本發(fā)明涉及基因工程，具體地說，涉及一種雞球蟲納米顆粒疫苗及雞球蟲多抗原納米顆粒疫苗。

背景技術(shù)：

1、雞球蟲病作為一種普遍存在于全球的寄生蟲性疾病，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的威脅。這種疾病的發(fā)病率高達(dá)50-70％，而死亡率則在20-30％之間，極端情況下死亡率甚至可以飆升至80％以上。那些幸存下來的雞只，其生產(chǎn)性能也會大幅度降低，每年由此引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。目前，雞球蟲病的防控主要依賴于藥物，但隨著抗藥性蟲株的不斷出現(xiàn)，藥物防治的效果正在逐漸降低。同時(shí)，藥物殘留和抗藥性問題也對食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。面對這些挑戰(zhàn)，科研人員和養(yǎng)殖業(yè)者正在積極探索替代抗球蟲藥物的新方法。免疫預(yù)防作為一種有效的解決方案，不僅能夠解決藥物殘留問題，也是控制雞球蟲病的理想選擇。然而，目前市面上的抗雞球蟲疫苗主要是活疫苗，它們存在諸多不足，如免疫程序復(fù)雜、難以控制，生產(chǎn)能力有限、成本高昂、保存困難，以及可能存在的毒力返強(qiáng)和散毒風(fēng)險(xiǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速進(jìn)步，亞單位疫苗作為一種新型疫苗正在逐漸嶄露頭角，并在畜禽疫病防控領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。亞單位疫苗只包含能夠激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵免疫原蛋白，具有不復(fù)制、無致病性、不散毒等顯著特點(diǎn)。這種疫苗的接種能夠使雞只獲得對球蟲的抵抗力，增強(qiáng)其對感染的防御能力。亞單位疫苗還具有其他顯著優(yōu)勢，如高安全性、穩(wěn)定性好、便于運(yùn)輸、生產(chǎn)成本低等。盡管亞單位疫苗在研究和應(yīng)用上顯示出巨大的潛力，但目前市場上的商業(yè)化亞單位疫苗仍然十分稀缺。因此，進(jìn)一步研究和推廣亞單位疫苗對于提升養(yǎng)雞業(yè)的疾病防控水平至關(guān)重要。這不僅能夠減少對藥物的依賴，降低抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，還能提高食品安全，保障養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

2、近年來，基因工程表達(dá)的蛋白納米顆粒疫苗的應(yīng)用極大的控制了各種傳染病的發(fā)生，例如乙肝病毒樣顆粒(vlp)疫苗，人乳頭瘤病毒(hpv)vlp疫苗、戊型肝炎(hev)vlp疫苗，以及基于自組裝蛋白納米顆粒開發(fā)的針對瘧原蟲的vlp疫苗(r21/matrix-m)等。瘧原蟲vlp疫苗的成功開發(fā)為諸如雞球蟲等寄生蟲疫苗的研發(fā)提供了新的方向，特別是在利用vlp技術(shù)來增強(qiáng)疫苗的免疫原性和保護(hù)效果方面。本發(fā)明使用在柔嫩艾美耳球蟲疫苗中比較有潛力的蛋白ta4、3-1e、gam52、mic2作為抗原，并通過納米顆粒疫苗載體偶聯(lián)，成功制備含有對應(yīng)蛋白的納米顆粒疫苗。ta4蛋白位于柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面，研究表明，針對ta4抗原的單克隆抗體能夠抑制雞球蟲子孢子入侵細(xì)胞，暗示ta4在球蟲入侵宿主細(xì)胞過程中可能發(fā)揮重要作用。3-1e蛋白是研究最多的抗雞球蟲病亞單位疫苗抗原，主要與肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合，延緩肌動(dòng)蛋白聚合作用，并在弓形蟲的滑行運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。gam52在球蟲生活史中的特定階段表達(dá)，可在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。mic2蛋白主要參與溶膜入侵過程，對子孢子入侵培養(yǎng)細(xì)胞有抑制作用。

