專利名稱：核酸脈沖雜交法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸雜交方法領(lǐng)域，是一種核酸脈沖雜交法，特別適用于核酸的分析檢測(cè)。
一般情況下，兩條單鏈核酸(包括DNA雙鏈變性后產(chǎn)生的兩條單鏈DNA，單鏈RNA和人工合成的單鏈寡核苷酸，以及人工合成的PNA)的堿基序列具有同源性時(shí)，在適宜的條件(如pH，鹽濃度，溫度，單鏈核酸的終濃度等)下，同源堿基之間可以配對(duì)形成氫鍵而恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為核酸的雜交(當(dāng)兩單鏈DNA是由一DNA變性產(chǎn)生時(shí)，該過(guò)程又被稱為核酸的復(fù)性)。目前，核酸的雜交反應(yīng)被廣泛用于檢測(cè)某樣品中是否含有以及含有多少特定序列核酸片段(常稱為目的片段)。待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因組DNA、RNA或cDNA及其片段。
核酸雜交一般是按下述方法進(jìn)行的1.制備一段與目的片段堿基序列互補(bǔ)的核酸片段(可以是RNA片段、寡和苷酸片段、cDNA片段、或DNA片段)，該片段被稱為探針；2.采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)跡方法(如缺口平移法，隨機(jī)引物標(biāo)記法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法以及RNA聚合酶促標(biāo)記法等)將探針上標(biāo)上放射性標(biāo)記物(32P，125I，35S等)或非放射性標(biāo)記物(地高辛，生物素，熒光素，堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶等)；3.使一定濃度的單鏈探針(若為雙鏈需變性成為單鏈)和單鏈目的片段(若為雙鏈需變性成為單鏈)在合適的pH值、鹽濃度緩沖液中保持良好的接觸，(二者可以處于同一物項(xiàng)中也可以處于不同物項(xiàng)中)。在恒定溫度(通常選擇低于探針與目的片段所形成雙鏈雜交體的解鏈溫度15-25℃范圍內(nèi)的某個(gè)溫度，使二者進(jìn)行一定時(shí)間(根據(jù)二者濃度情況，時(shí)間可長(zhǎng)可短)的雜交反應(yīng)；4.根據(jù)標(biāo)記物的不同，選用不同的方法(如放射自顯影、化學(xué)發(fā)光法以及顯色法等)來(lái)檢測(cè)是否有雜交體生成或生成多少雜交體。由雜交體的有無(wú)或多少就可以間接推知待測(cè)樣本中是否含有或含有多少目的片段。
在具體應(yīng)用中，又派生出不同類型的許多方法。依據(jù)目的片段和探針是否處于同一物相中將這些方法分為固相雜交法和液相雜交法兩類。
1.固相雜交法該法又可以分為膜上印跡雜交法和原位雜交法兩類。
膜上印跡雜交法是指將待測(cè)核酸序列片段結(jié)合到一定的固相支持物(常用的有硝酸纖維素膜和尼龍膜等)上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法，其操作基本流程是首先用凝膠電泳方法將待測(cè)核酸片段分離，然后用印跡技術(shù)將分離的片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上，轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來(lái)的相對(duì)位置不變。再用標(biāo)記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段在恒定溫度(通常在低于雜交體解鏈溫度Tm15-25℃范圍內(nèi))下進(jìn)行雜交。最后洗去未雜交的游離的探針?lè)肿樱ㄟ^(guò)放射自顯影、化學(xué)發(fā)光、顯色等檢測(cè)方法顯示標(biāo)記的探針的位置，由于探針已與待測(cè)核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針?lè)肿语@示的位置及其量的多少，則反映出待測(cè)核酸分子中是否存在相應(yīng)的基因序列及其量的大小。根據(jù)核酸品種不同，又可以分為Southern印跡法(Southern-blotting)和Northern印跡法(Northern-blotting)。前者是指將電泳分離的DNA片段從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程；后者是指RNA的印跡過(guò)程。核酸從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的轉(zhuǎn)移方法主要有虹吸轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法以及真空轉(zhuǎn)移法等。核酸樣品也可以不經(jīng)電泳分離而直接點(diǎn)于固相支持物上(省去了轉(zhuǎn)移過(guò)程)進(jìn)行雜交，稱為斑點(diǎn)印跡法(dot-blotting)或狹縫印跡法(slit-blotting)。
