本發(fā)明涉及藥物提取，具體涉及一種奶牛胎盤提取物cp1的制備方法及奶牛胎盤提取物cp1作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胎盤組織含有大量生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗疲勞、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)生理機(jī)能和提高免疫力等作用。中醫(yī)臨床傳統(tǒng)利用方法是采集新鮮胎盤，蒸煮干燥，碾碎后入藥，近年來研究學(xué)者通過改變蒸煮條件、增加炮制材料等方式有效提高了胎盤制品的生物學(xué)活性和總物質(zhì)含量，但仍未制得成分較為單一的胎盤制劑。沈留紅等和張鉞等通過不同蛋白酶酶解奶牛胎盤并預(yù)測(cè)酶解產(chǎn)物抗氧化活性，并發(fā)現(xiàn)奶牛胎盤酶解后獲得的多肽具有較強(qiáng)過渡金屬螯合能力、還原力和清除abts自由基能力，并可通過提高抗氧化酶活性來抑制衰老模型小鼠的氧化應(yīng)激，延緩皮膚衰老和肝臟衰老，具有較好抗氧化功能。但目前這些奶牛胎盤提取物(cow?placenta?extract，cpe)是一種多肽混合物，cpe中發(fā)揮抗氧化活性的奶牛胎盤抗氧化肽(cow?placenta?antioxidant?peptide，cpap)成分尚不明確。因此，本發(fā)明應(yīng)用虛擬篩選法，通過網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)確定cpe中潛在cpap，并分別將其和tx6(陽性對(duì)照)與kelch樣ech相關(guān)蛋白1(keap1)分子對(duì)接，選擇親和力最強(qiáng)cpap記為cp1。并證實(shí)奶牛胎盤提取物cp1可作為抗氧化物質(zhì)應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種奶牛胎盤提取物cp1的制備方法及奶牛胎盤提取物cp1作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，奶牛胎盤提取物cp1的制備方法，包括以下步驟：

4、步驟1、奶牛胎盤剪碎后采用組織勻漿機(jī)勻漿，加入木瓜蛋白酶，在ph?6.5，溫度55℃條件下作用4.7h，沸水浴滅活10min后離心，收集上清，冷凍干燥，凍干待用，記為cpe；使用lc-ms/ms技術(shù)對(duì)cpe中蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行鑒定：采用納升流速的hplc液相系easy-nlc進(jìn)行樣品分離，然后用q?exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析cpe內(nèi)多肽氨基酸序列；

5、步驟2、將步驟1獲得的cpe內(nèi)多肽氨基酸序列，通過anoxpp(http://www.cqudfbp.net/anoxpp/index.jsp)、protparam(http://we-b.expasy.org/protparam/)、innovagen(http://www.innovagen.com/proteomics-tools/)、toxinpred(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)和allertop(v.2.0)(https://www.ddgpharmfac.net/allertop/)預(yù)測(cè)其抗氧化活性、穩(wěn)定性、水溶性、毒性和致敏性，篩選出排名前5多肽作為潛在cpap。

6、步驟3、進(jìn)一步利用分子對(duì)接法篩選cpap。首先，采用chemdraw19.0軟件繪制潛在cpap的3d結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入discovery?studio?2019客戶端軟件，去除氫原子后作為配體，并且選擇tx6(pub?chem?id：121488089)作為陽性對(duì)照。其次，從rcsb蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載keap1蛋白晶體結(jié)構(gòu)(pdb?id：2flu)，導(dǎo)入discovery?studio2019客戶端軟件，去除配體和水、加氫并清潔蛋白后，作為受體。之后，選擇活性中心(x:5，y:9，z:1，半徑：)，應(yīng)用“-cdocker”協(xié)議進(jìn)行對(duì)接。最后，根據(jù)對(duì)接后-cdocker_inte-raction_energy(-cie)評(píng)分篩選得到cpap，記為cp1；

7、步驟4、根據(jù)cp1氨基酸序列，通過固相法合成cp1，純度大于95％；

8、本發(fā)明的一種奶牛胎盤提取物cp1為anngkqwaevf(h-ala-asn-asn-gly-lys-gln-trp-ala-glu-val-phe-oh)，其分子式為c57h82n16o17，分子量為1263.38da，可作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用。

9、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

10、以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

技術(shù)特征：

1.一種奶牛胎盤提取物cp1的制備方法及奶牛胎盤提取物cp1作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的提取方法得到的奶牛胎盤提取物cp1為anngkqwaevf(h-ala-asn-asn-gly-lys-gln-trp-ala-glu-val-phe-oh)，其分子式為c57h82n16o17，分子量為1263.38da。

3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的提取方法得到的奶牛胎盤提取物cp1作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種奶牛胎盤提取物CP1的制備方法及奶牛胎盤提取物CP1作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用，以正常分娩的健康中國荷斯坦奶牛胎盤勻漿為底物，奶牛胎盤剪碎后采用組織勻漿機(jī)勻漿，加入木瓜蛋白酶，在pH?6.5，溫度55℃條件下作用4.7h，沸水浴滅活10min后離心，收集上清，冷凍干燥后通過虛擬篩選法篩選出具有5種潛在抗氧化肽，分子對(duì)接后其與Keap1親和力均高于TX6，其中ANNGKQWAEVF與Keap1親和力最強(qiáng)，故記為CP1，CP1具有良好的自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力、過渡金屬螯合能力和還原力，且可激活氧化應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)Keap1/Nrf2通路從而緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激，可作為抗氧化物質(zhì)的應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：沈留紅,黃逸馨,田欣宇,張澤茹,樊磊,羅皓,朱潁琨,巫曉峰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15