3 ) HPV基因的實時檢測將固定有HPV基因bis-PNA探針的LSAW傳感器在空氣中穩(wěn)定至平衡，檢測通道和參比通道各加入PBS緩沖液20pL，穩(wěn)定10分鐘，再各加入終濃度為100嗎/L的HPV基因25pL進行雜交反應(yīng)，同時進行陰性對照實驗(兩通道各力。入PBS緩沖液25pL),計算機自動采集兩個通道的相位變化數(shù)據(jù)。三、實驗結(jié)果及雜交反應(yīng)終點的判定
在雜交反應(yīng)初始階段，探針和耙序列的結(jié)合使傳感器的質(zhì)量負載發(fā)生改變， 傳感器的相位變化增大，隨著雜交反應(yīng)的進行，探針和靶序列的結(jié)合逐漸達到 飽和，在反應(yīng)終點附近，傳感器的相位變化趨于平穩(wěn)，提示雜交反應(yīng)完成，這 為雜交反應(yīng)終點的判定提供了特征性指標(biāo)。從理論上講，當(dāng)雜交反應(yīng)達到平衡 時，傳感器釆集到的相位信號應(yīng)該穩(wěn)定不變，也就是說，在單位時間內(nèi)相位變 化值應(yīng)該為零。但實際上，由于傳感器在反應(yīng)終點附近采集到的相位信號受自 身系統(tǒng)噪聲、檢測環(huán)境等多種因素的影響，在現(xiàn)有技術(shù)條件下還不能保證反應(yīng)
終點的相位變化值為零。因此，本發(fā)明引入某時間段內(nèi)相位變化差值(AP)的 概念來判定雜交反應(yīng)的終點。選擇適當(dāng)?shù)闹捣秶鳛殡s交反應(yīng)終點的判定標(biāo) 準(zhǔn)極為重要，如杲此標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定過低，則雜交反應(yīng)已完成卻不能及時判定終點， 從而使檢測時間過長，降低工作效率，無法達到快速檢測的目的。相反，如果 此標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定過高，則雜交反應(yīng)還未完成時就被錯誤地判定為到達終點，從而影
響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
為了獲得LSAW核酸傳感器的本底相位變化值，發(fā)明人重復(fù)進行了多次陰 性對照實驗，即在LSAW傳感器表面固定HPV基因bis-PNA探針，待傳感器在 氣相中的相位變化平穩(wěn)后，再加入PBS緩沖液，由于沒有相應(yīng)的耙序列與HPV 基因bis-PNA纟笨針發(fā)生雜交反應(yīng)，故傳感器采集到的相位信號為傳感器在氣相 和液相中的本底相位變化值。實驗結(jié)果顯示，以均值土2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(^±2SD) 計，LSAW核酸傳感器在氣相和液相中的本底相位變化值不超過0.2deg。根據(jù) 上述實驗結(jié)果，最終確定當(dāng)傳感器采集的相位值在第(n-9)分鐘至第n分鐘內(nèi) 的相位變化差值不超過0.2(16§時，則判定第n分鐘為雜交反應(yīng)終點；其計算公 式為/\尸=l尸。-尸(n-9)1《0.2deg，式中A戶表示相位變化差值，尸 表示第n 分鐘的相位值，P(n-9)表示第(n-9)分鐘的相位值，n為不小于9的正整數(shù)。
根據(jù)上述計算公式，發(fā)明人編寫了 LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的自動 判讀軟件，并將其嵌入MATLAB程序中，實現(xiàn)了雜交反應(yīng)終點的簡便快速、實時準(zhǔn)確判定。在才全測過程中，傳感器每采集1次相位值尸t,都會與9分鐘前采 集的相位值尸(t-9)進行比較，即第11分鐘的相位值與第2分鐘的相位值進行比較，
第12分鐘的相位值與第3分鐘的相位值進行比較，以此類推，當(dāng)?shù)?n-9)分鐘至 第n分鐘內(nèi)的AiM直不超過0.2deg時，即判定雜交反應(yīng)到達終點，系統(tǒng)指示燈 變成綠色并自動鳴笛報警。
圖1為LSAW核酸傳感器對HPV基因的實時檢測結(jié)果，其中A為傳感器 采集的原始相位信號，B為原始相位信號的擬合曲線，C為AP值變化曲線；可 見在雜交反應(yīng)過程中A/M直呈逐漸減小趨勢，在反應(yīng)至第50分鐘時，第41分鐘 至第50分鐘內(nèi)的AP值不超過0.2deg,判定第50分鐘為雜交反應(yīng)終點。圖2 為LSAW核S吏傳感器對陰性對照實驗的實時檢測結(jié)果，其中A為傳感器采集的 原始相位信號，B為原始相位信號的擬合曲線，C為AP值變化曲線；可見傳感 器在氣相和液相中的本底相位變化值不超過0.2deg, A戶值不超過0.2deg。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管 通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1、漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法，其特征在于當(dāng)傳感器采集的相位值在第(n-9)分鐘至第n分鐘內(nèi)的相位變化差值不超過0.2deg時，則判定第n分鐘為雜交反應(yīng)終點；其計算公式為ΔP＝|Pn-P(n-9)|≤0.2deg，式中ΔP表示相位變化差值，Pn表示第n分鐘的相位值，P(n-9)表示第(n-9)分鐘的相位值，n為不小于9的正整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種漏聲表面波核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定方法，當(dāng)傳感器采集的相位值在第(n-9)分鐘至第n分鐘內(nèi)的相位變化差值不超過0.2deg時，則判定第n分鐘為雜交反應(yīng)終點；其計算公式為ΔP＝|P_n-P_(n-9)|≤0.2deg，式中ΔP表示相位變化差值，P_n表示第n分鐘的相位值，P_(n-9)表示第(n-9)分鐘的相位值，n為不小于9的正整數(shù)；本發(fā)明為LSAW核酸傳感器雜交反應(yīng)終點的判定提供了一種統(tǒng)一、客觀、科學(xué)的方法，可以避免傳統(tǒng)目測判定中主觀因素造成的人為誤差，極大地提高傳感器的檢測準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度，且具有簡便、快速、實時的特點，有著重要的實際應(yīng)用價值，為后期自動判讀軟件的編寫和傳感器的臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號C12M1/34GK101633891SQ200910104730
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者府偉靈, 張立群, 王云霞, 鳴 陳 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院