原位雜交法特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法稱為原位雜交。核酸的原位雜交可根據(jù)其檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)其所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可以分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。但不論那種雜交都必須經(jīng)過(guò)組織細(xì)胞的固定、預(yù)雜交、雜交、沖洗等一系列步驟及放射自顯影或免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果。這些具體步驟中，組織切片或細(xì)胞涂片要經(jīng)過(guò)多種有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物處理，經(jīng)歷變性、復(fù)性等溫度變化。
原位雜交的特異性依賴于探針的結(jié)構(gòu)、雜交溫度、pH、以及雜交液中甲酰胺和鹽離子的濃度。雜交溫度在37℃-60℃范圍內(nèi)選取，但在整個(gè)雜交過(guò)程中溫度是恒定不變的。
2.液相雜交液相雜交是將待檢測(cè)的核酸樣品和已標(biāo)記的探針同時(shí)溶于雜交緩沖液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后用適當(dāng)?shù)氖侄畏蛛x雜交體雙鏈和未雜交的標(biāo)記探針，通過(guò)對(duì)雜交體上標(biāo)記物的檢測(cè)而完成對(duì)待檢樣品的定性、定量分析。在進(jìn)行液相雜交時(shí)，要根據(jù)探針的種類(DNA或RNA)和欲檢測(cè)的核酸樣品的種類(DNA，RNA)濃度的不同，具體設(shè)計(jì)雜交反應(yīng)的條件，采用不同的分離雜交體雙鏈的方法。其中有效的分離雜交體雙鏈和未雜交探針的方法是液相雜交的核心所在，目前采用的方法主要有層析法，電泳法，酶聯(lián)法等。結(jié)果的測(cè)定則根據(jù)探針的標(biāo)記物的不同而采用不同的方法放射自顯影，液閃記數(shù)以及顯色或化學(xué)發(fā)光等。
為了在盡可能短的時(shí)間內(nèi)獲得靈敏、專屬、重現(xiàn)性好的雜交結(jié)果，人們?cè)诰唧w應(yīng)用上述核酸雜交方法時(shí)，根據(jù)需要，又派生出了一系列方法，這些方法在原理上都基本相同，所不同之處只是采用不同的反應(yīng)條件，這些條件的主要區(qū)別為*所用雜交緩沖液的組成不同(配置雜交緩沖液所用的緩沖對(duì)不同，鹽離子來(lái)源不同，所含變性劑濃度不同)*雜交溫度不同(如在水溶液中68℃，在50％甲酰胺溶液中40℃，根據(jù)雜交嚴(yán)格性要求不同，溫度還可作適當(dāng)調(diào)整)。
*雜交體系的體積和雜交時(shí)間的長(zhǎng)短不同(對(duì)較大的體積雜交時(shí)間可達(dá)3天，而較小的體積雜交時(shí)間則短至4小時(shí))。
*雜交過(guò)程中攪動(dòng)的方法和程度不同(連續(xù)震蕩或靜止)。
*標(biāo)記探針的長(zhǎng)度，濃度及其比活性不同。
*是否用其他化合物，如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等來(lái)提高核酸重新結(jié)合能力。
*雜交后的清洗是否嚴(yán)格。
上述這些條件的改變，對(duì)雜交結(jié)果有不同的影響，人們需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況，選用適當(dāng)?shù)姆椒ā５?，迄今為止，人們所用雜交方法的一個(gè)共同點(diǎn)是在一個(gè)雜交過(guò)程中，隨著雜交過(guò)程的進(jìn)行雜交體系的溫度都是保持恒定不變的(我們將這類方法統(tǒng)稱為恒溫雜交方法)。由于核酸的雜交反應(yīng)包含了堿基間氫鍵形成和氫鍵解離兩類反應(yīng)，而堿基間氫鍵形成反應(yīng)的速度隨溫度升高而加快，氫鍵解離反應(yīng)速度則相反(詳見理論部分)，總的雜交反應(yīng)速度取決于反應(yīng)速度慢的一步反應(yīng)。因此在恒溫雜交法中有個(gè)最佳雜交溫度(通常認(rèn)為是在低于雜交體的解鏈溫度Tm15℃至低于雜交體的解鏈溫度Tm25℃的范圍內(nèi)的某個(gè)溫度)，此時(shí)氫鍵解離反應(yīng)和氫鍵形成反應(yīng)的速度相等，總體雜交反應(yīng)的速度最快。但此時(shí)上述氫鍵解離反應(yīng)和氫鍵形成反應(yīng)兩步反應(yīng)的速度都不夠快，因此恒溫雜交法的雜交時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低，同時(shí)雜交的特異性也不理想。
鑒于上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提出一種利用溫度脈沖變化的核酸雜交的核酸脈沖雜交法。該核酸脈沖雜交法具有雜交時(shí)間短、靈敏度高、雜交特異性好的效果。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的該核酸脈沖雜交法是在核酸雜交方法的雜交過(guò)程中，雜交溫度是脈沖變化的，其中，雜交溫度的高溫是指在低于雜交體解鏈溫度15℃至雜交體解鏈溫度范圍之間的某個(gè)溫度，而雜交溫度的低溫是指在0℃至低于雜交體解鏈溫度15℃范圍之間的某個(gè)溫度。