3、目前關(guān)于雞球蟲亞單位的疫苗主要涉及單一或多個(gè)抗原蛋白表達(dá)后的組合和配制，這種簡單的亞單位的抗原的混合最大的問題就是免疫原性很弱，誘導(dǎo)的抗體強(qiáng)度不夠，從細(xì)胞免疫來看，這種蛋白組合的亞單位疫苗幾乎沒有細(xì)胞免疫(參見2020年4月福建農(nóng)林大學(xué)碩士論文“雞球蟲重組雙價(jià)疫苗的制備及其效果評價(jià)”，以及2023年6月吉林大學(xué)博士論文“雞球蟲四價(jià)重組亞單位疫苗的研制”)。然而，作為寄生蟲而言，細(xì)胞免疫對于胞內(nèi)寄生蟲的清除至關(guān)重要。從免疫學(xué)的角度看，蛋白納米顆粒疫苗能夠增強(qiáng)淋巴運(yùn)輸、增加抗原呈遞細(xì)胞(apc)在淋巴結(jié)中的捕獲以及通過多價(jià)受體交聯(lián)增加抗原特異性b細(xì)胞的活化。在納米顆粒表面密集展示抗原可以有效增加免疫原性，例如肽抗原在體內(nèi)因缺乏重復(fù)表位會被快速清除，導(dǎo)致體液應(yīng)答較差，而在顆粒支架上多聚化時(shí)會產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗原特異性抗體應(yīng)答。重要的是，這種納米顆粒疫苗能夠促進(jìn)抗原的交叉提呈，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫，這對于雞球蟲的防控至關(guān)重要。也有少量的與雞球蟲納米顆粒疫苗有關(guān)的專利，如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的一種巨型艾美耳球蟲納米亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用，然而該專利使用的是plga納米材料包裹巨型艾美耳球蟲mic3蛋白制備而成，這種制備方法制備的plga納米材料很難控制粒徑均一和抗原的包封率，從而在未來大規(guī)模使用難以滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種雞球蟲納米顆粒疫苗以及雞球蟲多抗原納米顆粒疫苗。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

2、第一方面，本發(fā)明提供一種雞球蟲納米顆粒疫苗，由納米顆粒疫苗載體與亞單位抗原融合蛋白偶聯(lián)而成；

3、所述納米顆粒疫苗載體包括純化標(biāo)簽、連接蛋白，以及自組裝納米顆粒蛋白；

4、所述亞單位抗原融合蛋白包括純化標(biāo)簽、雞球蟲抗原，以及結(jié)合蛋白。

5、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，至少包括如下技術(shù)特征之一：

6、a、所述雞球蟲抗原包括柔嫩艾美耳球蟲的ta4蛋白、3-1e蛋白、gam52蛋白、mic2蛋白中的任意一種；

7、b、所述自組裝納米顆粒蛋白選自病毒樣顆粒蛋白vlps(各種病毒來源的vlp)、細(xì)菌噬菌體衣殼蛋白ap205，以及i3-01、i53-50、i53-40、np4e納米顆粒蛋白中的任意一種。

8、i3-01、i53-50、i53-40、np4e均為人工設(shè)計(jì)的能夠自組裝成高度均一結(jié)構(gòu)的納米顆粒蛋白。優(yōu)選的，所述自組裝納米顆粒蛋白為np4e納米顆粒蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.6所示，基于i3-01納米顆粒蛋白(氨基酸序列如seq?id?no.25所示)改造而成。

9、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述連接蛋白和結(jié)合蛋白通過異肽鍵連接；所述連接蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3或seq?id?no.4所示；所述結(jié)合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.8或seq?id?no.9所示。

10、納米顆粒疫苗載體上的連接蛋白和亞單位抗原融合蛋白上的結(jié)合蛋白能夠以高親和力相互識別，并且可以在彼此之間形成異肽鍵，形成一個(gè)共價(jià)結(jié)合復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的共價(jià)連接和穩(wěn)定化，該系統(tǒng)是一種不可逆偶聯(lián)技術(shù)，具有高特異性，可達(dá)99％的轉(zhuǎn)化率。

11、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述純化標(biāo)簽選自組氨酸純化標(biāo)簽、gst標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽，以及ha標(biāo)簽中的任意一種。優(yōu)選的，所述純化標(biāo)簽為組氨酸純化標(biāo)簽，其氨基酸序列為hhhhhh(如seq?id?no.7所示)。

12、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述納米顆粒疫苗載體中，純化標(biāo)簽和連接蛋白通過連接臂連接，連接蛋白和自組裝納米顆粒蛋白通過連接臂連接；和/或，所述亞單位抗原融合蛋白中，純化標(biāo)簽和抗原通過連接臂連接，抗原和結(jié)合蛋白通過連接臂連接；所述連接臂的氨基酸序列選自(gss)n、(gsgs)n、(ggggs)n中的任意一種，n選自大于0且小于等于10的整數(shù)。

