專利名稱：全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種新的可與人表皮生長因子受體特異結(jié)合的高親和力全人源單鏈抗體，能抑制表皮生長因子受體的活化，從而抑制高表達表皮生長因子受體腫瘤細胞A431的生長，是一種具有抗腫瘤活性的基因工程抗體。
背景技術(shù)：
正常細胞的增殖是通過各自的配體嚴格激活其生長因子受體來控制的，比如生長因子受體酪氨酸激酶。癌細胞也是在生長因子受體的激活下增殖的，但失去了正常增殖的嚴格控制。這種失控可能是由很多因素引起，比如生長因子的過度表達或生長因子受體的過度表達，以及由生長因子調(diào)控的生化途徑的自發(fā)性激活。參與致癌的受體包括表皮生長因子受體，來源于血小板的生長因子受體，類胰島素生長因子受體，神經(jīng)生長因子受體和成纖維生長因子受體等。
人表皮生長因子受體(印idermal growth factor rec印tor，也稱為HER-1或 Erb-Bl，本文稱作“EGFR”)是170kDa的跨膜糖蛋白，是表皮生長因子受體家族中的四成員之一，其由c-erbB原癌基因編碼，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3部分組成。胞內(nèi)區(qū)顯示固有的酪氨酸激酶活性，跨膜區(qū)由一個親脂性多肽螺旋構(gòu)成；胞外區(qū)分成4個亞區(qū)，是EGFR 與配體(生長因子等)結(jié)合的部位。在非活性狀態(tài)下EGFR受體與其配體結(jié)合后可形成同源或異源二聚體，受體胞內(nèi)區(qū)發(fā)生磷酸化可以啟動一系列胞內(nèi)信號級聯(lián)。EGFR結(jié)合包括以下各項的配體表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF-α)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合 EGFQib-EGF)，β動物纖維素和印iregulin。EGFR及其配體是細胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分， EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細胞過程，包括但不限于激活控制細胞增殖、分化、細胞存活、程序性細胞死亡、血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 研究表明，EGFR基因拷貝數(shù)增加或者過度表達，均能促進正常細胞的轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，EGFR的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的形成和發(fā)展過程中占了重要的地位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的表達在許多人類腫瘤，包括頭和頸、乳腺、結(jié)腸、前列腺、肺和卵巢的癌中上調(diào)，過量表達的程度與不佳的臨床預(yù)后相關(guān)。EGFR高表達的腫瘤預(yù)后差，容易轉(zhuǎn)移、生存時間短。EGFR由于涉及到腫瘤形成，已經(jīng)成為抗腫瘤治療的特異性靶目標。
靶向EGFR藥物主要由兩類一類是直接作用于受體細胞內(nèi)區(qū)段以防止信號傳導(dǎo)的合成的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要包括吉非替尼、erlotinib等等；另一類是阻斷配體結(jié)合到受體胞外功能域的單克隆抗體(MAb)，包括西妥昔單抗(cetuximab)等。
西妥昔單抗(Cetuximab，商品名Erbitux)是抗人EGFR的嵌合型IgGl單克隆抗體，它于2006年被美國食品藥品管理局批準與依立替康聯(lián)合或單獨用藥以治療表達表皮生長因子受體的、對依立替康的化療無效或耐受的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌患者。但Cetuximab是一個嵌合型抗體，仍未能達到人源化。因此，靶向EGFR胞外區(qū)的全人源抗體能降低免疫原性，另外分子量只有全長抗體的1/6的抗EGFR單鏈抗體可以通過E. coli發(fā)酵降低生產(chǎn)成本。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價值的全人源抗人EGFR的單鏈抗體。本發(fā)明單鏈抗體的特征為特異性結(jié)合人EGFR胞外區(qū)，在體外能夠抑制表皮癌細胞A431的生長。
技術(shù)方案
一種全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，其特征在于
抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域，并且重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)域通過柔性肽連接，重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列為SEQ ID N0:1;輕鏈可變區(qū)域為SEQ ID NO 2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列為SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ IDNO :9。
所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，具有重鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有重鏈⑶R2域，該域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有重鏈⑶Rl域，該域包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
一種分離的核酸，其特征在于該核酸編碼上述的抗體。
一種表達載體，含有上述的核酸。
一種重組宿主細胞，含上述的表達載體。
上述任一項的抗體或抗體片段的應(yīng)用，選擇性地與EGFR結(jié)合或抑制EGFR與EGFR 配體的結(jié)合或中和EGFR。
上述任一項的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。
上述任一項的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。
所述的偶聯(lián)物，含有抗腫瘤藥物、靶組成部分或報告組成部分。
ElO-VH
1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTC
1QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV
VH-CDRl
61 TCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCC
21 S C K A S G G T F S S Y A ISffVRQA
VH-CDR2
121 CCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTAC4
41PGQGLEffMGG I I P I F G T A N Y
181GCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTAC
61AQKFQGRVTITADESTSTAY
VH-CDR3
241ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAACTCGG
81MELSSLRSEDTAVYYC ARTR
301CTTAAGCATCAGTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTC
101LKHQ WGQGTLVTV
ElO-VL
1 CTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGG
1LSSELTQDPAVSVALGQTVR
VL-CDRl
61 ATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCA
21 I T C Q G D SLRSYY ASffYQQKP
VL-CDR2
121 GGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGAC
41 GQAPVLVIY GKNN R P S G I P D
181 CGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCG
61 RFSGSSSGNTASLTITGAQA
VL-CDR3
241 GAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTCCGGTATTCGGCGGA
81 EDEADYYC NSRDSSGPV FGG
301 GGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
101GTKLTVLG
發(fā)明進一步說明
本發(fā)明中全人源抗EGFR單鏈抗體基因序列全長711個核苷酸，預(yù)期有237個氨基酸。具有113個氨基酸的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 1)和108個氨基酸的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO :2)，通過16個氨基酸的柔性肽連接(SEQ ID NO 9)。
含有本發(fā)明表皮生長因子受體單鏈抗體基因的表達載體和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增本發(fā)明單鏈抗體基因的任意片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種可以表達和純化上述抗表皮生長因子受體抗體的方法。
本發(fā)明通過噬菌體展示抗體庫技術(shù)，以人EGFR胞外區(qū)蛋白為靶抗原，篩選得到一個能特異性結(jié)合EGFR的全人源單鏈抗體ElO ；用ImM IPTG誘導(dǎo)表達；利用滲透休克提取細菌周質(zhì)蛋白，低溫離心去除細胞碎片，將上清過鎳親和層析柱進行分離純化；Western Blot 鑒定分離純化得到的ElO ；細胞ELISA分析抗體和表皮癌細胞A431表面EGFR的結(jié)合作用； 檢測單鏈抗體ElO對表皮癌細胞A431的生長抑制作用。
本發(fā)明得到的抗表皮生長因子單鏈抗體與表皮癌細胞A431表面表皮生長因子受體具有高特異性結(jié)合，體外抑制腫瘤細胞生長實驗結(jié)果表明，本發(fā)明得到的單鏈抗體可以明顯抑制腫瘤細胞的生長。本發(fā)明為治療和診斷以表皮生長因子受體抗原的表達，特別是過量表達為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關(guān)疾病包括但不限于自身免疫病和癌癥。


圖1是單鏈抗體ElO的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是ElO重組載體的酶切圖譜。ElODNA由箭頭標出，DNA大小以1Λ為單位。
圖3顯示SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖，描述發(fā)酵表達的ElO通過鎳柱進行分離純化的結(jié)果，泳道1為菌體周質(zhì)提取物上清，泳道2 4為含50mM咪唑緩沖液洗滌鎳柱結(jié)果，泳道 5 7為含IOOmM咪唑緩沖液洗脫鎳柱獲得的目的蛋白。
圖4展示利用Wfestern Blot鑒定分離到的ElO。
圖5展示ElO與表皮癌細胞A431表面EGFR的ELISA結(jié)合活性，以及空白 (A431+MPBS)、陰性(MPBS+E10)和抗體對照(A431+control scFv)。
圖6是一曲線圖，描述全人源抗EGFR單鏈抗體ElO對A431細胞的生長抑制作用。
以下借助非限制性實施例舉詳細描述本發(fā)明。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，特別是對若干部件的等同替換，都構(gòu)成對本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。
具體實施方式
實施例中涉及的百分比，其中固定試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分比。
實施例1全人源抗EGFR單鏈抗體的篩選
以包被緩沖液(IOOmM Tris, NaCl 150mM, pH9. 0)稀釋EGFR胞外區(qū)蛋白(購自北京義翹神州生物技術(shù)公司)至100μ g/ml ；取4ml加入到免疫管中，4°C包被過夜；次日，棄上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS (含有2%脫脂牛奶的PBS)，37°C封閉池；棄封閉液，用 PBS迅速洗管3次；將噬菌體抗體庫(1012 IO13p. f. u) (Dana library,哈佛醫(yī)學(xué)院捐贈) 懸浮于2%10^5并加入到免疫管中，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)301^11后，于室溫靜置901^11以上； 以含有0. 1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污劑；加入Iml IOOmM 三乙胺(700 μ 1 7. 18mol/L三乙胺加入到50ml水中)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)孵育lOmin，進行特異性洗脫；0.5ml IM Tris (pH7. 4)用于迅速中和洗脫下來的噬菌體；中和后的噬菌體用于感染對數(shù)期的大腸桿菌TG1，進行擴增和制備，用于下一輪篩選。
實施例2抗EGFR單鏈抗體的可溶性表達及分離純化
挑選測序正確的TGl菌株，收集噬菌粒，按常規(guī)操作(參照抗體藥物工程，P51)感染表達菌株大腸桿菌HB2151，培養(yǎng)至0D600nm = 0. 8，加入終濃度ImM的IPTG，30°C誘導(dǎo)過夜，15% SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達的結(jié)果。
6000rpm，4°C離心15min，收集菌體；PBS重懸洗滌菌體一次，采用滲透休克法破碎菌體，即高滲溶液(50mM Tris-HCl，20 %蔗糖，ImM EDTA, pH8. 0)重懸菌體，緩慢攪拌IOmin， 4°C，9000g離心lOmin，倒出上清，用冰冷的5mM MgSO4重懸沉淀，緩慢攪拌10min，4°C， IOOOOg離心20min，將上清與上一步上清合并用于鎳親和層析(購自GE)，用不同濃度的咪唑洗滌雜蛋白，洗脫目的蛋白；15% SDS-PAGE檢測收集的樣品，_20°C保存目的蛋白，命名為E10，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，由SEQ ID NO 9相連。