其中核酸雜交方法為核酸固相雜交法或核酸液相雜交法；或者核酸雜交方法為核酸固相雜交法中的薄膜印跡法或原位雜交法；或者核酸雜交方法為核酸薄膜印跡法中的斑點(diǎn)印跡法或狹縫印跡法或Southern印跡法或Northern印跡法；或者核酸雜交方法為核酸原位雜交法中的細(xì)胞涂片原位雜交法或組織切片原位雜交法；雜交溫度的脈沖時(shí)間包括溫度下降時(shí)間、低溫時(shí)間、溫度上升時(shí)間和高溫時(shí)間；雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)溫度下降時(shí)間、低溫時(shí)間、溫度上升時(shí)間到高溫時(shí)間，如附

圖1所示；或者雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)低溫時(shí)間、溫度上升時(shí)間、高溫時(shí)間到溫度下降時(shí)間，如附圖2所示；或者雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)溫度上升時(shí)間、高溫時(shí)間、溫度下降時(shí)間到低溫時(shí)間，如附圖3所示；或者雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)高溫時(shí)間、溫度下降時(shí)間、低溫時(shí)間到溫度上升時(shí)間，如附圖4所示；其中，附圖1、2、3和4分別為在每個(gè)脈沖中溫度隨時(shí)間的不同變化圖。
從總體上說(shuō)，溫度脈沖的升降溫速率太大太小都不利。速率太大，則升溫降溫速度太快，反應(yīng)體系來(lái)不及達(dá)到所需溫度，氫鍵的解離、形成反應(yīng)都進(jìn)行不徹底；而速率太小，則導(dǎo)致溫度脈沖頻率下降。但若脈沖頻率固定時(shí)，升降溫速率越小，核酸分子處于最佳雜交溫度的時(shí)間越長(zhǎng)，雜交效率也越高。高溫時(shí)間和低溫時(shí)間經(jīng)歷的時(shí)間與所選的溫度、雜交緩沖液的組成、鹽離子濃度、探針的類型與結(jié)構(gòu)等有關(guān)。通常，高溫時(shí)間經(jīng)歷的時(shí)間不應(yīng)小于在選定的反應(yīng)條件下全部ELdsDNA解鏈所需最小時(shí)間，低溫時(shí)間經(jīng)歷的時(shí)間主要取決于在選定的反應(yīng)條件下采用的低溫溫度，低溫溫度越小，低溫時(shí)間經(jīng)歷的時(shí)間可越短，但最好不短于1秒。由于單位時(shí)間內(nèi)，溫度脈沖頻率越大，雜交效率越高，因此每個(gè)脈沖所消耗的時(shí)間應(yīng)盡可能小，以便在單位時(shí)間內(nèi)獲得最大脈沖頻率。雜交時(shí)間越長(zhǎng)，脈沖次數(shù)越多，雜交效率也越高。在具體的應(yīng)用中，選擇怎樣的脈沖溫度，多長(zhǎng)的脈沖時(shí)間應(yīng)視具體的情況而定；
在脈沖雜交法中，由于反應(yīng)體系的溫度經(jīng)歷了由低到高的迅速變化過(guò)程，組成總反應(yīng)的兩步反應(yīng)的速度都有機(jī)會(huì)處于較高的速度，總的反應(yīng)速度較恒溫雜交大為增加，因此本方法所用雜交時(shí)間短，靈敏度高，雜交特異性大大增加。
脈沖雜交法的提出是得益于有關(guān)核酸雜交動(dòng)力學(xué)理論的研究進(jìn)展。核酸雜交動(dòng)力學(xué)是研究核酸雜交反應(yīng)的速率、反應(yīng)條件(如濃度、壓力、溫度、輻射、介質(zhì)、催化劑、結(jié)構(gòu)等)對(duì)反應(yīng)速率與方向的影響以及研究反應(yīng)歷程，即機(jī)理的一門科學(xué)。迄今為止，人們都是在用二級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程表述核酸雜交動(dòng)力學(xué)的，以盧圣東主編的《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》一書對(duì)核酸復(fù)性的描述為例(由于核酸的雜交與復(fù)性在本質(zhì)上都是一樣的，人們常常用核酸復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究代替核酸雜交動(dòng)力學(xué)研究)“復(fù)性過(guò)程的第一步是兩條核酸單鏈隨機(jī)碰撞形成局部雙鏈的過(guò)程(遵循二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué))。這種隨機(jī)碰撞形成的局部雙鏈?zhǔn)菚簳r(shí)的，如果此局部雙鏈周圍的堿基不能配對(duì)則會(huì)重新解離，繼續(xù)碰撞。一旦找到了正確的互補(bǔ)區(qū)，則首先形成的局部雙鏈就形成核，核兩側(cè)的順序迅速配對(duì)，形成完整的雙鏈分子。此后一步反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)過(guò)程，而第一步反應(yīng)(即成核反應(yīng))是整個(gè)過(guò)程的限速步驟，因此核酸復(fù)性的動(dòng)力學(xué)方程可以用單鏈核酸減少的二級(jí)反應(yīng)速率方程式表示-d[ssDNA]dt=k[ssDNA]2]]>”以上有關(guān)核酸雜交動(dòng)力學(xué)理論存在矛盾之處既然承認(rèn)核酸復(fù)性反應(yīng)是一個(gè)包含了許多步驟的復(fù)雜反應(yīng)而非雙分子基元反應(yīng)，那么直接利用質(zhì)量作用定律將其速率方程表述為二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程就不正確，因?yàn)橹挥谢磻?yīng)才能直接利用質(zhì)量作用定律建立其速率方程。實(shí)際上，核酸雜交的二級(jí)動(dòng)力學(xué)理論不僅在理論上存在矛盾，而且在具體應(yīng)用中對(duì)許多實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象也難以做出合理解釋。因此我們通過(guò)研究建立了一套新理論-“核酸雜交的復(fù)雜反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論”。
