專利名稱：抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性低、且對淀粉樣蛋白球體具有高反應(yīng)性的 新型的抗體及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
在阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、朊病毒病等隨著年齡增加而發(fā)病的 多種神經(jīng)變性疾病中，目前“異常結(jié)構(gòu)蛋白”作為共同的發(fā)病機制而受到關(guān)注，并進行了對 其分子本質(zhì)的探索。關(guān)于阿爾茨海默病，報告了其病理學特征為下述2種纖維性聚集體 在腦內(nèi)的沉積以0淀粉樣蛋白(A3)為主要成分的老年斑(參照Selkoe，D.J.，Annu. Rev. Neurosci. ，12，463—490 (1989)；禾口 Glenner，G. G. and Wong, C. ff. ，Biochem. Biophys. Res. Commun.，120 (3)，885-890 (1984))和以經(jīng)磷酸化的tau蛋白為主要成分的神經(jīng)原纖 維變化(配對螺旋樣纖維，PHF) (Ihara, Y et al.，J. Biochem.，99，1807-1810 (1986)；和 Grundke-Iqbal, I. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，83，4913-4917 (1986))。另夕卜，近 年來，在被認為是由很多、各種病因?qū)е掳l(fā)病的阿爾茨海默病的研究中，逐漸認為到3淀 粉樣蛋白的聚集是共同的發(fā)病途徑。3淀粉樣蛋白是從其前體物質(zhì)(淀粉樣前體蛋白， AmyloidPrecursor Protein, APP)中主要以 40 個殘基(A3 42 個殘基(A3 卜42)的 分子種(molecular species)的形式切出而生成的肽，雖然在健康人中通常以單體形式進 行著生成、分解過程，但在阿爾茨海默病中，觀察到3淀粉樣蛋白聚集并最終成為過剩的 沉積。其原因被認為是在切出過程或分解過程中脫離了控制。在本說明書中，有時將前者 (A 3卜如)稱為“旦40淀粉樣蛋白”、“ 3 40淀粉樣蛋白單體”或者“ 3 40淀粉樣蛋白單體蛋 白”，并將后者(A^_42)稱為“0 42淀粉樣蛋白”、“0 42淀粉樣蛋白單體”或者“0 42淀粉 樣蛋白單體蛋白”。另外，43個殘基(A0i_43)的分子種盡管微量但也被切出而生成，有時將 其稱為“ 0 43淀粉樣蛋白”、“ 0 43淀粉樣蛋白單體”或者“ 0 43淀粉樣蛋白單體蛋白”。人們認為聚集的0淀粉樣蛋白對神經(jīng)細胞具有神經(jīng)毒作用，可引起突觸變性和 隨之發(fā)生的神經(jīng)細胞死亡，是導致阿爾茨海默病的進行性認知障礙的神經(jīng)細胞脫落的機 制。另外據(jù)報告，0淀粉樣蛋白在以水溶性的單體肽形式釋放到細胞外的狀態(tài)下不顯示神 經(jīng)細胞死亡活性(以下在本說明書中，有時將神經(jīng)細胞死亡活性稱為“毒性”)，而在自締合 形成0淀粉樣蛋白纖維后開始獲得毒性(參照Lorenzo，A. and Yankner,B. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，91，12243-12247(1994))。由于已知當將含有該3淀粉樣蛋白纖維的毒性 3淀粉樣蛋白含有液以高濃度添加到神經(jīng)系統(tǒng)的培養(yǎng)細胞中時，會導致這些細胞死亡，因 此一直以來認為在阿爾茨海默病中，該0淀粉樣蛋白纖維是誘發(fā)神經(jīng)細胞死亡的真正原 因。因此，認為通過添加含有該0淀粉樣蛋白纖維的毒性0淀粉樣蛋白來誘導神經(jīng) 系統(tǒng)細胞等的細胞死亡的實驗體系能夠反映阿爾茨海默病的神經(jīng)細胞死亡，一直以來多被 用于神經(jīng)細胞死亡抑制劑的篩選等。但是近年來，逐漸報告了下述事實(1)在含有3淀粉 樣蛋白纖維的毒性0淀粉樣蛋白含有液中，誘導神經(jīng)細胞死亡所需的濃度為數(shù)10yM(參照 Yankner，B. A.，et. al.，Science, 250，279-282 (1990))，該濃度高于阿爾茨海默病患者的 腦內(nèi)存在的0淀粉樣蛋白濃度的1000倍以上；(2)在阿爾茨海默病患者的腦內(nèi)，0淀粉 樣蛋白纖維的沉積量與記憶或認知功能等高級功能的障礙程度沒有必然聯(lián)系，即使存在大 量的0淀粉樣蛋白纖維沉積，有時也不顯示任何臨床癥狀；(3)此外，腦內(nèi)的淀粉樣蛋白3 的沉積部位與神經(jīng)細胞脫落部位未必一致；(4)在過剩表達APP的小鼠的腦內(nèi)，在0淀粉 樣蛋白纖維的沉積以前或沒有沉積，也發(fā)生學習行為異常；(5)阿爾茨海默病患者腦內(nèi)的 可溶性3淀粉樣蛋白含量的增加比難溶性纖維沉積早10年以上等；這些事實啟示3淀粉 樣蛋白的毒性的真正原因并不是0淀粉樣蛋白纖維。本發(fā)明人等之前提出了具有高毒性的自締合型3淀粉樣蛋白含有液及其制備方 法(日本特開2001-247600號公報)，該含有液以與阿爾茨海默病等的患者的機體內(nèi)存在的 自締合產(chǎn)生的0淀粉樣蛋白同等的濃度誘導神經(jīng)系統(tǒng)細胞發(fā)生細胞死亡。此外，還發(fā)現(xiàn)了 分離上述自締合型0淀粉樣蛋白含有液中所含的神經(jīng)細胞毒性的真正原因的方法，從分 析的結(jié)果可知，該真正原因是具有粒徑為約10 約20nm左右的粒狀形態(tài)的自締合型日淀 粉樣蛋白，并將之命名為淀粉樣蛋白球體(amylospheroid)(參照Hoshi，M. , et. al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，100，6370-6375 (2003))。在本說明書中，按照該命名，將具有粒徑 為約10 約20nm左右的粒狀形態(tài)的自締合型0淀粉樣蛋白稱為“淀粉樣蛋白球體”。由于淀粉樣蛋白球體以與阿爾茨海默病患者的腦內(nèi)存在的0淀粉樣蛋白同等的 濃度誘導神經(jīng)細胞死亡，并且在淀粉樣蛋白球體導致神經(jīng)死亡的過程中，引起另一個病理 學標記物即tau蛋白的磷酸化等，并與因阿爾茨海默病發(fā)生的癥狀一致，因此認為該淀粉 樣蛋白球體是腦內(nèi)的0淀粉樣蛋白的毒性的真正原因。因此，如果得到(1)抑制淀粉樣蛋 白球體形成的抗體，或者(2)抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)系統(tǒng)細胞的毒性的抗體，則可以 用作阿爾茨海默病的治療或者預(yù)防藥。另外，如果得到(3)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比 對淀粉樣前體蛋白、0淀粉樣蛋白單體和0淀粉樣蛋白纖維等的反應(yīng)性高的抗體，則可應(yīng) 用到用來診斷阿爾茨海默病的測定。以淀粉樣蛋白球體為抗原的抗體的制作方法可以是已知的方法。另外，已得 到了兔多克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體(ASD2、ASD3)和小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗 體(MASD1、MASD2、MASD3) (W02006/016644號)(有時將與淀粉樣蛋白球體反應(yīng)的抗體稱 為“抗淀粉樣蛋白球體抗體”)。但是，還沒有得到對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性低、且與淀 粉樣蛋白球體發(fā)生特異性反應(yīng)、并抑制所述蛋白對神經(jīng)系統(tǒng)細胞的毒性的抗體。其中， W02006/016644號中記載的兔多克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體(ASD2、ASD3)和小鼠單克隆抗 淀粉樣蛋白球體抗體(MASD1、MASD2、MASD3)在本申請說明書中分別如下表示。ASD2 — rpASD2ASD3 — rpASD3MASD1 —mASDlMASD2 —mASD2MASD3 —mASD3非專利文獻1 :Selkoe, D. J.，Annu. Rev. Neurosci.，12,463-490(1989)非專利文獻 2 :Glenner, G. G. and Wong, C. ff. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 120(3) ,885-890(1984)
非專利文獻3 :Ihara，Y. et al.，J. Biochem.，99，1807-1810 (1986)非專利文獻4 :Grundke-Iqbal, I. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，83，4913—4917 (1986)非專利文獻 5 Lorenzo, A. and Yankner, B. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，91， 12243-12247(1994)非專利文獻6 Yankner, B. A.，et. al.，Science, 250，279-282 (1990)非專利文獻7 :Hoshi, M.，et. al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，100，6370-6375 (2003)專利文獻1 日本特開2001-247600號公報專利文獻2 :W02006/016644 號

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于得到對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng) 性高、對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對日淀粉樣蛋白纖維或日淀粉樣蛋白單體蛋白的反 應(yīng)性高的抗體、或者對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高、且具有 抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性的抗體。此外，本發(fā)明的課題還在于提 供使用上述抗體的阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防藥物的篩選方法，以及阿爾茨海默病個 體的檢測方法。此外，本發(fā)明的課題還在于提供使用上述抗體的神經(jīng)細胞保護劑、阿爾茨海 默病的檢測用的試劑、以及阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防藥物等藥品。此外，本發(fā)明的課 題還在于提供用于檢測上述抗體的固相載體。此外，本發(fā)明的課題還在于提供產(chǎn)生上述抗 體的雜交瘤。本發(fā)明人等為了解決上述課題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下述抗體對淀粉樣前體 蛋白的反應(yīng)性低、對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對日淀粉樣蛋白纖維或日淀粉樣蛋白單 體蛋白的反應(yīng)性高，并且還具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性所述 抗體為用淀粉樣蛋白球體對倉鼠進行皮下免疫，利用從該動物得到的脾細胞構(gòu)建雜交瘤， 由該雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。另外，還發(fā)現(xiàn)該抗體對人正常組織的交叉反應(yīng)性低、而與阿 爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應(yīng)。本發(fā)明是基于這些認識而完成的發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明，提供以下的發(fā)明。(1) 一種抗體，其對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高，且 具有以下的任意1個以上的特征。(i)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高；(ii)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高；(iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性。(2)根據(jù)(1)所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原 蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和3淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的體 系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的3倍以上。(3)根據(jù)(1)或(2)所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同 的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng) 性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的5倍以 上。(4)根據(jù)⑴ (3)中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和0淀粉樣蛋白單 體蛋白的反應(yīng)性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對日淀粉樣蛋白單體蛋白 的反應(yīng)性的50倍以上。(5)根據(jù)⑴ ⑷中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量 以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和0淀粉樣蛋白單 體蛋白的反應(yīng)性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對日淀粉樣蛋白單體蛋白 的反應(yīng)性的500倍以上。(6)根據(jù)⑴ (5)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是以淀粉樣蛋白球體為 抗原得到的。(7)根據(jù)⑴ (6)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是單克隆抗體。(8)根據(jù)(7)所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的解離常數(shù)為10-9以 下。