13、優(yōu)選的，所述納米顆粒疫苗載體中，純化標(biāo)簽和連接蛋白通過連接臂1連接，連接蛋白和自組裝納米顆粒蛋白通過連接臂2連接；所述亞單位抗原融合蛋白中，純化標(biāo)簽和抗原通過連接臂3連接，抗原和結(jié)合蛋白通過連接臂3連接；所述連接臂1的氨基酸序列如seqid?no.2所示，所述連接臂2的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，所述連接臂3的氨基酸序列如seq?id?no.24所示。

14、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述自組裝納米顆粒蛋白上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，通過多條連接臂2與多個(gè)連接蛋白連接，所形成的納米顆粒疫苗載體能夠用于偶聯(lián)多個(gè)亞單位抗原融合蛋白。

15、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述納米顆粒疫苗載體的氨基酸序列如seq?idno.1所示；或?yàn)閟eq?id?no.1經(jīng)過如下任一項(xiàng)突變后得到的氨基酸序列：

16、m1：c217a，c241a；

17、m2：c217a，c241a，c306a；

18、m3：c217a，c241a，c344a；

19、m10：c217a，c241a，c306a，c344a；

20、編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的納米顆粒疫苗載體的基因序列如seq?idno.15所示。

21、優(yōu)選的，所述納米顆粒疫苗載體具有如seq?id?no.1所示經(jīng)過c217a，c241a，c306a突變的氨基酸序列，其氨基酸序列如seq?id?no.14所示。

22、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述柔嫩艾美耳球蟲的ta4蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.10所示，3-1e蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.11所示，gam52蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.12所示，mic2蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.13所示。

23、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述雞球蟲抗原為柔嫩艾美耳球蟲的ta4蛋白，其亞單位抗原融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.20所示，基因序列如seq?id?no.16所示；

24、和/或，所述雞球蟲抗原為柔嫩艾美耳球蟲的3-1e蛋白，其亞單位抗原融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.21所示，基因序列如seq?id?no.17所示；

25、和/或，所述雞球蟲抗原為柔嫩艾美耳球蟲的gam52蛋白，其亞單位抗原融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.22所示，基因序列如seq?id?no.18所示；

26、和/或，所述雞球蟲抗原為柔嫩艾美耳球蟲的mic2蛋白，其亞單位抗原融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.23所示，基因序列如seq?id?no.19所示。

27、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，至少包括以下技術(shù)特征之一：

28、a、所述納米顆粒疫苗載體的制備方法包括：將編碼納米顆粒疫苗載體的基因構(gòu)建在質(zhì)粒上，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過純化后即得；

29、b、所述雞球蟲亞單位抗原融合蛋白的制備方法包括：將編碼雞球蟲亞單位抗原融合蛋白的基因構(gòu)建在質(zhì)粒上，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，通過純化后即得；

30、c、將納米顆粒疫苗載體與亞單位抗原融合蛋白進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，偶聯(lián)的條件為4-6℃過夜反應(yīng)10-12h或在20-25℃室溫條件下反應(yīng)4-6h。優(yōu)選4℃過夜反應(yīng)12h；偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，通過超濾或凝膠過濾層析去除殘余的雞球蟲亞單位抗原。

31、在一些具體的實(shí)施方式中，對氨基酸序列如seq?id?no.1所示的未經(jīng)突變的納米顆粒疫苗載體進(jìn)行純化的方法包括ni柱純化和/或凝膠過濾層析純化。

32、在一些具體的實(shí)施方式中，對在如seq?id?no.1所示序列的基礎(chǔ)上經(jīng)c217a，c241a，c306a突變后獲得的氨基酸序列如seq?id?no.14所示的納米顆粒疫苗載體進(jìn)行純化的方法包括熱沉淀法。

33、在一些具體的實(shí)施方式中，對雞球蟲亞單位抗原融合蛋白進(jìn)行純化的方法包括ni柱純化法。

34、第二方面，本發(fā)明提供一種雞球蟲多抗原納米顆粒疫苗，包括具有不同抗原的如上所述的雞球蟲納米顆粒疫苗中的至少兩種的組合。

35、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述抗原為柔嫩艾美耳球蟲的ta4蛋白、3-1e蛋白、gam52蛋白、mic2蛋白中的任意一種，對應(yīng)的雞球蟲納米顆粒疫苗分別為ta4納米顆粒疫苗、3-1e納米顆粒疫苗、gam52納米顆粒疫苗、mic3納米顆粒疫苗；所述雞球蟲多抗原納米顆粒疫苗包括ta4納米顆粒疫苗、3-1e納米顆粒疫苗、gam52納米顆粒疫苗、mic3納米顆粒疫苗中的至少兩種的組合。