我們認(rèn)為核酸雜交反應(yīng)包含了兩類基元反應(yīng)一類是氫鍵形成反應(yīng)，如單鏈核酸隨機(jī)碰撞形成周圍堿基不能配對(duì)的局部雙鏈[我們將其稱為錯(cuò)配的局部雙鏈，用符號(hào)ELdsDNA(location double-stranded DNA)表示]反應(yīng)k1；單鏈核酸隨機(jī)碰撞形成周圍堿基能夠最終配對(duì)的局部雙鏈[我們用符號(hào)LdsDNA(locationdouble-stranded DNA)表示]反應(yīng)k2和局部雙鏈周圍堿基的配對(duì)反應(yīng)(拉鏈反應(yīng))k3。另一類是氫鍵解離反應(yīng)，主要是上述三類反應(yīng)的逆反應(yīng)k1′、k2′、k3′。
上述各基元反應(yīng)存在著以下關(guān)系
式中ssDNA和dsDNA分別指單鏈核酸分子和雙鏈核酸分子，LdsDNA(locationdouble-stranded DNA)和ELdsDNA(error location double-stranded DNA)都是指局部配對(duì)的雙鏈核酸分子，但前者可以繼續(xù)其堿基配對(duì)反應(yīng)而最終形成完整的雙鏈核酸分子，而后者卻不能。k1、k2、k3都是指氫鍵形成的反應(yīng)速度常數(shù)，k1′、k2′、k3′代表上述反應(yīng)之逆反應(yīng)(即氫鍵解離反應(yīng))的速度常數(shù)。實(shí)際上在上述模型中，由于k3和k3′反應(yīng)在一定條件下都屬定量完成的快速反應(yīng)，因此可將反應(yīng)的中間產(chǎn)物L(fēng)dsDNA予以忽略，①式簡(jiǎn)化成②式
其中氫鍵形成的反應(yīng)速率常數(shù)k1、k2隨溫度降低而迅速增大，氫鍵解離反應(yīng)的速率常數(shù)k1′、k2′則相反。我們認(rèn)為，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度小于解鏈溫度Tm時(shí)，由于各反應(yīng)速度常數(shù)之間存在k2＞＞k1＞＞k2′＞＞k1′的關(guān)系，變性的單鏈核酸分子在一個(gè)極短的時(shí)間內(nèi)(t*0)絕大部分經(jīng)錯(cuò)配反應(yīng)k2生成ELdsDNA，極少部分經(jīng)復(fù)性反應(yīng)k1生成dsDNA，游離的單鏈核酸分子則幾乎不存在了。隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，每當(dāng)有n個(gè)ELdsDNA經(jīng)解離反應(yīng)k2′生成2n個(gè)ssDNA時(shí)，就有2個(gè)ssDNA經(jīng)復(fù)性反應(yīng)k1生成了dsDNA，2(n-1)個(gè)ssDNA又經(jīng)錯(cuò)配反應(yīng)k2生成了新的ELdsDNA，從宏觀上看就好象是一個(gè)ELdsDNA分子經(jīng)解離反應(yīng)k2″生成了兩分子ssDNA，進(jìn)而又經(jīng)復(fù)性反應(yīng)k1生成了一個(gè)dsDNA分子。因此，宏觀上核酸的復(fù)性或雜交反應(yīng)可以用如下的連續(xù)反應(yīng)式表達(dá)式中k2″是一個(gè)綜合了k2和k2′兩個(gè)反應(yīng)的“表觀反應(yīng)速率常數(shù)”。與式②相比，上式中略去了dsDNA解離的速率常數(shù)k1′。因?yàn)樵诘陀赥m的復(fù)性或雜交溫度下，雙鏈DNA(dsDNA)解離反應(yīng)幾乎不能發(fā)生，為敘述方便將其忽略。顯然，當(dāng)溫度升高時(shí)，氫鍵解離反應(yīng)速率常數(shù)k2″增大，而氫鍵形成反應(yīng)速率常數(shù)k1減小。當(dāng)體系反應(yīng)溫度升高接近Tm時(shí)，k2″＞k1，此時(shí)k1反應(yīng)是限速反應(yīng)，當(dāng)體系溫度降低使k1＞k2″時(shí)，k2″反應(yīng)是限速反應(yīng)。當(dāng)k2″＝k1時(shí)，總體復(fù)性或雜交反應(yīng)最快，此時(shí)體系對(duì)應(yīng)的溫度就是最佳復(fù)性或雜交溫度THY。但從理論上講，此時(shí)的復(fù)性或雜交反應(yīng)速度仍有可能大幅提高。最簡(jiǎn)單的辦法就是在核酸的復(fù)性或雜交中采用一系列高、低交變的溫度脈沖。道理很簡(jiǎn)單，可通過(guò)對(duì)②式的進(jìn)一步分析加以闡明當(dāng)我們將核酸雙鏈變性成單鏈以后，就將溫度以一定斜率降至室溫(T1)并保持一定時(shí)間，這期間將主要發(fā)生堿基配對(duì)反應(yīng)k2和k1，得到ELdsDNA和dsDNA兩種產(chǎn)物，但以前者為主。然后再將此復(fù)性或雜交體系的溫度以一定斜率升高至接近dsDNA解鏈溫度Tm的某一溫度(T2)，并保持一定的時(shí)間，這個(gè)過(guò)程中將主要發(fā)生k2′反應(yīng)，即ELdsDNA又重新解離為ssDNA，而dsDNA在此時(shí)還很穩(wěn)定，不會(huì)解離。接著再將復(fù)性或雜交體系的溫度由T2降至T1，則經(jīng)k2′反應(yīng)產(chǎn)生的ssDNA又將發(fā)生k2反應(yīng)和k1反應(yīng)而生成新的ELdsDNA和dsDNA兩種產(chǎn)物。這樣由于dsDNA的高穩(wěn)定性，每次脈沖dsDNA的量都有新的增加，而ELdsDNA的量卻不斷減少。經(jīng)過(guò)一系列由T1→T2→T1…的溫度脈沖后，雜交體dsDNA的濃度將在短時(shí)間內(nèi)不斷累加而產(chǎn)生高效復(fù)性或雜交。