(9)根據(jù)(1) (8)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體在不顯示對人正常組織 的顯著的交叉反應(yīng)性的情況下，與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應(yīng)。(10)根據(jù)⑴ (9)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的立 體結(jié)構(gòu)特異性表位進行識別。(11)根據(jù)(1) (10)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體為來自倉鼠的抗體。(12)根據(jù)(1) (11)中任一項所述的單克隆抗體，其中，所述抗體是由保藏編號 為FERM BP-10871或FERM BP-10872的雜交瘤產(chǎn)生的。(13) 一種人源化抗體，其是通過對由保藏編號為FERM BP-10871或FERM BP-10872的雜交瘤產(chǎn)生的倉鼠單克隆抗體進行人源化而得到的。(14) (13)所述的人源化抗體或其片段，其包含人源化重鏈和人源化輕鏈，所述人源化重鏈包含來源于由保藏編號為FERM BP-10872的雜交瘤產(chǎn)生的倉鼠單 克隆抗體的3個重鏈互補決定區(qū)(CDRs)、和來源于人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)框架序 列；所述人源化輕鏈包含來源于由保藏編號為FERM BP-10872的雜交瘤產(chǎn)生的倉鼠單 克隆抗體的3個輕鏈互補決定區(qū)(CDRs)、和來源于人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)框架序 列；并且，3個重鏈互補決定區(qū)(⑶Rs)分別具有下述氨基酸序列重鏈CDR1 :Asp Tyr Phe Met Ser(序列號 11)；重鏈CDR2:Gly lie Glu lie Lys Ser Tyr Phe Tyr Ala Thr Tyr Tyr Phe GlySer Val Lys Gly(序列號 12)；和重鏈CDR3 :Asn Arg Glu Val Gly Gly Leu Asp Asn(序列號 13)；3個輕鏈互補決定區(qū)(⑶Rs)分別具有下述氨基酸序列輕鏈CDR1:Thr Leu Arg Ser Gly lie Ser Val Gly Gly Lys Asn lie Tyr(序列 號 14)；輕鏈CDR2 :Tyr Ser Ser Tyr Ser Asn Lys Gin Leu Gly Pro (序列號 15)；禾口輕鏈CDR3 :Ser lie His Glu Ser Asn Ala Tyr Val (序列號 16)。(15) (13)所述的人源化抗體或其片段，其包含人源化重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；
(16) (15)所述的人源化抗體或其片段，其具有序列號5記載的氨基酸序列的重鏈 可變區(qū)和序列號7記載的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。(17) 一種阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防藥物的篩選方法，其包括使受檢物和 (1) (16)中任一項所述的抗體與淀粉樣蛋白球體接觸，并以受檢物對淀粉樣蛋白球體的 結(jié)合性為指標來選擇候補物質(zhì)。(18) 一種阿爾茨海默病個體的檢測方法，其包括使從懷疑具有阿爾茨海默病的 個體獲得的生物試樣與(1) (16)中任一項所述的抗體接觸，測定該樣品中有無與該抗體 發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。(19) 一種神經(jīng)細胞保護劑，其含有(1) (16)中任一項所述的抗體。(20) 一種阿爾茨海默病的檢測用的試劑，其含有(1) (16)中任一項所述的抗體。(21) 一種藥品，其含有(1) (16)中任一項所述的抗體。(22) 一種阿爾茨海默病的治療和/或者預(yù)防藥物，其含有(1) (16)中任一項所 述的抗體。(23)用于檢測(1) (16)中任一項所述的抗體的固相載體，其特征在于，其是包 覆淀粉樣蛋白球體而成的。(24) 一種產(chǎn)生(7)或⑶所述的抗體的雜交瘤。(25)保藏編號為 FERM BP-10871 或 FERM BP-10872 的雜交瘤。(26) 一種核酸，其含有對(13) (16)中任一項所述的人源化抗體的重鏈或輕鏈 進行編碼的序列或其片段。(27) 一種用于表達(13) (16)中任一項所述的人源化抗體或片段的表達載體， 其含有對所述抗體或片段進行編碼的核苷酸序列。本發(fā)明的抗體由于對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性低、且對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性 比對3淀粉樣蛋白纖維或3淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高，并且具有抑制淀粉樣蛋白 球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性，因此可用作阿爾茨海默病的治療或者預(yù)防藥，另外，還 可應(yīng)用于阿爾茨海默病個體的檢測。


圖1為表示分析本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應(yīng)性獲得的 淀粉樣蛋白球體固相ELISA的結(jié)果的曲線圖。圖2為表示分析本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應(yīng)性獲得的 點印跡的結(jié)果的曲線圖。圖3為表示分析本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的表位獲得的結(jié) 果的圖。圖4為表示本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的抑制淀粉樣蛋白球 體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性獲得的結(jié)果的曲線圖。圖5為分析市售抗體(6E10)的反應(yīng)性獲得的Western印跡的結(jié)果的曲線圖。圖6為表示分析小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體(mASDl、mASD2、mASD3)的反應(yīng) 性獲得的Western印跡的結(jié)果的曲線圖。
圖7為表示本發(fā)明的倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應(yīng)性獲得的 Western印跡的結(jié)果的曲線圖。圖8為表示代表性的小鼠單克隆抗體和倉鼠單克隆抗體對人正常組織組的反應(yīng) 性的圖。圖9為表示對纖維狀淀粉樣蛋白球體和ASPD的抗體特異性的電子顯微鏡照片。圖10為表示人源化抗體RHA/RLA(huASD2)的重鏈可變區(qū)的DNA序列、氨基酸序列 和CDR1、2、3的位置的圖。圖11為表示人源化抗體RHA/RLA(huASD2)的輕鏈可變區(qū)的DNA序列、氨基酸序列 和CDR1、2、3的位置的圖。圖12為表示人源化抗體RHB/RLB的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和⑶Rl、2、3的位置 的圖。圖13為表示人源化抗體RHB/RLB的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和⑶Rl、2、3的位置 的圖。圖14為表示人源化抗體RHC/RLC的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和⑶Rl、2、3的位置 的圖。圖15為與通過本發(fā)明得到的三種人源化抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列對比地 示出了 CDR1、2、3的位置的圖。將RHA/RLA (huASD2)、RHB/RLB和RHC/RLC的重鏈分別表示為 ADS2RHA.ADS2RHB和ASD2RHC。其中，ASD2RHC由于與ADS2RHA是相同的序列，因此省略了。 將 RHA/RLA (huASD2) .RHB/RLB 和 RHC/RLC 的輕鏈分別表示為 ADS2RLA、ADS2RLB 和 ASD2RLC。圖16為表示huASD2抗體抑制DF-ASPD對凋亡的誘導的抑制效果的圖。圖17為表示haASD2和huASD2抗體抑制DF-ASPD對細胞死亡的誘導的效果的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高、且具 有下述任意1個以上的特征(下文有時將它們稱為“抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體”)。(i)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高；(ii)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高；(iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性。本發(fā)明還涉及使用上述抗體的阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防藥物的篩選方法、 阿爾茨海默病個體的檢測方法、阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防藥物等藥品、以及產(chǎn)生上 述抗體的雜交瘤。以下對它們進行詳細說明，但下文對本發(fā)明的說明僅僅是本發(fā)明實施方 式的一個例子(代表例)，本發(fā)明的范圍并不限于這些內(nèi)容。(1)抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的特征在于其對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng) 性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高，并表示為下述方式。根據(jù)第一方式，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng) 性比對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高?！皩Φ矸蹣拥鞍浊蝮w的反應(yīng)性”是指與通過下述方 法形成的淀粉樣蛋白球體發(fā)生反應(yīng)。該抗體的反應(yīng)性的測定可以通過其本身通常使用的方 法來進行，當利用這些方法進行測定時，如果所述抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對3淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高，則其包含在本發(fā)明的抗體中。根據(jù)優(yōu)選的方式，抗體對淀粉樣 蛋白球體的反應(yīng)性是對β淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的3倍以上，更優(yōu)選為4倍以上、最優(yōu) 選為5倍以上。此時，可以對使用相同的抗體濃度和量、相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量 時的反應(yīng)性進行比較。另外，以與淀粉樣蛋白球體發(fā)生特異性反應(yīng)、不與β淀粉樣蛋白纖 維發(fā)生反應(yīng)為特征的抗體也包含在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白特異性抗體中。根據(jù)第二方式，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng) 性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高。此時，抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣 蛋白球體的反應(yīng)性優(yōu)選是對β淀粉樣蛋白單體蛋白(Αβ)的反應(yīng)性的50倍以上、更優(yōu)選 為100倍以上、最優(yōu)選為500倍以上。此時，可以對使用相同的抗體濃度和量、相同的抗原 蛋白濃度和抗原蛋白量時的反應(yīng)性進行比較。當在阿爾茨海默病模型動物或臨床試驗中給予抗Αβ抗體時，可確認誘發(fā)腦出 血。該出血認為是由抗體對腦血管淀粉樣蛋白的結(jié)合所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)引起的，是用抗A β 抗體進行治療的副作用。腦血管淀粉樣蛋白的沉積在80 90%的阿爾茨海默病患者中可 見，被稱為A β型腦淀粉樣血管病(Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA)。與阿爾茨海默 病中的老年斑的淀粉樣蛋白以Αβ42為主要成分不同，CAA中的沉積以Αβ 40為主體。由 此，作為本發(fā)明中的抗體，特別優(yōu)選選擇性地與淀粉樣蛋白球體反應(yīng)、而對A β 40的反應(yīng)性 低的抗體。具體而言，本發(fā)明中的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng) 性優(yōu)選是對A β 40的反應(yīng)性的50倍以上、更優(yōu)選是100倍以上、最優(yōu)選是500倍以上。本發(fā)明顯示與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體具有高反應(yīng)性的“淀粉樣蛋白球體” 是指β淀粉樣蛋白單體蛋白發(fā)生自締合且具有粒狀形態(tài)的物質(zhì)。“粒狀形態(tài)”是指只要呈現(xiàn) 粒狀則可以是任何形狀，包括顆粒狀、細粒狀、晶體、聚集塊等全部。粒徑通常為約10 約 20nm、優(yōu)選為約10 約15nm、更優(yōu)選為約10 約12nm、特別優(yōu)選為約12nm左右。另外，關(guān) 于淀粉樣蛋白球體，其蛋白質(zhì)濃度為約1 μ g/ml以下、優(yōu)選為約0. 45μ g/ml以下，且具有誘 導神經(jīng)系統(tǒng)細胞發(fā)生細胞死亡的高的神經(jīng)細胞死亡活性。另外，當用甘油密度梯度離心法 對具有所述物性的淀粉樣蛋白球體進行分級時，能夠得到甘油濃度為約15%以上的級分。作為本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應(yīng)性的測定方法，可列舉 出例如免疫印跡法、點印跡法、ELISA法等其本身已知的免疫學測定法、或使用電子顯微鏡 觀察的方法等。