本發(fā)明涉及分子模擬，尤其是涉及一種具有高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽作為藥物載體的設(shè)計和篩選的分子模擬方法。

背景技術(shù)：

1、短肽是一類由氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、易于合成和修飾等特點，因此在藥物載體的設(shè)計和篩選中具有很大的優(yōu)勢，此外，短肽因為具有良好的生物相容性和降解性，能夠有效地減少副作用和提高藥物的遞送效率，目前細(xì)胞穿透肽和抗菌肽等兩種天然短肽已經(jīng)在臨床治療中也取得了一系列重要的應(yīng)用成果，短肽作為藥物載體，在細(xì)胞內(nèi)遞送藥物被越來越多的研究者重視，因此，篩選具有高效的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽具有重要的生物學(xué)意義。

2、磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要組成成分，其普遍形態(tài)是一個親水頭部連接兩條疏水烴尾。根據(jù)構(gòu)成細(xì)胞膜的磷脂組分的不同可以構(gòu)建不同的細(xì)胞膜模型，膜的物理性質(zhì)和磷脂間的相互作用會使得其與短肽的互作過程出現(xiàn)不同現(xiàn)象。盡管實驗技術(shù)手段近年來不斷地發(fā)展進步，為細(xì)胞膜與其他物質(zhì)互作過程的微觀結(jié)構(gòu)觀察和磷脂排布特征提取提供了前所未有的視角，但是以常規(guī)的實驗手段對具有高效的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽的篩選難度大、造價高、周期長，亟需采用一種新的技術(shù)方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種具有高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽作為藥物載體的設(shè)計和篩選的分子模擬方法，該方法方法簡單、操作方便，通過數(shù)值模擬方法研究微觀系統(tǒng)在經(jīng)典力學(xué)下隨時間演化的計算技術(shù)，本發(fā)明采用分子動力學(xué)模擬方法，基于gromacs，構(gòu)建了由不同結(jié)構(gòu)的磷脂組成的細(xì)胞膜模型及細(xì)胞內(nèi)外的模擬環(huán)境，系統(tǒng)探究了短肽跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的機制。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

3、一種用于篩選具有高效的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽的分子模擬方法，該方法包括如下步驟：

4、(1)構(gòu)建不同磷脂成分的細(xì)胞膜模型：

5、利用charmm-gui在線網(wǎng)站構(gòu)建：按照頭基、尾鏈長度、烴鏈不飽和度選取不同結(jié)構(gòu)的磷脂，利用charmm-gui網(wǎng)站構(gòu)建不同磷脂組合的小模塊膜體系，之后利用gromacs將小模塊膜體系進行擴展達(dá)到所需尺寸，或利用material?studio等軟件構(gòu)建：按照選取的磷脂結(jié)構(gòu)在material?studio進行建模，并利用automated?topology?builder生成itp文件，之后利用genmixmem將不同結(jié)構(gòu)的磷脂進行組合達(dá)到所需尺寸的細(xì)胞膜模型；

6、(2)構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的短肽模型：

7、確定短肽的氨基酸序列并利用alphafold或pymol對短肽進行建模，獲取pdb文件，之后利用gromacs對短肽結(jié)構(gòu)文件進行pdb2gmx選擇合適力場處理，獲取itp文件；

8、(3)模擬短肽跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的動力學(xué)過程：

9、利用gromacs將短肽與細(xì)胞膜置于一個合適大小的盒子中，添加溶劑與離子并模擬足夠時間使得體系被充分模擬，直至短肽吸附于細(xì)胞膜上或嵌入細(xì)胞膜中；(4)機理分析：

10、利用vmd可視化軟件捕捉短肽跨膜的動態(tài)過程及細(xì)節(jié)，通過vmd自帶腳本分析短肽跨膜過程中整體上的演變速率和變化行為。

11、進一步，各組分磷脂可按照需要自由組合形成不同的細(xì)胞膜模型，同時根據(jù)需要選擇力場與溫度設(shè)置以模擬不同環(huán)境下的溫度條件，初始的細(xì)胞膜模型經(jīng)過經(jīng)過能量最小化、預(yù)平衡模擬和平衡模擬得到穩(wěn)定的細(xì)胞膜模型，得到穩(wěn)定的細(xì)胞膜模型后，

12、進一步，在模擬盒子中放入短肽并在細(xì)胞膜兩葉加入5nm的水層和離子，再進行能量最小化、預(yù)平衡模擬、平衡模擬，得到穩(wěn)定的模型。

13、進一步，能量最小化為采用兩次5000步最速下降法進行；預(yù)平衡模擬為等溫等壓系綜下進行5次預(yù)平衡模擬，每一次進行1ns預(yù)平衡，時間步長逐漸增大并在每一次預(yù)平衡中減小對頭基的位置限制；加入短肽前的平衡模擬為在npt系綜下進行200ns的平衡模擬，采用parrinello-rahman控壓方法和v-rescale熱?。患尤攵屉暮蟮钠胶饽M為在npt系綜下進行1ns的平衡模擬，采用parrinello-rahman控壓方法和v-rescale熱浴。