與經(jīng)典的恒溫雜交相比，在單位時(shí)間內(nèi)，這種人為的高低溫交變的雜交方式獲得的雜交效率將明顯高于前者，同時(shí)由于每個(gè)脈沖的高溫都較恒溫雜交的溫度高許多，因而其非特異雜交也比經(jīng)典的恒溫雜交顯著降低。該方法不僅適用于液相雜交，對(duì)于固相雜交也同樣適用。對(duì)薄膜雜交和原位雜交二者而言，雖然變性后的目的片段被固定在固相支持物上，但探針與目的片段的雜交歷程與液相雜交是相似的。所不同的是此時(shí)的雜交反應(yīng)發(fā)生在二相的界面處。當(dāng)探針與目的片段形成不正確配對(duì)時(shí)，這些與界面上目的片段結(jié)合的探針并不能馬上解離，由于空間位阻的原因，這將會(huì)阻礙其他探針與其鄰近目的片段的結(jié)合復(fù)性。同時(shí)由于雜交液中只存在較高濃度探針，在雜交溫度下，其自身的錯(cuò)配、扭曲也會(huì)減少有效探針濃度。因此，脈沖雜交法對(duì)提高薄膜雜交、原位雜交效率也將是明顯有效的。
由于在各類核酸雜交法中，薄膜印跡法和原位雜交法以及液相雜交法三者之間彼此差別較大，下面結(jié)合實(shí)施例分別對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述1.薄膜雜交法在涉及雜交反應(yīng)部分，斑點(diǎn)，Southern，Northern等雜交方法具有極大相似性。由于斑點(diǎn)雜交法影響因素少，應(yīng)用普遍，故選取斑點(diǎn)雜交作為實(shí)施例更具代表性。我們采用30bp的寡核苷酸探針(5′-pTTG GGT AAC GCC AGG GTT TTC CCAGTC ACG-3′)，用脈沖雜交法和恒溫雜交法對(duì)點(diǎn)在尼龍膜上的相同濃度系列的目的片段(超螺旋PUC180 DNA)，用相同的雜交緩沖液和探針濃度進(jìn)行了對(duì)比斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，具體方法如下探針的標(biāo)記按照地高辛-3’末端標(biāo)記試劑盒(DIG-3′end Oligonucleotide LabledKit)說(shuō)明書提供的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)30bp寡核苷酸的3’末端進(jìn)行了地高辛標(biāo)記，獲得地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針。
點(diǎn)樣1.吸取目的片段溶液1微升置0.5毫升微量離心管中，加入0.4摩爾濃度NaOH，10毫摩爾濃度EDTA溶液至終體積為100微升，(含目的片段5納克/毫升)，96℃充分變性10分鐘。
2.將變性液用含10毫摩爾濃度EDTA的0.4摩爾濃度NaOH溶液按比例稀釋成如下濃度系列(單位皮克/微升)125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9。
3.將Zeta-probe GT膜在雙蒸水中浸濕。
4.將濕的Zeta Probe GT膜置于真空點(diǎn)樣器上，擰緊緊固螺絲，確保各樣品孔間不會(huì)產(chǎn)生交叉滲漏。
5.在每一點(diǎn)樣孔中加入0.5毫升TE緩沖液，真空抽盡溶液后關(guān)閉真空泵。
6.將樣品溶液各取1微升加至0.5毫升0.4摩爾濃度NaOH，10毫摩爾濃度EDTA溶液中混勻，然后分別將溶液全部加入相應(yīng)的點(diǎn)樣孔，打開真空泵至溶液剛好抽干關(guān)閉泵。
7.每孔再加0.5毫升0.4摩爾濃度NaOH，10毫摩爾濃度EDTA溶液，抽真空使完全干后關(guān)閉泵。
8.使系統(tǒng)連通大氣后，拆下點(diǎn)樣器，取出膜在2×SSC緩沖液中浸泡一下，在空氣中涼干，然后置80℃烘烤1小時(shí)，備用。
9.接同樣方法再點(diǎn)數(shù)張含如下梯度量目的片段的膜500皮克，100皮克，50皮克，10皮克，5皮克，1皮克，用于方法比較。
預(yù)雜交1.將固定有相同含量單鏈目的片段的兩張膜A和B分別置于大小適當(dāng)?shù)腁和B兩個(gè)塑料袋中。
2.分別向每個(gè)袋中加入5毫升預(yù)雜交緩沖液，然后68℃水浴保溫5分鐘。
雜交1.將兩袋分別剪去一角，傾出預(yù)雜交液，再換加1毫升新的預(yù)雜交液。
2.分別向兩袋中加入50微升探針溶液(雜交液中探針終濃度為50皮摩爾/毫升)，混勻。
3.將A袋實(shí)施脈沖雜交法先在70℃水浴中保溫一定時(shí)間(5-10分鐘)，然后取出，置20℃水浴中保溫一定時(shí)間(5-10分鐘)，再取出置70℃水浴中保溫，如此反復(fù)n次(n個(gè)脈沖)。
4.將B袋實(shí)施恒溫雜交法置55℃水浴中保溫3小時(shí)。
5.取出兩袋，分別剪去一角，傾出探針溶液。
洗膜1.分別向兩袋中加入等量適量的洗膜緩沖液I，洗膜30分鐘。
2.傾出洗膜緩沖液I，分別再向兩袋中加入等量適量的洗膜緩沖液II，洗膜30分鐘。
顯色將兩個(gè)袋均剪開，將兩膜取出作上標(biāo)記，按以下步驟顯色1.在適量顯色緩沖液II中洗膜1分鐘。