另外，作為此時的比較對照的β淀粉樣蛋白單體是指由約40個氨基酸殘 基構(gòu)成的蛋白，其在機體中，通過蛋白酶介導的過程由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)產(chǎn)生。已 知根據(jù)該蛋白酶的種類和其后的修飾的不同而存在的各種種類，但根據(jù)在剛分泌后C末端 的氨基酸殘基的長度不同，主要存在β 40淀粉樣蛋白仏日^，序列號丨)和β 42淀粉樣蛋 白(Ai^42,序列號2)，另外β43淀粉樣蛋白(Ai^43,序列號3)也微量存在，β淀粉樣蛋 白單體包括它們中的任意一種。另外，也包括它們的部分多肽和衍生物。此外，β淀粉樣蛋 白纖維是指β淀粉樣蛋白自締合形成的纖維狀的纖維，其具有神經(jīng)細胞死亡活性。這樣的 β淀粉樣蛋白纖維包括例如從機體內(nèi)獲得的纖維或通過Lorenzo，A. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，91，12243-12247(1994)中所述的方法制造的纖維。根據(jù)第三方式，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體是具有抑制淀粉樣蛋白球 體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性的抗體?！暗矸蹣拥鞍浊蝮w對神經(jīng)細胞死亡的誘導”是指通 過上述或后述方法制備的淀粉樣蛋 球體誘導神經(jīng)細胞發(fā)生細胞死亡的活性，所誘導的細胞死亡可以是凋亡或壞死中的任意一種。另外，關(guān)于神經(jīng)細胞，只要是神經(jīng)系統(tǒng)細胞則沒有 特殊限制，可以使用哺乳動物(人、大鼠、小鼠、猴、豬等)來源的神經(jīng)系統(tǒng)細胞。也可以使 用從ES細胞等分化誘導得到的神經(jīng)細胞。作為原代培養(yǎng)細胞，可列舉出從上述動物的海馬 和前腦基底、大腦皮質(zhì)等獲得的神經(jīng)細胞。還包括培養(yǎng)上述動物的海馬等器官而獲得的細 胞。作為具有這樣的活性的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的特征，可列舉出例如對淀粉樣 蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白、日淀粉樣蛋白纖維或日淀粉樣蛋白單體蛋白的 反應(yīng)性高等。其中，可優(yōu)選使用對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性 的約10 約20倍的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體。本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體具有的抑制對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活 性是指，優(yōu)選具有完全抑制上述的淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的能力，但也包 括根據(jù)抗體的給藥量不同而部分地抑制的情況。關(guān)于抑制活性的具體的測定方法，如后所 述。另外，除了第一 第三中的任意1個以上的方式外，以在不顯示對人正常組織的 顯著的交叉反應(yīng)性的情況下、與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應(yīng)為特征的抗體也包括在本 發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。另外，第一 第三中的任意1個以上的方式或者前述的方式中，以識別淀粉樣蛋 白球體的立體結(jié)構(gòu)特異性表位為特征的抗體也包括在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性 抗體中。其中優(yōu)選以0淀粉樣蛋白單體蛋白的N末端為表位進行識別、或不以0淀粉樣 蛋白單體蛋白上的一次序列為表位進行識別為特征的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體?！耙?識別淀粉樣蛋白球體的立體結(jié)構(gòu)特異性表位為特征的抗體”是指，具體而言，只要淀粉樣蛋 白球體是自然的狀態(tài)就能夠結(jié)合、而在淀粉樣蛋白球體為改性狀態(tài)的情況下則不能結(jié)合的 抗體。以下對本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的具體的制造方法和上述的特征 的分析方法進行詳細說明。(2)淀粉樣蛋白球體(抗原)的制作本發(fā)明的抗體可以將具有下述性質(zhì)的淀粉樣蛋白球體作為抗原來得到。在本發(fā)明 中，淀粉樣蛋白球體是指3淀粉樣蛋白發(fā)生自締合、且具有粒狀形態(tài)的物質(zhì)?！傲钚螒B(tài)” 是指只要呈現(xiàn)為粒狀則可以是任意形狀，包括顆粒狀、細粒狀、晶體、聚集塊等全部。粒徑通 常為約10 約20nm、優(yōu)選為約10 約15nm、更優(yōu)選為約10 約12nm、特別優(yōu)選為約12nm 左右。另外，淀粉樣蛋白球體在蛋白質(zhì)濃度為約lPg/ml以下、優(yōu)選為約0.45i!g/ml以下 時具有誘導神經(jīng)系統(tǒng)細胞發(fā)生細胞死亡的高的神經(jīng)細胞死亡活性。另外，當用甘油密度梯 度離心法對具有所述物性的淀粉樣蛋白球體進行分級時，能夠得到甘油濃度為約15%以上 的級分。這種淀粉樣蛋白球體可以首先通過使含有0淀粉樣蛋白的水溶液對流(第一工 序)來進行制備。此外，為了制備高效地含有淀粉樣蛋白球體的溶液，可以使用將對流得到 的水溶液中的淀粉樣蛋白球體進行分級(第二工序)的方法。本發(fā)明的抗體的抗原也可以 使用上述任意的淀粉樣蛋白球體含有液。上文中的“ 0淀粉樣蛋白，，是指由約40個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，其是在機體中 通過蛋白酶介導的過程由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)產(chǎn)生的。已知根據(jù)所述蛋白酶的種類的不同以及經(jīng)過其后修飾的不同而存在各種種類，但根據(jù)在剛分泌后C末端的氨基酸殘基 的長度不同，主要存在β40淀粉樣蛋白仏^_4。，序列號1)和β42淀粉樣蛋白(Ah_42，序 列號2)，并且微量存在β 43淀粉樣蛋白(Α、，，序列號3)。淀粉樣蛋白球體的制備中優(yōu)選 使用例如剛分泌后的β淀粉樣蛋白的全長分子種即Αβ χ_4(ι、Αβ )(_42或40 χ_43、或者它們的突 變體或衍生物，其中特別優(yōu)選Ai^4tl或Ai^4215另外，β淀粉樣蛋白可以使用利用肽合成 機等合成的蛋白、市售的蛋白或從生物試樣提取精制而得到的蛋白等任意蛋白。當使用合 成肽作為β淀粉樣蛋白時，其合成、提取精制方法可以使用那些本身已知的通常使用的方 法。另外，合成肽的精制度只要按照能夠在高效液相色譜法中得到單一的峰的程度進行就 足夠了，作為精制方法，可以使用例如凝膠過濾、高效液相色譜法等。在本說明書中，有時也 將“β淀粉樣蛋白”稱為“β淀粉樣蛋白單體”、“β淀粉樣蛋白單體蛋白”、“Αβ ”、“Αβ單 體”。如此得到的β淀粉樣蛋白例如溶解于滅菌精制水中，用于淀粉樣蛋白球體含有液的制 備。溶解所用的滅菌精制水的量只要是β淀粉樣蛋白溶解的范圍即可，但優(yōu)選水溶液中的 β淀粉樣蛋白的濃度為達到約50ηΜ 約2mM、優(yōu)選為約1 μ M 約ImM、更優(yōu)選為約50 約 700 μ M的范圍。優(yōu)選將該溶液調(diào)節(jié)成適當?shù)柠}濃度。鹽濃度只要是β淀粉樣蛋白能夠溶 解的范圍則任何濃度均可，例如最終的PH為約3 約11、優(yōu)選為約5. 5 約8. 5、更優(yōu)選為 約7. 5，鹽優(yōu)選為約IM以下。作為調(diào)節(jié)至這樣的鹽濃度的方法，可以使用例如將PBS(-)與 β淀粉樣蛋白水 溶液等量添加的方法。溶解的方法只要是β淀粉樣蛋白在適量的適當鹽 濃度的溶液中完全溶解的方法，則沒有特殊限制。關(guān)于淀粉樣蛋白球體含有液的制備方法的第一工序，可列舉出例如日本特開 2001-247600號公報中記載的工序。雖然如此得到的淀粉樣蛋白球體含有液即使不經(jīng)任何 處理也具有誘導神經(jīng)細胞死亡的活性，能夠作為本發(fā)明的抗原使用，但進行作為第二工序 的分級，能夠得到具有更高的神經(jīng)細胞死亡活性的級分。作為分級的方法，可以使用例如日 本特開2002-105099號公報中記載的方法。如此得到的淀粉樣蛋白球體含有液在根據(jù)需要 進行了濃縮等處理后，可作為抗原用于以下的免疫工序中。作為確認淀粉樣蛋白球體形成的方法，可列舉出下述的對神經(jīng)細胞死亡活性進行 分析的方法或利用電子顯微鏡進行測定的方法等。電子顯微鏡的測定方法只要是能夠分析 淀粉樣蛋白球體的粒徑的方法、且是在淀粉樣蛋白球體的自締合不受損傷的情況下能夠進 行觀察的方法，則可以是任何方法。具體而言，例如，首先在直徑為18mm左右的玻璃皿等中 加入30 40°C的蒸餾水，向其水面滴加約30 μ 1左右的火棉膠1. 5% (W/V)醋酸異戊酯溶 液等，溶劑立即揮發(fā)生成薄膜。將該支撐膜張貼到柵格上干燥后，真空蒸鍍碳并使用利用輝 光放電的親水化處理裝置對表面進行親水化。接著，使張貼有所述支撐膜的柵格面朝下，與 含有制備后的淀粉樣蛋白球體的溶液的小滴接觸，立即用濾紙擦去多余的水分，并添加醋 酸鈾溶液進行觀察。優(yōu)選下述方法等在穩(wěn)定的100 120kV的高壓加速下使用電子顯微 鏡，為了防止電子射線破壞試樣，使用柵格的端部等進行像散校正，然后使用電子射線損傷 降低法進行觀察。(3)將淀粉樣蛋白球體作為抗原的抗體的制備關(guān)于獲得上述(2)中所述的將淀粉樣蛋白球體作為抗原的抗體的方法，只要是能 夠獲得具有對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高、且具有下述任意 1項以上的特征的抗體的方法，則沒有特殊限制。具體而言，優(yōu)選可以使用下文詳細記載的方法。(i)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高；(ii)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高；(iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性。關(guān)于抗原，將上述(2)中所述的淀粉樣蛋白球體與通常作為載體的KLH(匙孔血藍 蛋白)、BSA (牛血清白蛋白)、OVA (卵清蛋白)等蛋白質(zhì)或高分子體結(jié)合或者聚合而得到的 抗原作為免疫用抗原使用，但載體并不是必需的。另外，也可以將通過不同載體的結(jié)合法制 備的多種抗原混合制成免疫用抗原。用于免疫的動物沒有特殊限定，兔、山羊、綿羊、倉鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、雞、除了產(chǎn) 生人抗體的人以外的動物等均可以使用。優(yōu)選使用倉鼠。充分混合弗氏完全佐劑或弗氏 不完全佐劑與免疫用抗原后，對免疫用抗原的動物在皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)進行接種。每2 周 5周實施1次接種，持續(xù)到免疫動物的抗體對接種的抗原的反應(yīng)性充分上升為止。1次 免疫的抗原的量只要是免疫動物的抗體的反應(yīng)性能夠充分上升的量，則沒有特殊限制，具 體而言，優(yōu)選為約1 約100 y g。另外，關(guān)于免疫的次數(shù)，優(yōu)選反復從經(jīng)免疫的動物采血，用 后述的方法檢測該血中所含的抗體對抗原的反應(yīng)性，直至對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對 3淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高為止。具體而言，優(yōu)選為5 20次。在從最后的免疫過7 10日后，從該動物采集血液、腹水等。優(yōu)選例如采集全血， 用離心分離等方法制備血清。關(guān)于該血清中所含的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體 的反應(yīng)性的測定方法，只要是能夠分析與上述(2)中制備的淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性的方 法，則可以是任意方法，例如可列舉出用熒光物質(zhì)等對上述淀粉樣蛋白球體進行標記，使其 與上述血清反應(yīng)，然后測定與該抗體結(jié)合的標記劑的活性的方法等。具體而言，可列舉出上 述的利用電子顯微鏡觀察的方法、后述的ELISA法等酶免疫測定法、免疫印跡法或點印跡 法等。其中，對于本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體，當測定比較與0淀粉樣蛋白纖 維的反應(yīng)性時，可以優(yōu)選使用利用電子顯微鏡觀察的方法，當測定比較0淀粉樣蛋白單體 蛋白與作為其自締合體的淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性時，可以優(yōu)選使用點印跡法或ELISA法 等酶免疫測定法。另外，通過比較3淀粉樣蛋白纖維、3淀粉樣蛋白單體蛋白或它們的部 分多肽與發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體的反應(yīng)性，能夠選擇性地獲得本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體 特異性抗體?？贵w的分離精制可以利用其本身已知的免疫球蛋白的分離精制法來進行精制。具 體而言，可列舉出鹽析法、醇沉淀法、等電點沉淀法、電泳法、利用離子交換體的吸附法、超 離心分離法、凝膠過濾法、利用抗原抗體結(jié)合物或活性吸附劑來僅對特異性抗體進行吸附 分離的方法等。如此制作的抗體為多克隆抗體，其可以以IgG為主要成分并包含IgM、IgA等其他 的免疫球蛋白。另一方面，當制備單克隆抗體時，對上述免疫動物僅靜脈注射作為通?？乖牡?粉樣蛋白球體，在其2 5日、優(yōu)選3日后采集認為包含抗體產(chǎn)生細胞的脾臟或者淋巴結(jié)， 使該脾臟細胞或淋巴細胞與腫瘤細胞發(fā)生細胞融合。其后，將經(jīng)細胞融合并永生化的抗體 產(chǎn)生細胞(雜交瘤)分離。這里使用的腫瘤細胞優(yōu)選與通常從經(jīng)免疫的動物制備的脾臟 細胞或者淋巴細胞為相同種，但異種動物間的細胞也可以。另外，作為永生化的方法，還可以使用除細胞融合以外的公知的方法。例如，也可以利用使用了 EB病毒(Epstein-Barr virus)的轉(zhuǎn)化法(D. Kozbor 等，Eur J Immunol，14 :23 (1984))來進行。