實施例3抗EGFR單鏈抗體的^festern Blot鑒定
純化得到的ElO進行變性SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為15% ;4°C，IOOmA恒流轉(zhuǎn)印 2h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜(購自Millipore)；轉(zhuǎn)印結(jié)束，將膜在5% MTBS (含有5%脫脂牛奶的TBS)中室溫封閉Ih ；用5% MTBS按1 2000稀釋anti-His鼠抗體(購自Millipore)， 室溫孵育 lh，TBS 洗滌 3 遍，每次 IOmin ；用 5% MTBS 按 1 5000 稀釋 HRP-anti_Mouse 二抗(購自聯(lián)科生物)，室溫孵育lh，TBS洗滌3遍，每次IOmin ；用DAB顯色，結(jié)果如圖7所7J\ ο
實施例4可溶性單鏈抗體ElO的細胞ELISA
將表皮癌細胞A431 (購自中國科學(xué)院上海細胞庫)消化，離心后重懸，1 X IO5包被酶標板過夜讓細胞貼壁12h，分為4組，每組3個孔。次日，棄培養(yǎng)基，溫PBS洗2次，充分干燥后，每孔加入50 μ 1 PBS配制的0. 25%戊二醛作用10 12min，棄固定液，PBS洗3次，每孔加入300μ1 5%脫脂奶粉(MPBS)4°C過夜封閉。次日PBS洗3次，按分組要求加入不同濃度抗體或者對照100 μ 1，37°C孵育2h，以含有0. 05% Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS 洗滌3次。每孔加入100μ 1用5%MPBS 1 2000稀釋的鼠抗His抗體，37°C孵育lh，以含有0.05% Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。加入100 μ 1用5% MPBSl 5000 稀釋的HRP-偶聯(lián)羊抗鼠IgG多克隆抗體，37°C孵育lh，以含有0. 05% Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。每孔加入100 μ 1底物液(100 μ g/mLTMB, IOOmmo 1/L乙酸鈉， pH6. 0，每50mL緩沖液加入10 μ 1 30%過氧化氫)，室溫孵育IOmin。每孔加入50 μ 1 5% (ν/ν)稀硫酸終止反應(yīng)。測定OD65t^nOD45tl，以O(shè)D45tl值減去OD65tl值作為最后檢測結(jié)果。Ρ/Ν =(陽性細胞孔A值-空白孔A值)/(陰性細胞孔A值-空白孔A值)> 2為陽性。
實施例5抗EGFR單鏈抗體對表皮癌細胞Α431的生長抑制作用
將Α431 細胞 IXlO4- 2X IO4 接種 96 孔細胞培養(yǎng)板，100 μ 1/ 孔，在 37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用0. 5%小牛血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的A431細胞分為6組， 按照分組要求加入2倍梯度稀釋的E10，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細胞生長狀況后每孔加入Ilyl 的MTT，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心傾去上清，每孔加入150 μ 1 DMSO,在酶標儀570nm/630nm波長處測定光吸收值(0D值)，計算細胞增殖。ElO的生物活性由細胞生長的抑制率評價。抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)X 100%。權(quán)利要求
1.一種全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，其特征在于抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域，并且重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)域通過柔性肽連接，重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ；輕鏈可變區(qū)域為SEQ ID NO 2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列為SSGGGGSGGGGSGGSA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有重鏈CDR2域，該域包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的一種全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有重鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
5.一種分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼權(quán)利要求1的一種全人源的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體。
6.一種表達載體，含有權(quán)利要求5所述的核酸。
7.—種重組宿主細胞，含有權(quán)利要求6所述的表達載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項的抗體或抗體片段的應(yīng)用，其特征在于選擇性地與EGFR 結(jié)合或抑制EGFR與EGFR配體的結(jié)合或中和EGFR。
9.權(quán)利要求1 4任一項的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。
10.權(quán)利要求1 4任一項的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體地公開了一種全人源抗EGFR單鏈抗體E10、其制備方法及用途。本發(fā)明還公開了E10的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，以及包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括對應(yīng)于互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的序列。本發(fā)明還提供產(chǎn)生和表達E10的方法，從天然人源噬菌體抗體庫中篩選獲得了一株全人源抗EGFR單鏈抗體E10，后通過原核細胞分泌表達、親和層析純化獲得單鏈抗體。本發(fā)明的單鏈抗體可特異性結(jié)合于人表皮生長因子受體(EGFR)，可以抑制表皮癌細胞A431的生長，可應(yīng)用于制備診斷劑和治療劑。
文檔編號C12N15/13GK102504026SQ201110369620
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者周雅瓊, 張娟, 王旻 申請人:中國藥科大學(xué)