2.在適量顯色緩沖液III中室溫放置30分鐘。
3.用顯色緩沖液III以1∶5000比例稀釋抗DIG-AP復(fù)合物溶液(取0.5微升抗-DIG-AP復(fù)合物+2.5毫升顯色緩沖液III)。
4.將膜置上述溶液中室溫放置30分鐘。
5.將膜置適量顯色緩沖液I中洗2次，每次15分鐘。
6.將膜置適量顯色緩沖液IV中平衡2分鐘。
7.取20微升NBT/BCIP貯備液加至1毫升顯色緩沖液4中，混勻。
8.將膜置于上述新鮮配制的1毫升顯色液中暗處放置12小時(shí)，勿振搖。
9.將膜取出，置適量顯色緩沖液V中1分鐘以終止反應(yīng)。
10.將膜拍照，涼干保存。
附圖5是采用脈沖雜交法進(jìn)行斑點(diǎn)雜交的結(jié)果。圖中1-6數(shù)字表示點(diǎn)在雜交膜上的目的片段的量分別為125pg，62.5pg，31.2pg，15.6pg，7.8pg，3.9pg。所用溫度脈沖雜交法是使雜交膜在2小時(shí)內(nèi)經(jīng)歷6個(gè)溫度脈沖，每個(gè)溫度脈沖是在20℃經(jīng)歷9分鐘低溫時(shí)間，然后經(jīng)歷3分鐘的升溫時(shí)間，使溫度由20℃上升至70℃，接著是在70℃經(jīng)歷7分鐘高溫時(shí)間，然后又經(jīng)歷1分鐘的降溫時(shí)間，使溫度從70℃重新回到20℃。附圖6是采用恒溫雜交法進(jìn)行斑點(diǎn)雜交的結(jié)果。圖中1-6數(shù)字表示的意義與附圖5相同。所用恒溫雜交法是使雜交膜在55℃保溫3小時(shí)。二者雜交的其他條件都一樣用5ml預(yù)雜交液(7％SDS，0.5MNa2HPO4，pH7.2)在68℃預(yù)雜交5分鐘；使用1ml雜交緩沖液(50pmol/ml探針，7％SDS，0.5MNa2HPO4，pH7.2)；雜交后用5％SDS，40mMNa2HPO4，pH7.2的洗膜緩沖液洗膜30分鐘，用1％SDS，40mMNa2HPO4，pH7.2的洗膜緩沖液洗膜30分鐘，然后采用抗DIG-AP，NBT/BCIP顯色法顯色。附圖5和附圖6顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用脈沖雜交法雜交2小時(shí)共6個(gè)脈沖的信噪比及檢測(cè)靈敏度明顯高于采用恒定溫度雜交3小時(shí)的結(jié)果，而且雜交背景也低于后者。前者對(duì)于低至3.9皮克目的片段可以檢出，而后者的最低檢出限為31.2皮克。因此，與恒溫雜交法相比，脈沖雜交法在提高斑點(diǎn)雜交的雜交效率、降低雜交背景方面具有十分顯著的效果，可以在較短的雜交時(shí)間內(nèi)獲得更高的檢出靈敏度。附圖7A是采用較高溫度脈沖頻率(6個(gè)脈沖/小時(shí))時(shí)進(jìn)行2小時(shí)的溫度脈沖斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，附圖7B是采用較低溫度脈沖頻率(3個(gè)脈沖/小時(shí))時(shí)進(jìn)行2小時(shí)的溫度脈沖斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。兩者雜交的其他條件完全一樣。附圖7C是采用較高升降溫速率(升溫1.11℃/秒，降溫1.83℃/秒)時(shí)進(jìn)行2小時(shí)6個(gè)脈沖的溫度脈沖斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，附圖7D是采用較低升降溫速率(升溫0.67℃/秒，降溫0.91℃/秒)時(shí)進(jìn)行2小時(shí)6個(gè)脈沖的溫度脈沖斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。兩者雜交的其他條件完全一樣。從圖7A與7B的比較中可以看出，在進(jìn)行溫度脈沖雜交法時(shí)，在一定條件下，高頻率脈沖可獲得較高雜交靈敏度。從圖7C與7D的比較中可以看出，在進(jìn)行溫度脈沖雜交法時(shí)，在一定條件下，較低的升降溫速率(較長(zhǎng)的升降溫時(shí)間)可獲得較高雜交靈敏度。
2.原位雜交法我們選擇4微米的小鼠脊椎石蠟包埋切片，用DIG標(biāo)記的166bp的RNA探針?lè)謩e采用脈沖雜交法和恒溫雜交法進(jìn)行了RNA-RNA原位雜交以檢測(cè)其中的脂質(zhì)蛋白(PLPproteolipid protein)mRNA。具體步驟如下；探針的標(biāo)記將克隆有PLPmRNA的cDNA片段的SP6表達(dá)載體按照DIG-RNA標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書中提供的標(biāo)準(zhǔn)方法制備PLP mRNA的DIG標(biāo)記的RNA探針。
切片的預(yù)處理1.用二甲苯和不同濃度系列乙醇溶液對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理。
2.用4％多聚甲醛(溶于100毫摩爾濃度磷酸緩沖液中)固定20分鐘。
3.將切片在TBS緩沖液中清洗3-5次。
4.用200毫摩爾濃度HCl處理切片10分鐘以使蛋白變性。
5.將切片在TBS緩沖液中清洗3-5次。
6.為減小非特異背景，將切片浸入0.5％的乙酸酐的100毫摩爾濃度Tris(pH8.0)溶液中在磁力攪拌器上徹底攪拌10分鐘。
7.將切片在TBS緩沖液中清洗3-5次。
8.將切片用蛋白酶K 100微克/毫升的含2毫摩爾濃度氯化鈣的TBS溶液在37℃處理20分鐘。
9.將切片在TBS緩沖液中清洗3-5次。
10.將切片浸入4℃的TBS(pH7.5)中5分鐘，以終止蛋白酶K的消化反應(yīng)。