作為腫瘤細胞的例子，使用p3 (p3/x63-Ag8)、P3Ul、NS-l、MPC-ll、SP2/0_Agl4、F0、 x63. 6. 5. 3、S194、R210等骨髓瘤細胞。細胞融合可以按照通常進行的方法，例如《單夕口 一 乂抗體実験二二 7卟》(講談社寸^ > r ^ 7 ^ ^ 1987年出版)，G. K0HLERANDC. MILSTEIN, Nature, 256,495 (1975)中記載的方法等來實施。細胞融合可以通過將細胞融合 促進劑加入到懸浮有要融合的細胞的融合培養(yǎng)基中來實施。作為細胞融合促進劑，可列舉 出仙臺病毒或平均分子量為1000 6000的聚乙二醇等。此時，為了進一步提高融合效率， 可以將二甲基亞砜等助劑或IL-6等細胞因子添加到融合培養(yǎng)基中。關(guān)于腫瘤細胞與進行 了免疫的脾臟細胞或者淋巴細胞的混合比，可以使用例如相對于腫瘤細胞為約1倍 約10 倍左右的脾臟細胞或者淋巴細胞。作為上述融合培養(yǎng)基，可以使用ERDF培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、GIT 培養(yǎng)基等通常的各種培養(yǎng)基，融合時通?？梢灶A(yù)先將胎牛血清(FBS)等血清從培養(yǎng)基中除 去。融合通過如下方法來實施將規(guī)定量的進行了上述免疫的脾臟細胞或淋巴細胞與腫瘤 細胞在上述培養(yǎng)基內(nèi)充分混合，加入約20 約50%左右的預(yù)先加熱到37°C左右的聚乙二 醇溶液，優(yōu)選使其在30 37°C下反應(yīng)1 10分鐘左右。之后，反復進行逐次添加適當?shù)呐?養(yǎng)基并離心以除去上清夜的操作。將目標雜交瘤在通常的選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤 和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。為了使除目標雜交瘤以外的細胞(未融合細胞 等)死亡，在該HAT培養(yǎng)基中的培養(yǎng)可以進行足夠的時間通常為數(shù)日 數(shù)周。得到的雜交瘤產(chǎn)生的抗體包含在上述雜交瘤的培養(yǎng)上清液中。通過與測定上述多 克隆抗體的方法同樣地測定該抗體的反應(yīng)性或反應(yīng)特異性等，可以選擇性獲得產(chǎn)生本發(fā)明 的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的雜交瘤。通過將得到的雜交瘤利用有限稀釋法進行克隆，可以得到產(chǎn)生單一的單克隆抗體 的雜交瘤克隆。該雜交瘤克隆使用加入有約1 約10%左右的預(yù)先除去了 FBS中所含的牛 抗體(igG)的ras的培養(yǎng)基或者無血清用培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)上清液作為精 制目標單克隆抗體的原料。另一方面，也可以將得到的雜交瘤克隆移植到預(yù)先給予了姥鮫 烷的Balb/c小鼠或者Balb/cOm/nu)小鼠的腹腔內(nèi)，在10 14日后采集高濃度地含有單 克隆抗體的腹水，作為精制目標單克隆抗體的原料。精制單克隆抗體的方法可以通過使用 通常的免疫球蛋白精制法例如硫酸銨分級法(ammoniumsulfate fractionation)、聚乙烯 分級法、乙醇分級法、陰離子交換色譜法、結(jié)合有蛋白A、蛋白G或抗小鼠免疫球蛋白抗體等 的親和色譜法等來實施。如此得到的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體可以直接使用，也可以以 通過規(guī)定的方法即番木瓜蛋白酶處理得到的Fab形式或者以通過胃蛋白酶處理得到的 F(ab' )2或？油'的形式使用。另外，通過其本身已知的方法獲得含有該抗體的H鏈和L 鏈這兩可變區(qū)內(nèi)的互補決定區(qū)(CDR)、或超可變區(qū)等的片段或編碼它們的基因，此外人型的 抗體也包含在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。此外，使用噬菌體展示法或人抗 體產(chǎn)生小鼠等制備的完全人抗體也包含在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。此 外，上述產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞系也包含在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的雜交瘤的具體例子，可列舉出在以下的實施例中獲得的具有保藏編號為FERM BP-10871或者為FERM BP-10872的雜交瘤。將非人(小鼠、大鼠、倉鼠、兔等)抗體人型化后得到的抗體(以下稱為人源化抗 體)是嵌合體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab'、F(ab' )2或者抗體之 外的抗原結(jié)合亞序列)，其包含非人免疫球蛋白來源的最小序列。作為人源化抗體，特別優(yōu) 選通過改變具有非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)的抗體的序列，由人抗體生殖胚系來源的氨 基酸序列部分地或整體地構(gòu)成的抗體。這種改變通過用人抗體的恒定區(qū)替換非人抗體恒定 區(qū)來實現(xiàn)，能夠制成在醫(yī)藥應(yīng)用中具有可容許程度的低的免疫原性的人/非人嵌合體。更 優(yōu)選甚至是將抗體的可變區(qū)和CDR通過到目前為止本領(lǐng)域所公知的技術(shù)進行人源化。有時 也將可變區(qū)的框架區(qū)用相應(yīng)的人框架區(qū)替換，非人CDR實質(zhì)上沒有變化或者被其人基因組 來源的序列替換。人源化抗體進一步是包含人框架和至少1個非人抗體來源的⑶R的抗體，這里存 在的任意的恒定區(qū)表示與人免疫球蛋白恒定區(qū)實質(zhì)上相同。實質(zhì)上相同表示至少85 100%、優(yōu)選95 100%的氨基酸序列相同。即，該人源化抗體的除了 CDR部分外的所有部 分和與1個或1個以上的天然的人免疫球蛋白序列對應(yīng)的部分相同。人源化抗體在作為藥品用于人的治療的情況下，與非人抗體和嵌合體抗體相比至 少具有3個優(yōu)點。1)由于效應(yīng)部分為人，因此與人體內(nèi)的免疫反應(yīng)中的其他因子的相互作用良好。 例如，通過補體依賴性細胞毒性(CDC)或者抗體依賴性細胞毒性(ADCC)高效地破壞靶細 胞。2)認為人免疫系統(tǒng)不會將人源化抗體的框架或者恒定區(qū)作為外源物進行識別。因 此，認為當將該人源化抗體給予人體內(nèi)時，抗原抗體反應(yīng)比對非人抗體或者嵌合體抗體的 反應(yīng)低。3)還報告在人的循環(huán)系統(tǒng)中，給予的非人抗體的半衰期比人抗體的短。在給予了 人源化抗體的情況下，期待具有與天然的人抗體本質(zhì)上相同的半衰期，給藥量和給藥頻率 可以更少。將非人抗體進行人源化的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如通過Winter等的方法(日 本專利第 2912618 號公報)、Jones 等的方法(Nature, 321 :522 (1986) )、Riechmann 等的方 法(Nature, 332 :323(1988))、Verhoeyen 等的方法(Science, 239 1534 (1988))、Queen 等 的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869(1991))等來實施。在獲得人源化抗體的作業(yè) 中，為了使表達人源化抗體的宿主細胞中的表達最優(yōu)化，優(yōu)選進行密碼的沉默突變(例如 Nakamura等的方法Nuclecic Acid Res 29:292(2000))。如此得到的抗體只要具有本申 請所述的特異性，則下述人源化抗體也包含在本申請發(fā)明中，該人源化抗體的特征在于其 在所述可變區(qū)中具有1個以上的氨基酸的缺失、替換、插入或者添加形成的氨基酸序列。(4)抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應(yīng)性的測定下面說明用于測定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應(yīng)性的 ELISA、點印跡法的具體的方法的例子。作為ELISA，可列舉出例如固相ELISA、液相ELISA 等。另外，還可以測定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的解離常數(shù)?？贵w的 解離常數(shù)的測定可以使用BIACore(BIAC0RE公司制)等儀器或通過按照它的方法來進行。
(a)包覆淀粉樣蛋白球體的固相載體和淀粉樣蛋白球體固相ELISA通過使用包覆有淀粉樣蛋白球體的固相載體來測定抗淀粉樣蛋白球體特異性抗 體對抗原的反應(yīng)性，能夠?qū)沟矸蹣拥鞍浊蝮w特異性抗體進行測定。這里，作為固相載體， 可列舉出聚苯乙烯、聚丙烯等塑料制的球狀、棒狀、板狀等的載體，優(yōu)選塑料制板。為了使淀 粉樣蛋白球體包覆到固相載體上，可列舉出使用常用方法例如吸附法、交聯(lián)劑的方法等，從 簡便性出發(fā)，優(yōu)選使用使淀粉樣蛋白球體物理吸附的吸附法。作為使用了包覆淀粉樣蛋白球體的固相載體的測定法，具體而言，可列舉出淀粉 樣蛋白球體ELISA。首先，在Nunc公司制等的ELISA板上涂布上述(2)中制備的淀粉樣 蛋白球體。此時，溶劑只要不使淀粉樣蛋白球體脫締合，可以是任意溶劑，但優(yōu)選使用例如 PBS(-)。將該板用適當?shù)娜芤?、例如含?. 05% Tween20等表面活性劑的生理鹽水等洗滌， 用牛血清白蛋白/磷酸緩沖液(Phosphate buffered saline :PBS)等封閉，然后使之與上 述得到的抗體反應(yīng)。之后，在進一步洗滌后，使之作為第二抗體(二抗)和與免疫動物的免 疫球蛋白反應(yīng)的抗體接觸。同樣地洗滌后，以被標記物的活性等為指標，檢測結(jié)合在板上的 所述第二抗體。這種被標記物的活性可以使用例如ELISA酶標儀(ELISA plate reader)等 進行測定。另外，使用淀粉樣蛋白球體ELISA，可以確定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性 抗體的抗原決定部位(表位)。具體而言，通過淀粉樣蛋白球體ELISA，可以測定0淀粉樣 蛋白單體蛋白的片段與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的結(jié)合競爭抑制并確定表位。也可以 多個組合0淀粉樣蛋白單體蛋白的片段。此外，通過淀粉樣蛋白球體ELISA，可以測定表位 已知的抗體與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的結(jié)合競爭抑制并確定表位。此外，表位的確 定可以通過 “Antibodies :A LABORATORY MANUAL” (Ed Harlow et al.，ColdSpringHarbor Laboratory(1988))等的實驗書中記載的方法或通過按照它的方法來進行。(b)淀粉樣蛋白球體液相ELISA使含有抗淀粉樣蛋白球體的抗體的樣品例如雜交瘤培養(yǎng)上清液與淀粉樣蛋白球 體在室溫下混和1小時以上并反應(yīng)。向預(yù)先涂布了適量的兔抗淀粉樣蛋白球體IgG并用例 如牛血清白蛋白/PBS封閉的ELISA板上添加一定量的上述混合液，并使其在室溫下反應(yīng)1 小時以上。然后，在進一步洗滌后，使其作為第二抗體和與樣品中的免疫球蛋白反應(yīng)的抗體 例如抗小鼠IgG抗體、抗小鼠IgM、抗小鼠免疫球蛋白接觸。同樣地洗滌后，以被標記物的活 性等為指標檢測板上結(jié)合的所述第二抗體。這種被標記物的活性可以使用例如ELISA酶標 儀等來進行測定。(c) 0淀粉樣蛋白單體ELISA使含有抗體的樣品例如雜交瘤培養(yǎng)上清液與在N末端結(jié)合有生物素的0淀粉樣 蛋白單體蛋白或在C末端結(jié)合有生物素的0淀粉樣蛋白單體蛋白混合并在室溫下反應(yīng)1 小時以上。將該混合液添加到預(yù)先用牛血清白蛋白/PBS封閉的鏈霉親和素ELISA板上，使 其在室溫下反應(yīng)30分鐘以上。然后，在洗滌后使其作為第二抗體和與樣品中的免疫球蛋白 反應(yīng)的抗體例如抗小鼠IgG抗體、抗小鼠IgM、抗小鼠免疫球蛋白接觸。同樣地洗滌后，以被 標記物的活性等為指標檢測板上結(jié)合的所述第二抗體。這種被標記物的活性可以使用例如 ELISA酶標儀等進行測定。(d)點印跡法下面說明用于測定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應(yīng)性的點印跡法的具體方法的例子。首先，使用Bio Rad公司制等的市售的Blotter等，將適量的上 述(2)中制備的淀粉樣蛋白球體在硝酸纖維素膜等上印跡。此時，溶劑只要不使淀粉樣蛋 白球體脫締合，則可以是任意溶劑，優(yōu)選使用例如PBS(-)。除了對淀粉樣蛋白球體進行印 跡(blotting)以外，也對0淀粉樣蛋白單體蛋白或其部分肽、溶劑本身進行印跡以作為對 照。在將該膜用適當?shù)木彌_液例如磷酸緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)等洗滌 并用脫脂乳/TTBSCTween-Tris buffered saline)等封閉后，使膜與上述得到的抗體接觸， 然后，在進一步用TTBS等洗滌后，使其作為第二抗體和與免疫動物的免疫球蛋白反應(yīng)的抗 體接觸，將其同樣地洗滌后，以被標記物的活性等為指標檢測膜上結(jié)合的所述第二抗體。作 為對照，優(yōu)選使用與0淀粉樣蛋白單體蛋白反應(yīng)的抗體。作為這樣的抗體，可列舉出例如 “6E10” (Senetek 公司制)等。(5)抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性的分析下面說明本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體具有的、抑制淀粉樣蛋白球體對 神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性(下文有時也將其稱為“神經(jīng)細胞毒性中和活性”或者“抑制神 經(jīng)細胞死亡誘導的活性”)的分析方法的例子。首先，使用了淀粉樣蛋白球體的神經(jīng)細胞死亡的誘導可以如下進行在神經(jīng)系統(tǒng) 的細胞等的培養(yǎng)液中添加上述淀粉樣蛋白球體，按照通常的方法進行培養(yǎng)。這里，當分析 本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體是否具有該神經(jīng)細胞毒性中和活性時，可以如下進 行在抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的存在下，將上述神經(jīng)細胞與淀粉樣蛋白球體一起培 養(yǎng)，確認未誘導神經(jīng)細胞死亡。