36、作為本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述雞球蟲多抗原納米顆粒疫苗包括3-1e納米顆粒疫苗、gam52納米顆粒疫苗和mic3納米顆粒疫苗，三種納米顆粒疫苗的濃度比為1:1-3:1-3。

37、本發(fā)明在納米顆粒疫苗載體領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，通過精妙的基因工程技術(shù)，設(shè)計(jì)并制備了一種創(chuàng)新的模塊化、自組裝納米顆粒疫苗載體。這一載體不僅能夠高密度且有序地展示雞球蟲抗原，保持蛋白抗原的原始構(gòu)象，而且顯著增強(qiáng)了亞單位抗原的穩(wěn)定性和長期儲存能力，為疫苗的長期有效性提供了保障。在免疫效果方面，本發(fā)明的納米顆粒疫苗載體通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞對抗原的吸收和交叉呈遞，有效克服了亞單位疫苗免疫原性弱和細(xì)胞免疫不足的問題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，該疫苗展現(xiàn)出的優(yōu)越抗球蟲效果，證明了其在增強(qiáng)特定免疫反應(yīng)方面的顯著優(yōu)勢。技術(shù)改進(jìn)方面，本發(fā)明通過對氨基酸序列的精確改造，不僅顯著提升了疫苗載體的穩(wěn)定性，而且將蛋白表達(dá)量提高了4.8倍，有效降低了生產(chǎn)成本。這一創(chuàng)新改造不僅增強(qiáng)了疫苗的性能，還為疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了顯著的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，使得疫苗更加經(jīng)濟(jì)高效。在純化工藝方面，本發(fā)明優(yōu)化后的納米顆粒疫苗載體展現(xiàn)出卓越的耐高溫特性，這一發(fā)現(xiàn)使我們能夠設(shè)計(jì)出一套個(gè)性化的純化工藝，與傳統(tǒng)的層析方案相比，新工藝在成本上更為經(jīng)濟(jì)，同時(shí)將蛋白純化收率提高了4.3倍。這一純化方案的改進(jìn)，不僅提高了生產(chǎn)效率，還為疫苗的規(guī)?；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

38、本發(fā)明的技術(shù)改造在提高納米顆粒疫苗載體的穩(wěn)定性和表達(dá)量的同時(shí)，通過創(chuàng)新的純化工藝，實(shí)現(xiàn)了成本的降低和生產(chǎn)效率的提高。這些創(chuàng)新改進(jìn)不僅顯著增強(qiáng)了疫苗的免疫反應(yīng)，而且為疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了有效的解決方案，為疫苗領(lǐng)域的未來發(fā)展提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

39、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

40、(1)通過基因工程手段，設(shè)計(jì)并制備一種模塊化、自組裝、高度均一且通用的納米顆粒疫苗載體，可以任意的將雞球蟲抗原高密度且有序的展示在納米顆粒表面，保持了蛋白抗原原始的構(gòu)象，從而增強(qiáng)亞單位抗原的穩(wěn)定性和長期儲存能力。

41、(2)納米顆粒疫苗能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞對抗原的吸收，促進(jìn)抗原的加工和交叉呈遞，解決了亞單位免疫原性弱，細(xì)胞免疫弱的問題，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較為優(yōu)越的抗球蟲效應(yīng)。

42、(3)通過精確的氨基酸序列改造，本發(fā)明成功解決了納米顆粒疫苗載體與抗原偶聯(lián)后出現(xiàn)的鏈內(nèi)二硫鍵問題，顯著提升了疫苗載體的穩(wěn)定性。這一改造不僅增強(qiáng)了疫苗的性能，還通過提高蛋白表達(dá)量4.8倍，有效降低了生產(chǎn)成本，為疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。

43、(4)在對納米顆粒載體的穩(wěn)定性進(jìn)行深入考察后，本發(fā)明優(yōu)化后的納米顆粒疫苗載體展現(xiàn)出卓越的耐高溫特性?；谶@一特性，我們設(shè)計(jì)了一套個(gè)性化的純化工藝，相較于傳統(tǒng)的層析方案，新工藝在成本上更為經(jīng)濟(jì)，同時(shí)將蛋白純化的收率提高了4.3倍。這一純化方案的改進(jìn)，為疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。