11.將切片在50％、70％、95％乙醇中梯度脫水。
12.將切片在氯仿中清洗一下。
雜交
1.將切片置溫盒中55℃保溫30分鐘。
2.制備如下的雜交緩沖液2×SSC10％硫酸葡聚糖0.01％鮭魚精DNA0.02％SDS50％甲酰胺3.將標(biāo)記好的反義RNA探針用適量雜交緩沖液按1∶4比例稀釋。將稀釋好的探針溶液按10微升/平方厘米的量加到切片上，蓋上蓋玻片，然后用橡皮泥密封。
4.將切片加熱到95℃保溫4分鐘。
5.恒溫雜交將玻片置溫盒中72℃保溫6小時(shí)。
脈沖雜交將玻片置溫盒中80℃，15分鐘，40℃，15分鐘，共8個(gè)脈沖，4小時(shí)。
顯色1.將切片在2×SSC中浸泡過(guò)夜。
2.用50％的去離子甲酰胺的1×SSC溶液55℃洗切片3次。
3.用1×SSC室溫洗切片2次，每次15分鐘。
4.將切片在TBS緩沖液中清洗3-5次。
5.將切片在含10％小牛血清的封閉液中浸15分鐘。
6.將切片在用抗DIG-AP復(fù)合物的封閉液中浸60分鐘。
7.將切片在TBS緩沖液中清洗3-5次。
8.將切片浸入NBT/BCIP顯色劑中，4℃暗處放置至顯出合適顏色。
9.將切片在水中清洗數(shù)次終止反應(yīng)。
10.顯微鏡下觀察并拍照。
附圖8是采用恒溫雜交法進(jìn)行小鼠脊椎組織切片原位雜交的結(jié)果。圖中S表示雜交信號(hào)。所用恒溫雜交法是使切片在72℃保溫6小時(shí)。附圖9是采用脈沖雜交法進(jìn)行小鼠脊椎組織切片原位雜交的結(jié)果。圖中S表示雜交信號(hào)。所用溫度脈沖雜交法是使切片在4小時(shí)內(nèi)經(jīng)歷8個(gè)溫度脈沖，每個(gè)溫度脈沖是先經(jīng)歷5分鐘的降溫時(shí)間，使溫度從高溫回到37℃。然后在37℃經(jīng)歷10分鐘低溫時(shí)間，然后經(jīng)歷6分鐘的升溫時(shí)間，使溫度由37℃上升至80℃，接著是在80℃經(jīng)歷9分鐘高溫時(shí)間。二者雜交的其他條件都一樣。由附圖8和附圖9的比較可知，用脈沖雜交法進(jìn)行原位雜交，可以較恒溫雜交法明顯縮短雜交時(shí)間，提高雜交效率。從采用脈沖雜交法的切片上可以觀察到更多、更清晰的雜交信號(hào)。
3.液相雜交液相雜交的關(guān)鍵在于選用怎樣的分離方法將雜交體與未雜交探針?lè)蛛x開。本實(shí)施例采用硝酸纖維素薄膜層析方法來(lái)分離雜交體與未雜交的探針。與紙色譜相似，硝酸纖維素薄膜層析是以硝酸纖維素作為載體，以硝酸纖維素上吸附的水分作為固定相，流動(dòng)相可以是不與水相混溶的有機(jī)溶劑，也可以用與水相混溶的溶劑為流動(dòng)相。因?yàn)橄跛崂w維素吸附的水分中的一部分通過(guò)氫鍵與纖維素上的羥基結(jié)合成復(fù)合物，這部分水同與水相混溶的試劑仍能形成類似不相混溶的兩相。本研究中是將膜先在4×SSC緩沖液中浸泡5分鐘。然后涼干，因此固定相實(shí)際上是與水混溶的4×SSC緩沖液，流動(dòng)相是水∶異丙醇(1.5∶1)系統(tǒng)。由于單鏈核酸分子的極性略大于雙鏈分子，前者更傾向于留在固定相中，而后者則相反。這種表現(xiàn)在分配系數(shù)上的微小差別，隨著色譜過(guò)程的進(jìn)行，二者在固定相和流動(dòng)相中不斷地重新分配，原本微小的差別經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的重復(fù)，微小的差異累積起來(lái)就變成了大的差異，其結(jié)果就是雙鏈核酸的斑點(diǎn)比單鏈核酸的斑點(diǎn)移動(dòng)更快。具體方法如下雜交1.選取線性化的PBR 328 DNA為目的片段，以目的片段為模板，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的隨機(jī)引物標(biāo)記法制備DIG標(biāo)記DNA探針。
2.吸取適量的目的片段溶液和探針溶液加至10×SSC緩沖液中，加適量水調(diào)整各組分終濃度為40皮克/微升目的片段，10皮克/微升探針，2×SSC雜交緩沖液。
3.將上管震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3秒，置于PCR儀中，先96℃變性10分鐘，然后60℃保溫80分鐘(恒溫雜交法)或70℃，5分鐘(37℃，5分鐘，共4個(gè)或8個(gè)脈沖(脈沖雜交法)。
層析1.吸取雜交溶液1微升分別在一經(jīng)4×SSC浸泡15分鐘涼干后的大小適中的硝酸纖維素膜的距底邊1厘米的地方點(diǎn)樣，自然涼干。
2.將點(diǎn)好樣的硝酸纖維素膜掛在裝有適量展開劑(H2O∶異丙醇∶丁醇＝60∶1∶4)的層析缸中，密閉放置2小時(shí)，使膜被展開劑的蒸汽充分飽和，達(dá)到平衡后，將膜的底邊小心浸入展開劑中，注意勿使點(diǎn)樣原點(diǎn)直接接觸展開劑。
3.然后密閉展開30分鐘，當(dāng)展開劑前沿接近膜上端時(shí)，將膜取出，標(biāo)記前沿，涼干。
4.將膜置干燥箱中80℃保溫1小時(shí)，使展開的斑點(diǎn)固定在膜上。
顯色1.在適量顯色緩沖液II中洗膜1分鐘。
2.在適量顯色緩沖液III中室溫放置30分鐘。
3.用顯色緩沖液III以1∶5000比例稀釋抗DIG-AP復(fù)合物溶液(0.5微升抗-DIG-AP復(fù)合物+2.5毫升顯色緩沖液III)4.將膜置上述溶液中室溫放置30分鐘。
5.將膜置適量顯色緩沖液I中洗2次，每次15分鐘。
6.將膜置適量顯色緩沖液IV中平衡2分鐘。
7.取20微升NBT/BCIP貯備液加至1毫升顯色緩沖液IV中，混勻。
8.將膜置于上述新鮮配制的1毫升顯色液中暗處放置12小時(shí)，勿振搖。