由淀粉樣蛋白球體誘導的細胞死亡可以是凋亡或壞死中的 任意一種。另外，作為使用的細胞，只要是神經(jīng)系統(tǒng)細胞，則沒有特殊限制，優(yōu)選哺乳動物 (人、大鼠、小鼠、猴、豬等)來源的神經(jīng)系統(tǒng)細胞。另外，優(yōu)選原代培養(yǎng)細胞。作為原代培養(yǎng) 細胞，優(yōu)選從上述動物的海馬和前腦基底、大腦皮質(zhì)等獲得的細胞。另外，也可以直接使用 將上述動物的海馬等器官培養(yǎng)得到的細胞。另外，也可以使用從ES細胞等分化誘導得到的 神經(jīng)細胞。這些細胞或器官可以按照通常的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。具體而言，作為神經(jīng)系統(tǒng) 細胞的原代培養(yǎng)和神經(jīng)系統(tǒng)已構(gòu)建細胞株的培養(yǎng)方法，可以使用Hoshi，M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，93，2719-2723(1996)和 Schubert, D. et al. , Nature,249(454), 224-227(1974)中記載的方法等，關(guān)于器官培養(yǎng)，可以使用Gary Banker and Kimbery Goslin, Culturing nerve cells, 2ndEdition, MIT Press, Cambridge (1998)中記載的方 法等。為了誘導這樣培養(yǎng)的神經(jīng)系統(tǒng)的細胞和器官發(fā)生細胞死亡，所添加的淀粉樣蛋白球 體的量可以適當選擇，淀粉樣蛋白球體通常能夠與阿爾茨海默病等的患者的腦內(nèi)存在的毒 性3淀粉樣蛋白以實質(zhì)上同等的濃度誘導細胞死亡。例如，上述(2)中得到的淀粉樣蛋 白球體如上所述，能夠以培養(yǎng)液中的0淀粉樣蛋白濃度為約lyg/ml以下、更優(yōu)選為約 0. 45ug/ml以下等的量誘導原代培養(yǎng)細胞發(fā)生細胞死亡。但是，上述濃度僅是為了舉例，并 不受該量的限定。存在于該培養(yǎng)中的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的量可以根據(jù)所用的 抗體對抗原的反應(yīng)性來適當選擇，具體而言，優(yōu)選例如以約0. 0001 約lmg/ml的量存在。 另外，抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體向所述培養(yǎng)液中添加的時期只要能夠確認神經(jīng)細胞毒 性中和活性，則沒有特殊限制，淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導是從培養(yǎng)后約6小
19時左右開始被誘導的，因此預(yù)先在這之前優(yōu)選在培養(yǎng)初期添加。此外，將淀粉樣蛋白球體與 抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體在另外的容器中孵育后，添加到所述培養(yǎng)液中。另外，作為對 照，優(yōu)選使用與淀粉樣蛋白球體不反應(yīng)的抗體或?qū)Φ矸蹣拥鞍浊蝮w的反應(yīng)性低且其反應(yīng)性 不影響對神經(jīng)細胞死亡的誘導的抗體。作為這樣的抗體，優(yōu)選可以使用例如抗0淀粉樣蛋 白單體蛋白的抗體，具體而言，例如“6E10”(Senetek公司制)等。由淀粉樣蛋白球體誘導的神經(jīng)細胞死亡通常在添加了有效量的淀粉樣蛋白球體 后、從約6小時左右開始發(fā)生，在約48小時左右后，能夠觀察到明顯的細胞死亡。因此，在 該分析方法中，當測定對神經(jīng)細胞死亡的誘導時，優(yōu)選開始培養(yǎng)的約20小時以后，但可以 根據(jù)使用的淀粉樣蛋白球體的細胞死亡活性體系來適當選擇。作為測定這些神經(jīng)細胞死亡活性的方法，可以使用通常所用的細胞死亡檢測法。 具體而言，可以使用 MTT 活性測定法(Mossman, T.，J. Immunol. Methods，65，55 (1983))、使 用碘化丙啶(Ankarcrona，M. et al.，Neuron，15，961 (1995))等的染色法、或臺盼藍拒染法 (Trypan blue dye exclusion)(Woo,K. B. ,Funkhouser,ff. K. ,Sullivan,C. and Alabaster, 0.，Cell TissueKinet.，13 (6)，591-604 (1980))、檢測 TUNEL 或片段化 DNA 的 ELISA (Roche 公司制)等。其中，特別優(yōu)選使用碘化丙啶等的染色法或檢測片段化DNA的ELISA。使用 碘化丙啶等的染色法可以是使用僅選擇性地對死亡細胞進行染色的碘化丙啶進行單一染 色，也可以與其他多種染色色素組合使用。作為可組合的染色色素，具體而言，優(yōu)選選擇性 地對活細胞進行染色的Calcein-AM(Molecular Probes公司制)、對全部細胞進行染色的 Hoechst33258 (H33258, Bisbenzimide H33258)等。另外，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體抑制對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性 也可以通過將本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體直接給予動物個體來進行。由淀粉 樣蛋白球體誘導的細胞死亡可以是凋亡或壞死中的任意一種。另外，作為所用的動物，只 要是具有哺乳動物(小鼠、大鼠、靈長類等)等的神經(jīng)系統(tǒng)細胞的動物，則沒有特殊限制， 優(yōu)選可以使用阿爾茨海默病的模型動物等特別是正在發(fā)生神經(jīng)細胞死亡的動物。另外，給 藥方法除了向腦等神經(jīng)系統(tǒng)細胞存在的部位直接給藥的方法外，還可以使用經(jīng)口給藥法、 靜脈注射法、腹腔給藥法等通常藥物給藥中所使用的方法。作為向腦等神經(jīng)系統(tǒng)細胞存在 的部位直接給藥的方法，具體而言，例如在大鼠或小鼠等的腦組織的情況下，可以用滲透泵 向靶部位附近的腦室內(nèi)給藥的方法、用微量加液器等向靶部位的腦實質(zhì)進行微灌流(micro fusion, microperfusion)的方法等，并在給藥一定期間后，使用PET MRI測量腦功能的變 化，然后快速取出給藥部位周圍的組織，制成組織切片，從而能夠檢驗有無神經(jīng)細胞死亡。 有無神經(jīng)細胞死亡的檢驗可以通過組織染色法或Western印跡法等來進行，作為組織染色 法，可列舉出TUNEL染色或利用抗Caspase抗體等的免疫染色等。(6)阿爾茨海默病的治療/和預(yù)防藥以及篩選方法當?shù)矸蹣拥鞍浊蝮w被添加到神經(jīng)系統(tǒng)的培養(yǎng)細胞中時，其能夠?qū)е滤黾毎?亡，因此認為在阿爾茨海默病中，同樣地0淀粉樣蛋白自締合形成的淀粉樣蛋白球體會誘 導神經(jīng)變性。本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體顯示對該淀粉樣蛋白球體的高的反應(yīng)性， 具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性，因此通過使受檢物與本發(fā)明的抗 淀粉樣蛋白球體特異性抗體競爭地與淀粉樣蛋白球體結(jié)合，并以其反應(yīng)性為指標對物質(zhì)進行選擇，能夠進行阿爾茨海默病的治療/和預(yù)防藥的篩選。另外，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球 體特異性抗體本身即可作為阿爾茨海默病的治療/和預(yù)防藥的有效成分。即，本發(fā)明的抗 淀粉樣蛋白球體特異性抗體由于對以淀粉樣前體蛋白為代表的淀粉樣蛋白3的單體或能 夠形成該單體的其他的結(jié)構(gòu)體的反應(yīng)性低、而對腦的特異性高，因此與W02006/016644號 公報中已知的以往的抗淀粉樣蛋白球體抗體相比，能夠成為安全性更高的阿爾茨海默病的 治療藥。下面說明所述物質(zhì)的篩選方法的具體例子。作為受檢物，可列舉出例如肽、蛋白、 非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等，這些 化合物可以是新型的化合物，也可以是公知的化合物。關(guān)于與淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性，可 列舉出在分析上述(4)的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體與淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性的方 法中，在反應(yīng)液中添加上述受檢物來進行的方法等。淀粉樣蛋白球體、抗淀粉樣蛋白球體特 異性抗體和受檢物的混合量可以通過分別選擇適當?shù)臐舛葋磉M行。受檢物優(yōu)選用標記物等預(yù)先進行了標記。通過所述分析，能夠判斷與淀粉樣蛋白 球體結(jié)合的物質(zhì)可以用作阿爾茨海默病的治療/和預(yù)防藥的有效成分。此外，優(yōu)選用選擇 的物質(zhì)代替上述(5)中記載的方法中的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體來確認是否抑制淀 粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導。如此選擇的物質(zhì)和本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體本身作為用于阿爾茨 海默病的預(yù)防和/或治療的藥物的有效成分是有用的，也可以是生理學上可容許的它們的 鹽、水合物以及溶劑合物等。優(yōu)選添加Fe或Zn等的金屬離子或糖鏈、糖蛋白而成的物質(zhì)。 作為生理學上容許的鹽，可列舉出例如鹽酸鹽、硫酸鹽等無機酸類的鹽，檸檬酸鹽、草酸鹽、 對甲苯磺酸鹽等有機酸的鹽，甘氨酸等氨基酸的鹽等。另外，抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體 更優(yōu)選使用通過上述方法改變?yōu)槿诵偷目贵w或者完全人抗體?？贵w的適于對人等進行給藥 的改變可以組合其本身公知的方法來進行。本發(fā)明提供的藥品含有將根據(jù)本發(fā)明的篩選方法判定為對神經(jīng)細胞死亡具有抑 制作用的物質(zhì)或者本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體以作為有效成分，并能夠用作用 于阿爾茨海默病的預(yù)防和/或治療的藥品。根據(jù)本發(fā)明的篩選方法判定為對神經(jīng)細胞死亡 具有抑制作用的物質(zhì)和抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體其本身可以作為藥品給予患者，但通 常優(yōu)選制造成含有這些有效成分中的1種或2種以上的藥物組合物來給予患者。作為這樣 的藥物組合物，可以例舉片劑、膠囊劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、丸劑、錠劑(troche)、舌下劑 或液體制劑等經(jīng)口給藥的制劑、或者注射劑、栓劑、軟膏、貼劑等非經(jīng)口給藥用的制劑。經(jīng)口給藥用的片劑或膠囊劑通常以單位給藥物的形式提供，其可以通過添加粘合 劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、香味劑和濕潤劑等通常制劑用載體來 進行制造。片劑可以按照本領(lǐng)域公知的方法、例如使用腸溶性包衣劑等進行包衣，并使用例 如填充劑、崩解劑、潤滑劑、濕潤劑等來進行制造。經(jīng)口給藥用的液體制劑除了例如水性或油性懸浮液、溶液、乳液、糖漿劑或酏劑等 之外，還可以以在使用前能夠用水或適當?shù)慕橘|(zhì)再溶解的干燥制劑的形式提供。這樣的液 體制劑中可以配合通常的添加劑例如抗沉降劑、乳化劑、保存劑以及根據(jù)需要的通常的香 味劑或著色劑。經(jīng)口給藥劑的制劑可以通過混合、填充或壓片等本領(lǐng)域公知的方法來制造。另外，還可以使有效成分分布到通過反復配合操作并使用大量填充劑等制成的制劑中。非經(jīng)口給 藥用的制劑通常以含有作為有效成分的物質(zhì)和滅菌介質(zhì)的液體載體給藥量制劑的形式提 供。非經(jīng)口給藥用的溶劑通常通過將作為有效成分的物質(zhì)溶解到介質(zhì)中并滅菌過濾，接著 填充到適當?shù)男∑炕虬碴持胁⒚芊鈦碇圃?。為了提高穩(wěn)定性，可以將組合物冷凍后填充到 小瓶中，并在真空下除去水。非經(jīng)口懸浮液實質(zhì)上可以采用與非經(jīng)口溶液相同的方法來制 造，但優(yōu)選通過將有效成分懸浮到介質(zhì)中并用環(huán)氧乙烷等進行滅菌來制造。另外，為了使有 效成分均勻分布，還可以根據(jù)需要添加表面活性劑、濕潤劑等。作為有效成分的物質(zhì)的給藥量可以通過考慮物質(zhì)的活性的強弱、治療或預(yù)防的目 的、患者的癥狀、體重、年齡或性別等來適當確定。另外，優(yōu)選分成每日1 數(shù)次進行給藥。 例如，當本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體為有效成分時，其給藥量在1次給藥中可 以以每kg體重通常為約1 y g 約lOOmg、優(yōu)選為約10 ii g 約50mg的量來進行給藥。(7)使用了抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的阿爾茨海默病個體的檢測方法和檢測 用試劑當將淀粉樣蛋白球體添加到神經(jīng)系統(tǒng)的培養(yǎng)細胞中時，會導致所述細胞死亡，因 此認為在阿爾茨海默病中，同樣地0淀粉樣蛋白單體蛋白自締合形成的淀粉樣蛋白球體 會誘導神經(jīng)變性。由于本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體具有高的 反應(yīng)性，因此通過使用該抗體對生物試樣中的淀粉樣蛋白球體進行檢測，能夠進行阿爾茨 海默病個體的檢測。作為生物試樣，可列舉出從懷疑具有阿爾茨海默病的個體獲得的血液、腦脊髓液、 尿等體液等，其中特別優(yōu)選血液。該試樣可以如下獲得例如在血液的情況下，可以從懷 疑具有阿爾茨海默病的個體的肘靜脈等通過采血管等進行采血并利用離心分離等方法將 血漿或血清分離來得到。另外，在將腦脊髓液作為試樣的情況下，可以從懷疑具有阿爾茨 海默病的個體通過例如麻醉下的腰椎穿刺來采集腦脊髓液并進行離心分離而得到。為了 防止獲得的生物試樣中的淀粉樣蛋白球體變化或血液凝固等，優(yōu)選在試樣采集時或樣品 采集后向試樣中加入酶抑制劑。作為酶抑制劑，可以使用蛋白分解酶抑制劑例如抑肽酶 (aprotinin)(antipain) > SfiBIW^iJ (pepstatin)(leupeptin)、 EGTA、PMSF(苯基甲磺酰氯)、TLCK(磺酰賴氨酸氯甲基酮)等。對得到的機體樣品進一步 根據(jù)需要進行濃縮等，能夠提高淀粉樣蛋白球體的檢測靈敏度。使用了該抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的生物試樣中的淀粉樣蛋白球體的 檢測可以使用其本身已知的免疫學測定法。具體而言，可以使用例如夾層法、競爭法 (competition method)、免疫狽|J定法(Immunometric assay)、散身寸狽|J池法(nephelometry) 等。在夾層法中，通過使生物試樣與經(jīng)固相化的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體接 觸，進而與經(jīng)標記的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體反應(yīng)，然后測定結(jié)合于固相的標記物的 信號，從而能夠測定生物試樣中的淀粉樣蛋白球體量。當通過這樣的免疫學測定方法來測 定生物試樣中的淀粉樣蛋白球體量時，優(yōu)選利用使用含有已知量的淀粉樣蛋白球體的標準 液制作的標準曲線來計算。詳細而言，可以按照生化學実験法11《工 4 A < A 7 7