14、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的用于研究具有高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽作為藥物載體的設(shè)計和篩選的分子模擬方法具有以下優(yōu)勢：

15、(1)本發(fā)明所述的用于研究短肽結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)對短肽作為藥物載體的設(shè)計和篩選的分子模擬方法，可實現(xiàn)利用不同的磷脂結(jié)構(gòu)進行細(xì)胞膜建模及跨膜過程模擬，克服了分子動態(tài)細(xì)節(jié)難以分析的難點，并實現(xiàn)結(jié)構(gòu)差異與自由能壘差異的對應(yīng)，滿足磷脂結(jié)構(gòu)作用機理分析的定量考察需要。該方法操作簡便，推廣性強，磷脂構(gòu)成及膜組分構(gòu)成可調(diào)，短肽結(jié)構(gòu)可根據(jù)需要設(shè)計并建模，適用于各種短肽與生物體細(xì)胞膜體系的重現(xiàn)，彌補了實驗研究中操作繁瑣、周期長和成本高的不足?？偟膩碚f本發(fā)明能深入探究，篩選具有高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力并具備作為藥物載體潛力的短肽，為短肽藥物載體的設(shè)計與探索提供了一條便捷而有效的途徑。(2)本發(fā)明從整體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)分析短肽的細(xì)胞轉(zhuǎn)運能力。由于短肽跨膜與膜的物理性質(zhì)高度相關(guān)，因此對細(xì)胞膜的內(nèi)外膜厚度，膜的剛?cè)嵝缘刃枰繙y量。通過fatslim、膜波動計算等腳本分析工具以及gromacs自帶分析模塊(gmx?density等)，得到了膜的剛?cè)嵝院鸵幌盗形锢硇再|(zhì)。同時在跨膜階段，短肽會與磷脂的頭部與尾部結(jié)構(gòu)頻繁接觸，因此還需要對磷脂的個體面積(apl)、厚度變化、尾鏈插入性能、頭基接觸次數(shù)、磷脂排列有序度等定量分析。通過上述分析并結(jié)合自由能壘分析，歸納不同結(jié)構(gòu)的短肽對不同結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運能力。此分析深化了對短肽細(xì)胞轉(zhuǎn)運過程的研究，從少有的視角分析短肽與磷脂的不同結(jié)構(gòu)對細(xì)胞轉(zhuǎn)運的影響機理。

技術(shù)特征：

1.一種用于設(shè)計和篩選具有高效的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的多肽小分子藥物載體的分子模擬方法，該方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于研究磷脂結(jié)構(gòu)對生物膜分裂影響的分子模擬方法，其特征在于：各組分磷脂可按照需要自由組合形成不同的細(xì)胞膜模型，同時根據(jù)需要選擇力場與溫度設(shè)置以模擬不同環(huán)境下的溫度條件，初始的細(xì)胞膜模型經(jīng)過經(jīng)過能量最小化、預(yù)平衡模擬和平衡模擬得到穩(wěn)定的細(xì)胞膜模型，得到穩(wěn)定的細(xì)胞膜模型后，放入短肽并在細(xì)胞膜兩葉加入5nm的水層和離子，再進行能量最小化、預(yù)平衡模擬、平衡模擬，得到穩(wěn)定的模型。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于研究磷脂結(jié)構(gòu)對生物膜分裂影響的分子模擬方法，其特征在于：能量最小化為采用兩次5000步最速下降法進行；預(yù)平衡模擬為等溫等壓系綜下進行5次預(yù)平衡模擬，每一次進行1ns預(yù)平衡，時間步長逐漸增大并在每一次預(yù)平衡中減小對頭基的位置限制；加入短肽前的平衡模擬為在npt系綜下進行200ns的平衡模擬，采用parrinello-rahman控壓方法和v-rescale熱??；加入短肽后的平衡模擬為在npt系綜下進行1ns的平衡模擬，采用parrinello-rahman控壓方法和v-rescale熱浴。

4.一種如權(quán)利要求1-3任一項所述的用于研究短肽跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的分子模擬方法在微觀角度研究短肽跨細(xì)胞膜的運動規(guī)律及微觀機理方面的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于分子模擬用于設(shè)計和篩選具有跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽的設(shè)計和篩選的方法，該方法可以構(gòu)建不同磷脂成分的細(xì)胞膜模型，并利用AlphaFold與Pymol對短肽進行建模，可以精確構(gòu)建50個氨基酸以內(nèi)的短肽鏈，進而基于分子動力學(xué)模擬的方法構(gòu)建短肽和細(xì)胞膜內(nèi)外的模擬體系，該發(fā)明可對具有高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的短肽藥物載體的設(shè)計和篩選提供高效的方法，推動短肽類藥物載體跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運機制的理論研究。該計算模擬方法的實施還將有助于進一步闡釋短肽的結(jié)構(gòu)對其跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的影響，對短肽藥物載體的設(shè)計提供理論指導(dǎo)。

技術(shù)研發(fā)人員：李曄,張準(zhǔn),張葉卓
受保護的技術(shù)使用者：北京林業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15