9.將膜取出，置適量顯色緩沖液V中終止反應(yīng)1分鐘。
10.將膜拍照，涼干保存。
附圖10是采用恒溫雜交法和脈沖雜交法進(jìn)行液相雜交效果的比較。通道1所點(diǎn)樣品為40pg/ul目的片段與10pg/ul探針在2×SSC雜交緩沖液中液相60℃恒溫雜交80分鐘后的產(chǎn)物；通道2所點(diǎn)樣品為不含目的片段的陰性對(duì)照；通道3所點(diǎn)樣品為同等濃度目的片段和探針在同樣的雜交緩沖液中采用溫度脈沖雜交法在40分鐘內(nèi)進(jìn)行4個(gè)脈沖雜交的產(chǎn)物，每個(gè)溫度脈沖是先經(jīng)歷35秒鐘的降溫時(shí)間，使溫度從高溫回到37℃，然后在37℃經(jīng)歷4.4分鐘低溫時(shí)間，然后經(jīng)歷20秒鐘的升溫時(shí)間，使溫度由37℃上升至76℃，接著是在76℃經(jīng)歷4.6分鐘高溫時(shí)間。通道4所點(diǎn)樣品為同等條件下進(jìn)行8脈沖雜交的產(chǎn)物。各樣品進(jìn)行液相雜交以及檢測(cè)的其他條件(包括層析、顯色等條件)都相同。采用脈沖雜交法的樣品雜交效率較高而產(chǎn)生更多的雜交體(圖中用D表示的雜交體斑點(diǎn)顏色更深，圖中的S表示未雜交的單鏈探針產(chǎn)生的斑點(diǎn))。因此，用脈沖雜交法進(jìn)行液相雜交，同樣可以較恒溫雜交法明顯縮短雜交時(shí)間，提高雜交效率。
其中，上述實(shí)施例所用部分溶液的組成如下1.預(yù)雜交緩沖液7％SDS0.5M Na2HPO4，pH7.2(20℃)2.洗膜緩沖液I 5％SDS40mM Na2HPO4，pH7.2(20℃)3.洗膜緩沖液II1％SDS40mM Na2HPO4，pH7.2(20℃)4.20×SSC 88.2g/L枸櫞酸鈉175.3g/L氯化鈉，pH7.0(20℃)5.顯色緩沖液I 0.1M順丁烯二酸1M NaCl，pH7.5(20℃)6.顯色緩沖液II含0.3％(w/v)Tween-20的顯色緩沖液I。7.顯色緩沖液III含1％封閉劑的顯色緩沖液I。8.顯色緩沖液IV100mM Tris-HCl100mMNaCl50mmMgCl2，pH9.5(20℃)9.顯色緩沖液V10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0(20℃)
權(quán)利要求
1.一種核酸脈沖雜交法，其特征在于核酸雜交方法的雜交過(guò)程中，雜交溫度是脈沖變化的，其中，雜交溫度的高溫是指在低于雜交體解鏈溫度15℃至雜交體解鏈溫度范圍之間的某個(gè)溫度，而雜交溫度的低溫是指在0℃至低于雜交體解鏈溫度15℃范圍之間的某個(gè)溫度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于核酸雜交方法為核酸固相雜交法或核酸液相雜交法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于核酸雜交方法為核酸固相雜交法中的薄膜印跡法或原位雜交法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于核酸雜交方法為核酸薄膜印跡法中的斑點(diǎn)印跡法或狹縫印跡法或Southern印跡法或Northern印跡法。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于核酸雜交方法為核酸原位雜交法中的細(xì)胞涂片原位雜交法或組織切片原位雜交法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于雜交溫度的脈沖時(shí)間包括溫度下降時(shí)間、低溫時(shí)間、溫度上升時(shí)間和高溫時(shí)間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)溫度下降時(shí)間、低溫時(shí)間、溫度上升時(shí)間到高溫時(shí)間。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)低溫時(shí)間、溫度上升時(shí)間、高溫時(shí)間到溫度下降時(shí)間。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)溫度上升時(shí)間、高溫時(shí)間、溫度下降時(shí)間到低溫時(shí)間。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸脈沖雜交法，其特征在于雜交溫度的每個(gè)脈沖時(shí)間經(jīng)過(guò)高溫時(shí)間、溫度下降時(shí)間、低溫時(shí)間到溫度上升時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明是一種核酸脈沖雜交法,其是在核酸雜交方法的雜交過(guò)程中,雜交溫度是脈沖變化的,其中,雜交溫度的高溫是指在低于雜交體解鏈溫度15℃至雜交體解鏈溫度范圍之間的某個(gè)溫度,而雜交溫度的低溫是指在0℃至低于雜交體解鏈溫度15℃范圍之間的某個(gè)溫度。本核酸脈沖雜交法具有雜交時(shí)間短、靈敏度高、雜交特異性好的效果。本發(fā)明可用于核酸固相雜交法或核酸液相雜交法中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1240831SQ9811543
公開日2000年1月12日 申請(qǐng)日期1998年7月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月3日
發(fā)明者朱濱 申請(qǐng)人:新疆保利達(dá)科工貿(mào)有限責(zé)任公司