七 O (Tijssen P.著、東京化學同人)、“Antibodies :A LABORATORY MANUAL” (Ed Harlow et al.，Cold SpringHarbor Laboratory (1988))等實驗書，適當?shù)剡x擇、組合來進行。另 外，本發(fā)明中也包括這些檢測中使用的、包括抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的用于阿爾茨海默病個體檢測的試劑。實施例以下通過實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。需 要說明的是，在下述實施例和本說明書中，“PBS”表示“磷酸緩沖液鹽(Phosphate Buffered Saline) ”、“TTBS” 表示“吐溫/Tris 緩沖液鹽(Tween-Tris Buffered Saline) ”、“HRP” 表 示“辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase) ”。實施例1 淀粉樣蛋白球體含有液的制備(1) 0 40淀粉樣蛋白(序列號1)樹脂的制造將Fmoc-Val 樹脂 342mg (胺含量為 0. 73mmol/g 的樹脂)放置到 PerkinElmer Applied Biosystems公司制的A433型自動肽合成機中，向其供給Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-0H、 Fmoc-Ile-0H、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Ser (tBu) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、 Fmoc-Glu(0tBu)_0H、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、 Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-0H> Fmoc-His (Trt)-0H> Fmoc-Arg (Pmc)-OH、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Asp(OtBu)-OH,并以 HBTU (2- (1H-苯 并三氮唑-1基)_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)為縮合劑使其依次縮合，得到側(cè)鏈保護 3 40淀粉樣蛋白樹脂1.5158。(2)三氟乙酸處理取上述(1)中得到的側(cè)鏈保護0 40淀粉樣蛋白樹脂中的304mg，向其中加入苯酚 0. 75ml、茴香硫醚0. 5ml、三氟乙酸8. 25ml、乙烷二硫醇0. 25ml和蒸餾水0. 5ml，用冰冷卻5 分鐘，接著在室溫下使其反應(yīng)1.5小時。反應(yīng)結(jié)束后，加入用冰冷卻了的二乙基醚200ml，使 肽沉淀。用玻璃過濾器過濾得到全部內(nèi)容物，用冷二乙基醚洗滌，然后用含有35%的乙腈的 0. 三氟乙酸(約 200ml)進行提取處理，得到以 H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-L ys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH 表示的粗月太 191mg。(3)肽的精制將該粗肽溶解到含有35%的乙腈的0. 三氟乙酸(40ml)中，利用HPLC進行精 制，所述HPLC使用了在二氧化硅上結(jié)合有0DS (十八烷基硅烷)的反相柱(內(nèi)徑為2cm、長 度為25cm)。洗脫是通過在0. 三氟乙酸中用20分鐘使乙腈濃度從22%直線上升到42% 來進行的。精制物的獲得量為35mg。該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)用MALDI-T0F質(zhì)量分析來確認。相對 于測定值[M+H]+4330. 99，計算值(Cm^AA^+H)為4330. 89。另外，關(guān)于3 42淀粉樣蛋 白，將按照上述方法進行合成/生成得到的0 42淀粉樣蛋白和從Bachem公司購買的3 42 淀粉樣蛋白二者用于下述實驗。(4)淀粉樣蛋白球體含有液的制備將上述(3)中精制得到的lOnmol的3 40淀粉樣蛋白放入1. 5ml容量的 Eppendorftube中，向其中依次加入500 u 1的超純水和500 u 1的Dulbecco磷酸緩沖液(-)(Nissui公司制；下文也稱為PBS(-))，使0淀粉樣蛋白完全溶解。將裝有該0淀粉樣蛋 白水溶液的Eppendorf tube安裝到Duckrotor (TAITEC公司制、rotor :RT50)上，使其在 37°C下以35rpm的速度旋轉(zhuǎn)7日，從而制備淀粉樣蛋白球體40。對于0 42淀粉樣蛋白(上 述(3)中精制得到的0 42淀粉樣蛋白或者Bachem公司制)，按照上述方法，使其旋轉(zhuǎn)約10 小時，從而制備淀粉樣蛋白球體42。實施例2 倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的制備將在PBS中制備的淀粉樣蛋白球體42和等量的弗氏完全佐劑(WAK0公司制)混 合乳化，在亞美尼亞倉鼠背部皮下用0. 2ml進行免疫(16y g/0. 2ml/倉鼠)。每隔2周，用 經(jīng)弗氏不完全佐劑(Sigma-Aldrich公司制)乳化的淀粉樣蛋白球體同樣地進行免疫。在5 次免疫后，從頸動脈采血制備血漿。用牛血清白蛋白(BSA，fraction V ；Sigma-Aldrich 公司制)溶液(PBS(-)中)將血漿連續(xù)稀釋，測定對下述的淀粉樣蛋白球體固相ELISA法 淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性。對進行6 12次免疫后反應(yīng)性充分上升的個體，最后向腹腔內(nèi)給予淀粉樣蛋白球 體16 y g (PBS㈠0. 2ml中)以進行加強。在加強3日后回收脾細胞，通過使用聚乙二醇4000 的常用方法，將其與為脾細胞數(shù)的1/2的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0-Agl4)進行細胞融合。將 融合得到的細胞懸浮到含有10%胎牛血清、10% BM condimed H_1 (Roche Diagnostics公 司制)和HAT (Sigma-Aldrich公司制)的GIT培養(yǎng)基(WAK0公司制)中，按照每孔5X104 個骨髓瘤細胞/0. lml培養(yǎng)液的方式播種到96孔板(FALCON公司制)中。3日后追加培養(yǎng) 液，在7日后更換培養(yǎng)液，再培養(yǎng)2 3日后回收上清液。用下述ELISA法檢查上清液中的 抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體，將產(chǎn)生特異性抗體的細胞擴展(expand)到24孔板(IWAKI 公司制)中。在利用有限稀釋法進行克隆時，將雜交瘤以每孔200 yl培養(yǎng)液播種到96孔 板中，并達到0. 3Cell/well，每周更換一次一半培養(yǎng)液地進行培養(yǎng)。將從如此得到的產(chǎn)生倉鼠單克隆抗體的雜交瘤H3-17-2-2 (雜交瘤haASD 1)、 H5-3-2-45 (雜交瘤 haASD2)、H5-24-7、H5-47-10、H4-3-5-4 獲得的抗體分別稱為 haASDl、 haASD2、haASD3、haASD4、haASD5。將雜交瘤haASDl 以 FERM BP-10871、將雜交瘤 haASD2 以 FERMBP-10872 于 2007 年 (平成19年)7月13日保藏于日本獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心 (日本國茨城県1 < 市東一丁目1番地1中央第6)。從雜交瘤H3-17-2-2、H5-3-2-45、H5-24-7、H5-47-10、H4-3-5-4 獲得的抗體的分 離精制如下進行。將雜交瘤在約1L的⑶Hybridoma培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中培 養(yǎng)1周，通過離心分離回收培養(yǎng)上清液。將其用0. 45 y m的過濾器過濾，然后將其添加到用 PBS(-)平衡了的 2ml 的 Protein-A 瓊脂糖(Sepharose)中，之后與 W02006/016644 號的實 施例2 (1)同樣地分離精制IgG抗體。實施例3抗體的性狀分析(1)淀粉樣蛋白球體固相ELISA法(與淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性的確認)在96孔ELISA板(Nunc公司制MaxiSorp)中添加50 u 1的在1/2濃度PBS (-)中 稀釋至lPg/ml的淀粉樣蛋白球體42，并在4°C下過夜。在室溫下添加牛血清白蛋白 (BSA，fraction V ；Sigma-Aldrich公司制)溶液(PBS(-)中)1小時以上以封閉非特異性 結(jié)合部位，然后用水洗滌平板。添加50iU的用牛血清白蛋白溶液(PBS㈠中)稀釋的
24抗血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液，使其在室溫下反應(yīng)1小時以上。用含有0. 05% Tween20的生 理鹽水洗滌平板5次，然后同樣添加稀釋至1 P g/ml的過氧化物酶標記的第二抗體(抗倉 鼠IgG抗體(ROCKLAND公司制))，使其在室溫下反應(yīng)1小時。在洗滌5次后，添加底物溶 液，使其顯色一定時間，用酶標儀測定吸光度。實施例2中構(gòu)建的倉鼠單克隆抗體的代表例的結(jié)果示于圖1。實施例2中構(gòu)建的 抗體以低濃度對淀粉樣蛋白球體顯示強的反應(yīng)性。(2)點印跡分析(與淀粉樣蛋白球體、0淀粉樣蛋白纖維、0淀粉樣蛋白單體和 淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性的確認)使用Blotter (BioRad公司制)將溶于溶劑1，1，1，3，3，3，-六氟_2_丙醇 (Sigma-Aldrich公司制)的0 40淀粉樣蛋白或42單體蛋白、實施例1中制備的淀粉樣 蛋白球體40或42含有液、由340淀粉樣蛋白制備的A3纖維和市售的淀粉樣前體蛋 白sAPPa (Sigma公司制)分別以每個5ng吸印到硝酸纖維素膜(Schleicher&Schuell， 0. 2u)上，將該膜用PBS(-)洗滌，然后從Blotter取下。將吸印有上述蛋白質(zhì)的膜用5%脫脂乳/0. 05% TTBS封閉1小時后，浸到兔多克 隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體(rpASDl、rpASD2、rpASD3) (0. 01 u g/mL)、小鼠單克隆抗 淀粉樣蛋白球體抗體(mASD3) (0. 05 u g/mL)、和實施例2中獲得的抗體haASDl (0. 01 u g/ mL)中，在濕氣箱中在4°C下反應(yīng)過夜。然后，將該膜用0.05%TTBS洗滌，使其作為第二抗 體與0. 05 1 y g/ml的結(jié)合有辣根來源的過氧化物酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG或者抗倉 鼠IgG反應(yīng)1小時。然后，用0. 05% TTBS洗滌，除去未反應(yīng)的第二抗體，浸到SuperSignal West-Femto (Pierce 公司制)中孵育 5 分鐘，然后用 Image Analyzer"LAS-1000plus“(Fuji Photo Film公司制)檢測化學發(fā)光信號和獲取圖像數(shù)據(jù)。作為上述抗體反應(yīng)性的對照，使 用0. 5 u g/mL的抗3淀粉樣蛋白抗體“6E10，，(Senetek公司制)和0. 04 u g/mL的抗APP N-末端抗體“22C11”(Chemicon公司制)作為第一抗體(一抗)。其結(jié)果示于圖2。圖2中，A 0 1-40和A0 1-42分別示出單體、實施例1中制備的淀粉樣蛋白球體40 含有液及其lOOkDa超濾膜滯留級分、和淀粉樣蛋白球體42含有液及其lOOkDa超濾膜滯留 級分的點；fibril表示由A0 1-40制備的A0纖維的點；另外，sAPPa表示市售的淀粉樣 前體蛋白(Sigma公司制)的點。由圖可知，市售的抗3淀粉樣蛋白抗體“6E10”與實施例 1中制備的淀粉樣蛋白球體40、淀粉樣蛋白球體42、單體、纖維、sAPPa蛋白質(zhì)均發(fā)生反應(yīng)， 與此相對，實施例2中構(gòu)建的倉鼠單克隆抗體(haASDl)與淀粉樣蛋白球體40和淀粉樣蛋 白球體42高選擇性地發(fā)生反應(yīng)，而對淀粉樣前體蛋白sAPPa完全不顯示反應(yīng)性。(3)解離常數(shù)測定在50mM醋酸緩沖液中，將lOyg/ml淀粉樣蛋白球體(42ASPD)、^淀粉樣蛋白單 體(42A3、40A3)、由 40A3 制備的 A3 纖維(fibril)耦合到 BIACore3000 (BIAcore 公 司制)的 CM5 傳感器芯片上。使用用 lOmMHEPES、pH7. 4、0. 15M NaCl、3mM EDTA.0. 005% Surfactant P20從最高濃度lOOnM連續(xù)稀釋2倍得到的抗體溶液，求出結(jié)合速度常數(shù)和解 離速度常數(shù)。利用這些常數(shù)通過下式計算出解離常數(shù)。解離常數(shù)=解離速度常數(shù)/結(jié)合速度常數(shù)表1表示小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體、倉 單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體和市售抗體(6E10)相對于淀粉樣蛋白球體的解離常數(shù)(Kd)。倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體與小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體 同樣具有對ASPD的強的親和性(Kd 10_" 10_9M)，并且顯示比對0淀粉樣蛋白單體或纖 維更(1個級別 2個級別)高的選擇性。[表1]各種抗淀粉樣蛋白球體抗體的解離常數(shù) 實施例4 抗淀粉樣蛋白球體抗體的抗原決定部位(表位)的確定(1)抗淀粉樣蛋白球體抗體的抗原決定部位(表位)為了確定抗淀粉樣蛋白球體抗體的表位，通過從N末端開始每次5個殘基地依次 化學合成3淀粉樣蛋白單體蛋白的部分序列，得到順次38個包含淀粉樣蛋白3 5殘基 的部分序列肽(以后在本實施例中也簡記為A0，從N末端側(cè)開始稱為A0 1-5、A0 2-6、
A 3 3-7.......A 0 38-42)。將A 0通過HPLC精制成單峰，然后每一定量地進行冷凍干燥，
保存在-20°C下直至使用前。將上述各A 0溶于經(jīng)過滅菌的0.5 XPBS (_)中，制備A 0 -抗體混合溶液，以使各 A3與精制為IgG的各抗淀粉樣蛋白球體抗體的比以摩爾比計為100 100萬倍。將各 A3-稀釋液添加到實施例3(1)中制備的淀粉樣蛋白球體40固相板中，在4°C下振蕩過夜， 用0. 01% Tween 20_PBS(_)溶液洗滌后，添加稀釋至1萬分之1的結(jié)合有過氧化物酶的第 二抗體(多克隆抗體時為抗兔抗體、單克隆抗體時為抗小鼠抗體或抗倉鼠抗體)，振蕩1小 時。將其用 0. 01% Tween 20-PBS (-)溶液洗滌，使用 TMB Substrate Kit (PIERCE 公司制) 進行顯色。在停止顯色后，用酶標儀(Benchmark ；BioRad公司制)測定450nm處的吸收，得 到結(jié)果。該結(jié)果示于圖3。由圖可知，haASD2和市售抗體的82E1 (IBL公司(株式會社免 疫生物研究所)制)受到0淀粉樣蛋白單體蛋白的N末端的肽(A0 1-5)的很強的競爭抑 制。另一方面，haASDl和haASD3均不受淀粉樣蛋白0 5殘基部分序列肽(即使將A0混 合比提高到相對于抗體以摩爾比計為100萬倍)的競爭抑制。該結(jié)果明顯啟示，與以往已 知抗體所識別的表位不同，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體是識別ASPD的立體結(jié) 構(gòu)特異性表位的抗體。實施例5 淀粉樣蛋白球體的細胞毒性的中和活性的評價(1)單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體對淀粉樣蛋白球體毒性的中和
使用實施例2中得到的各單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體來評價淀粉樣蛋白球體 毒性的中和活性。作為評價方法，使用大鼠海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞來進行。海馬的原代培 養(yǎng)基本上與W02006/016644的實施例5中記載的前腦基底的情況相同地進行制備，但培養(yǎng) 密度按照1.0X105cellS/cm2進行播種。淀粉樣蛋白球體使用按照實施例1中記載的方法 制備得到的淀粉樣蛋白球體42。其中，實驗條件如下。淀粉樣蛋白球體42的濃度1. 25 ii M暴露于淀粉樣蛋白球體的時間45小時細胞大鼠海馬神經(jīng)元用PI染色進行檢測單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體haASD2即使在海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞中也發(fā)揮中 和淀粉樣蛋白球體的神經(jīng)毒性的效果。如圖4所示，haASD2對淀粉樣蛋白球體的神經(jīng)毒性 顯示濃度(5 50ii g/ml)依賴性的中和活性。實施例6 對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性(1) Western 即跡以作為阿爾茨海默病的模型動物的在腦內(nèi)過量表達人型APP(hAPP)的Tg2576小 鼠(Science 1996 Oct 4 ；274 (5284) 99-102)的腦提取物為樣品，進行 Western 印跡，檢 測ASPD抗體和6E10的反應(yīng)性。具體而言，用NuPAGE LDS Sample buffer處理Tg2576小 鼠(15個月齡)的大腦皮質(zhì)和海馬的TBS(Tris緩沖液鹽)可溶性級分，將約50 y g的樣品 施于 NuPAGENovex Bis-Tris Gel (4-12% )中，進行電泳(200V)。然后，轉(zhuǎn)印(30V，60 分 鐘)到硝酸纖維素膜上，將經(jīng)轉(zhuǎn)印的膜用含有5%脫脂乳(skim milk)的TTBS (含有0. 05% Tween 20的TBS)封閉(室溫下2小時)。接著，與用相同溶液稀釋的各抗體(1 U g/ml)反 應(yīng)(4°C下過夜)，洗滌后，用HRP-標記的第二抗體進行檢測(SuperFemto)。其結(jié)果，在Tg2576小鼠的樣品中，6E10與A3單體和hAPP反應(yīng)(圖5中分別記作 A3 單體、APP 的帶)、W02006/016644 記載的小鼠 ASPD 單克隆抗體(mASDl、mASD2、mASD3) 不與A0單體反應(yīng)，但與hAPP反應(yīng)(圖6中箭頭的帶)。另一方面，本發(fā)明的倉鼠ASPD單 克隆抗體不顯示如在6E10和小鼠抗體中可見的對A 0單體和hAPP的反應(yīng)性(圖7)。(2)競爭 ELISA在固相化了 ASPD的ELISA板中，進行利用各ASPD抗體和6E10的競爭ELISA。預(yù) 先在另外的板中，使各抗體與ASPD或sAPP a (Sigma)反應(yīng)(室溫下1小時)，將其添加到 ASPD固相化板(用1%BSA進行了封閉)中。接著，在室溫下反應(yīng)1小時，洗滌后，用HRP 標記的第二抗體進行檢測。其結(jié)果如表1所示，6E10和W02006/016644記載的小鼠ASPD單克隆抗體不僅對 ASPD(IC50 = 2. 1 13nM)而且對 sAPP a 顯示反應(yīng)性(IC50 = 9. 6 33. 8nM)。另一方面， 倉鼠抗體對ASPD顯示反應(yīng)性(IC5Q = 3. 2 6. 4nM)，但對sAPP a不顯示明顯的反應(yīng)性 (IC5(I > lOOnM)。從以上結(jié)果可知，本發(fā)明的抗體是與淀粉樣蛋白球體發(fā)生特異性反應(yīng)、不 與APP發(fā)生顯著反應(yīng)的抗體，因此能夠成為副作用小、安全性更高的優(yōu)異的藥品。[表 2]
實施例7 有關(guān)臟器特異性的試驗評價抗體對正常人體組織的反應(yīng)性。在使用了小鼠抗體的免疫染色中，丙酮固定人體組織冷凍切片后，使其與DAK0公 司Envision試劑盒中的Peroxidase blocking溶液反應(yīng)5分鐘。并使其與含有0.5%酪 蛋白、1 %牛血清白蛋白、1. 5 %正常山羊血清、2 %正常人免疫球蛋白、lmg/mL熱改性人免疫 球蛋白的蛋白質(zhì)封閉溶液反應(yīng)20分鐘后，添加用含有1 %牛血清白蛋白的PBS稀釋到2或 10mg/mL的濃度的抗體，使其在室溫下反應(yīng)1小時。使其與DAK0公司Envision試劑盒中的 Peroxidase labeled polymer反應(yīng)30分鐘后，添力口 DAK0公司Envision試劑盒中的DAB溶 液使其反應(yīng)8分鐘。在上述所有步驟結(jié)束后，在移至下一步驟前用PBS洗滌標本。免疫染 色結(jié)束后，用自來水洗滌標本，用蘇木精進行復染。在使用倉鼠抗體的免疫染色中，在35°C下向經(jīng)丙酮固定的冷凍切片上添加葡萄糖 氧化酶(2U/mL)/葡萄糖(10mM)和疊氮化鈉(ImM) 1小時，使內(nèi)源性過氧化物酶失活。用抗 生物素蛋白溶液在室溫下封閉15分鐘、再用生物素溶液在室溫下封閉15分鐘，然后使其與 含有0.5%酪蛋白、牛血清白蛋白、1.5%正常山羊血清、5%人免疫球蛋白、lmg/mL熱改 性人免疫球蛋白的蛋白質(zhì)封閉溶液在室溫下反應(yīng)20分鐘。添加用含有1 %牛血清白蛋白的 PBS稀釋至2或10mg/mL的倉鼠抗體，使其在室溫下反應(yīng)1小時，然后添加生物素標記山羊 抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)抗體，使其在室溫下反應(yīng)30分鐘。進一步使其與ABC Elite試 劑反應(yīng)30分鐘，其后與DAB溶液在室溫下反應(yīng)4分鐘。檢驗的所有小鼠抗ASPD抗體和倉鼠抗ASPD抗體使阿爾茨海默患者大腦的冷凍切 片中的老年斑樣的結(jié)構(gòu)物染色，即顯示在阿爾茨海默病患者腦大腦中存在識別這些抗體的 物質(zhì)。對正常人小腦、脊髓、外周神經(jīng)、心臟、肝臟、腎臟進行檢驗，結(jié)果很多小鼠抗淀粉 樣蛋白球體抗體使血管內(nèi)或周圍的蛋白樣物質(zhì)、正常腦組織的神經(jīng)網(wǎng)和神經(jīng)細胞核、平滑 肌、肌成纖維細胞、巨噬細胞、Kupffer細胞等染色。倉鼠抗淀粉樣蛋白球體抗體的一部分雖然使骨骼肌和心肌細胞染色，但與小鼠抗 體相比，對正常人體組織的反應(yīng)性較弱。haASDl和haASD2幾乎不使正常人體組織染色，特 別是haASD2，在各正常組織中均未見附性表現(xiàn)。結(jié)果示于圖8和表3。[表3]人體組織組中確認的免疫陽性反應(yīng)的比較
28 從以上結(jié)果可知，與以往已知的小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體相比，本發(fā)明 的倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體是對人正常組織的交叉反應(yīng)性低的阿爾茨海默病腦 的特異性抗體。由此可以設(shè)想，以這些倉鼠抗體的特異性為基礎(chǔ)的治療用抗體能夠成為不 影響靶臟器以外的組織的副作用小的阿爾茨海默病治療藥。實施例8 利用免疫電子顯微鏡觀察的抗體特異性的檢驗在生理溶劑環(huán)境中，使ASPD或纖維狀的0淀粉樣蛋白締合體與10ii g/ml的倉鼠 抗體haASDl反應(yīng)。反應(yīng)在1. 5ml管或經(jīng)碳蒸鍍的Formvar柵格上直接進行。之后，使之與 結(jié)合有6nm金膠體的第二抗體進一步反應(yīng)，在用醋酸鈾進行負染后，進行電子顯微鏡觀察。如圖9所示，倉鼠抗體不與纖維狀的締合體反應(yīng)，而與淀粉樣蛋白球體結(jié)合。實施例9 免疫組織化學分析使用10名阿爾茨海默病個體(年齡為80. 4士9. 2歲、腦重量為964士82g、患病期 間為10. 1士5. 5年)來源的、和7名作為對照的健康個體(年齡為71. 3士 15. 2歲、腦重量為 1226士96g)來源的、optiumum cutting temperaturecompound包埋的冷凍腦的冷凍切片或 石蠟包埋的福爾馬林固定腦的10 ym厚的切片，按照規(guī)定的方法進行免疫組織化學分析。 作為識別淀粉樣蛋白球體的抗體，使用小鼠單克隆抗體mASD3、倉鼠單克隆抗體haASDl、兔 多克隆抗體rpASD2。另外，作為抗0淀粉樣蛋白抗體，使用識別0淀粉樣蛋白(A0 1-42) 的C末端的市售的抗0淀粉樣蛋白抗體“IBL18582”(IBL公司制)和識別A0 8-17的市售 的抗3淀粉樣蛋白單克隆抗體“6F/3D”(DAK0公司制)。其結(jié)果，識別淀粉樣蛋白球體的全部抗體(rpASD 1、rpASD2、rpASD3、mASD3、 haASDl)使阿爾茨海默病腦冷凍切片的位于額葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、海馬的斑塊(老年斑、彌 漫性老年斑)顯著染色。由此顯示，淀粉樣蛋白球體樣結(jié)構(gòu)物原位(in situ)存在于斑 塊內(nèi)。另外，這些抗體除了 haASDl外，無論有無微波爐處理或甲酸處理，福爾馬林固定石蠟切片腦的斑塊都染色。另外，在同年齡的正常對照腦中，除個別斑塊以外的結(jié)構(gòu)體未被 染色。另一方面，識別0淀粉樣蛋白(A0 1-42)的C末端的市售的抗0淀粉樣蛋白抗體 “IBL18582”和識別A0 8-17的市售的抗0淀粉樣蛋白單克隆抗體“6F/3D”在沒有微波爐 處理或甲酸處理的阿爾茨海默病腦的冷凍切片或石蠟切片中，幾乎不使斑塊染色。從以上 結(jié)果可知，識別淀粉樣蛋白球體的抗體特異性地識別淀粉樣蛋白球體的結(jié)構(gòu)，其中特別是 haASDl，其是更微細地識別立體結(jié)構(gòu)的抗體。該結(jié)果與在實施例8的利用免疫電子顯微鏡 觀察的抗體特異性的檢驗中，淀粉樣蛋白球體抗體不與纖維狀的締合體反應(yīng)、而與淀粉樣 蛋白球體結(jié)合的結(jié)果一致。實施例10 人源化抗體的獲得及其分析(1)人源化抗體的獲得使用QIAGEN制RNeasy mini kit (Cat. No. 74106)，從實施例2中得到的產(chǎn)生倉 鼠單克隆抗體的雜交瘤haASD2獲得RNA。以該RNA為模板，使用GE Life Sciences制 1st strand cDNA synthesis kit (Cat. No. 27-9261-01)，合成 cDNA。關(guān)于輕鏈可變區(qū)，使 用引物 haVKl 和 haCK 以及 Finnzymes 制 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Cat. No. F-531S)對 cDNA 進行擴增，并將之與 Invitrogen 制 Zero Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Cat. No. 450245)的pCR-Blunt II-T0P0載體連接。關(guān)于重鏈可變區(qū)，使用引物haVHf 和 MHCG3 以及 Clontech 制 AdvantageR-HF 2 PCR Kit (Cat. No. 639123)對 cDNA 進行擴增， 并將之與 Invitrogen 制 T0P0-TA cloning kit (Cat. No. 450641)的 pCR2. 1-T0P0 載體連 接。將它們導入大腸桿菌感受態(tài)細胞Invitrogen制T0P10 (Cat. No. 404003)后，委托GATC Biotech公司對具有目標大小的插入DNA(VH 約730bp、VL 約850bp)的克隆進行堿基序列 分析，從而確定DNA序列。[表4]用于克隆倉鼠VL的PCR引物 [表5]用于克隆倉鼠VH的PCR引物 按照Kabat等的方法確定倉鼠抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)中的互補決定區(qū)(⑶Rs) ("Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，Kabat, E. , etal. , US Department of Health and Human Services，(1983))，并按照日本專利第 2912618 號公報 中記載的Winter的方法，將倉鼠抗體haASD2人源化。其結(jié)果，得到2種人源化抗體，分別將其命名為RHA/RLA(以后有時也將其稱為huASD2)和RHB/RLB。制備導入了人源化抗體huASD2的重鏈cDNA的表達質(zhì)粒，將其命名為 ASD2RHApGlD200。另外，制備導入了人源化抗體RHA/RLA的輕鏈cDNA的表達質(zhì)粒，將其命 名為 ASD2RLApLm00。ASD2RHApGlD200 的接收編號為 FERM ABP-11040 (保藏編號FERM BP-11040)、ASD2RLApLN100 的接收編號為 FERM ABP-11041 (保藏編號FERMBP_11041)，二 者已于2008年10月17日保藏于日本獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中 心(日本國茨城県1 < 市東一丁目1番地1中央第6 (郵便番號305-8566))。人源化抗體huASD2可以通過將ASD2RHApGlD200和ASD2RLApLN100共轉(zhuǎn)染給公知 的動物細胞(例如CHO、NSO、HEK293、COS等)并使之表達而得到。作為一個例子，有利用 使用了 Invitrogen 制 FREESTYLE MAX 293 EXP SYSTEM (Cat. No. K9000-10)的 HEK293 的瞬 時表達。序列表的序列號4和5以及圖10表示人源化抗體huASD2的重鏈可變區(qū)的DNA和 氨基酸序列。圖10中示出了⑶Rl、2、3各自的位置。序列表的序列號6和7以及圖11表示人源化抗體huASD2的輕鏈可變區(qū)的DNA和 氨基酸序列。圖11中示出了⑶Rl、2、3各自的位置。人源化抗體RHB/RLB也與人源化抗體huASD2同樣，可以如下得到制備分別表達 重鏈和輕鏈的質(zhì)粒，將它們共轉(zhuǎn)染給動物細胞，然后使之表達而得到。序列表的序列號8和圖12表示人源化抗體RHB/RLB的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。 圖12中示出了⑶Rl、2、3各自的位置。序列表的序列號9和圖13表示人源化抗體RHB/RLB的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。 圖13中示出了⑶Rl、2、3各自的位置。此外，通過改變?nèi)嗽椿贵whuASD2可以得到人源化抗體RHC/RLC。人源化抗體 RHC/RLC的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人源化抗體huASD2的重鏈可變區(qū)相同。人源化抗體 RHC/RLC的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表的序列號10和圖14所示。(2)人源化抗體的分析對人源化抗體huASD2、RHB/RLB和RHC/RLC的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序 列進行比較的圖為圖15。圖中，將人源化抗體huASD2的重鏈可變區(qū)序列記為ASD2RHA、將輕 鏈可變區(qū)序列記為ASD2RLA、將人源化抗體RHB/RLB的重鏈可變區(qū)序列記為ASD2RHB、將輕 鏈可變區(qū)序列記為ASD2RLB、以及將人源化抗體RHC/RLC的輕鏈可變區(qū)序列記為ASD2RLC。 由于人源化抗體RHC/RLC的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人源化抗體huASD2的重鏈可變區(qū) 氨基酸序列(圖15的ASD2RHA)相同，因此在圖15中省略了。圖15中，通過將人源化抗體huASD2的重鏈可變區(qū)中的氨基酸編號第49位(G)、第 81位(L)和第100位(T)分別替換成A、V和R，能夠制成人源化抗體RHB/RLB重鏈可變區(qū)。 另外，通過將人源化抗體huASD2的輕鏈可變區(qū)中的氨基酸編號第48位(Y)、第49位(L)、 第51位(K)、第74位(A)和第79位(G)分別替換成F、F、F、T和A，能夠制成人源化抗體 RHB/RLB的輕鏈可變區(qū)。在圖15所示的氨基酸殘基中，對于除人源化抗體huASD2的重鏈可變區(qū)(ASD2RHA) 和輕鏈可變區(qū)(ASD2RLA)的⑶Rs以外的序列，按照日本專利第2912618號公報中記載的 Winter的方法，通過Medical ResearchCouncil公司(以下稱為MRCT)的分析判斷其在結(jié)構(gòu)上是重要的，通過對它們進行替換，能夠更有效地修飾/改變huASD2的性狀。具體而 言，在人源化抗體huASD2與倉鼠抗體haASD2中，當存在功能上的差異時，可以期待通過將 它們中的一個位置或幾個位置或者全部回復到原始的倉鼠抗體haASD2的序列(回復突 變)來縮小或消除該差異。作為一個例子，可列舉出序列RHB/RLB(序列號8和9、圖15的 ASD2RHB和ASD2RLB)。不過，從人源化的目的即降低對具有異種優(yōu)勢抗體(heterologous leadantibody)的人的免疫原性的視角出發(fā)，這里所述的氨基酸替換并不是優(yōu)選的操作，如 果沒有提高對免疫原性的影響的效果，則沒有必要實施。另一方面，當將用于設(shè)計huASD2的可變區(qū)框架的人抗體AB021517 (GenBank編號) 和AJ241418 (GenBank編號)的序列分別與來源基因組序列(各V鏈段、J鏈段)進行比較 時，可見輕鏈(序列號6和7)的超突變。超突變是在抗體的抗原特異性成熟過程中可見的 突變，其發(fā)生在反映個人的遺傳背景的免疫學環(huán)境中。因此，若遺傳背景不同，則可能顯示 免疫原性，這被認為是見于完全人抗體Humira中的預(yù)料外的免疫原性的一個因素。作為避免其發(fā)生的手段，考慮將發(fā)生超突變的氨基酸殘基回復為人共通的基因組 序列。具體而言，在可容許的對抗體性狀的影響的范圍內(nèi)，將huASD2輕鏈可變區(qū)(圖15的 ASD2RLA)的超突變氨基酸殘基3個(序列號7的氨基酸第2位(S)、第8位(S)和第51位 (K))中1個位置或2個位置或者全部位置分別替換為各自的基因組序列即A、A和R(序列 號 10、圖 15 的 ASD2RLC)。實施例11 人源化抗體的性狀分析(1)解離常數(shù)測定按照與實施例3(3)同樣的順序，將42ASPD、40Ai3 (Αβ單體)和由42Αβ制備 的Αβ纖維(42fibril)耦合到CM5傳感器芯片上，測定對倉鼠抗體haASD2、人源化抗體 huASD2和抗Αβ抗體3D6(US20030165496A1)對上述蛋白質(zhì)的解離常數(shù)。抗Αβ抗體3D6 用已知的方法制備與US20030165496A1中記載的小鼠抗體輕鏈可變區(qū)3d6vl. aa和其重鏈 可變區(qū)3d6vh. aa對應(yīng)的合成基因，基于該專利的信息，分別與已知的小鼠抗體的輕鏈恒定 區(qū)和重鏈恒定區(qū)連接，制成小鼠IgG2b/κ分子。其結(jié)果示于表6。人源化抗體huASD2顯示對ASPD的強的親和性(Kdl. 8 X I(TiqM)， 且其親和性與β淀粉樣蛋白單體相比高約580倍、與淀粉樣蛋白纖維相比高約6. 4倍。另 一方面，抗Αβ抗體3D6對ASPD的親和性與β淀粉樣蛋白單體相比高約34倍、與淀粉樣 蛋白纖維相比高約2.0倍高。即顯示，這次我們得到的人源化抗體huASD2比公知的A β抗 體3D6對ASPD的選擇性高。即，本發(fā)明的人源化抗體huASD2由于對腦血管中沉積的A β 40 的結(jié)合低，因此可期待腦微小血管出血的副作用小。[表6]各種抗體的解離常數(shù)
(2)人源化抗體huASD2的抗原決定部位(表位)的確定
使用與實施例4同樣的方法，研究人源化抗體huASD2與哪個Αβ 5殘基肽結(jié)合。從其結(jié)果可知，人源化抗體huASD2與倉鼠抗體haASD2同樣地受到0淀粉樣蛋白單體蛋白的 N末端的肽(A3 1-5)的強的競爭抑制。實施例12 人源化抗體RHA/RLA的細胞毒性的中和活性的評價從妊娠17日齡的大鼠(SD、日本Charles River)中取出胎鼠，然后從其腦中摘出 海馬。與W02006/016644的實施例5的記載同樣地制備海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞。具體而 言，將海馬神經(jīng)細胞用神經(jīng)細胞培養(yǎng)液(SUMIL0N)培養(yǎng)(37°C、5% C02)5天。對于ASPD，使 用按照公知方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100，6370-6375 (2003))得到的 ASPD、將其稱 為 DF-ASPD。將 DF-ASPD (0. 35 u M)與 haASD2 或 huASD2 (7. 5、25 禾口 75 ii g/ml) 一起在室溫 下孵育2時間，然后將其直接添加到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24和45小時。作為對照，使用不含抗 體的PBS(-)。其后，通過celldeath ELISA(Rosch)和碘化吡啶(PI)染色，檢測神經(jīng)細胞死 亡。將利用凋亡的檢測系統(tǒng)即cell death ELISA評價haASD2和huASD2對DF-ASPD 導致的神經(jīng)細胞死亡的中和活性的結(jié)果示于圖16。圖16中，F(xiàn)12為不含DF-ASPD的對照。 通過添加DF-ASPD，0D (405-492nm)值增加，確認存在凋亡誘導(DF-ASPD (0. 35 u M)、PBS (-) 的柱)。與此相對，倉鼠抗體haASD2的人源化抗體huASD2添加組顯示0D值顯著地降低 (DF-ASPD (0. 35 u M)、huASD2 (7. 5、25禾口 75)的柱)、由DF-ASPD誘導的神經(jīng)細胞死亡的抑制 效果高。接著，將通過使用PI染色檢測細胞死亡來評價haASD2和huASD2抗體(25 u g/ml) 對DF-ASPD導致的神經(jīng)細胞死亡的中和活性的結(jié)果示于圖17。細胞死亡的檢測通過測量每 個視野的PI陽性細胞數(shù)來進行。與圖16同樣，F(xiàn)12為不含DF-ASPD的對照，PBS(-)為不含 抗體的對照。通過添加DF-ASPD (0. 35 u M), PI陽性細胞顯著地增加，確認存在細胞死亡的 誘導(DF-ASPD (0. 35 u M)、PBS (-)的柱)。與此相對，haASD2和huASD2顯示對PI陽性細胞 數(shù)的顯著的抑制作用，由DF-ASPD誘導的細胞死亡所導致的神經(jīng)細胞死亡的抑制效果高。本發(fā)明的抗體對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性低、且對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對 3淀粉樣蛋白纖維或3淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高，并具有抑制淀粉樣蛋白球體對 神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性。淀粉樣蛋白球體由于以與阿爾茨海默病患者的腦內(nèi)存在的3 淀粉樣蛋白同等的濃度誘導神經(jīng)細胞死亡，因此只要獲得(1)具有抑制淀粉樣蛋白球體形 成的活性的抗體、或(2)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性的抗體， 則能夠用作阿爾茨海默病的治療或者預(yù)防藥。另外，只要獲得(3)對淀粉樣蛋白球體的反 應(yīng)性比對0淀粉樣蛋白單體蛋白或0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高的抗體，則還可應(yīng)用于 阿爾茨海默病個體的檢測。本發(fā)明的抗體由于對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性低、而對腦的特 異性高，因此與以往已知的抗淀粉樣蛋白球體抗體相比，能夠成為安全性更高的阿爾茨海 默病的治療藥。
權(quán)利要求
一種抗體，其對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高，且具有以下的任意1個以上的特征(i)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高；(ii)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高；(iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗 原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的 體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的3倍以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的 抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和3淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性 的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對0淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性的5倍以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以 及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和3淀粉樣蛋白單體 蛋白的反應(yīng)性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對0淀粉樣蛋白單體蛋白的 反應(yīng)性的50倍以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以 及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和3淀粉樣蛋白單體 蛋白的反應(yīng)性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性是對0淀粉樣蛋白單體蛋白的 反應(yīng)性的500倍以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是以淀粉樣蛋白球體為抗 原得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的解離常數(shù)為10_9以下。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的抗體，其中，所述抗體在不顯示對人正常組織的 顯著的交叉反應(yīng)性的情況下，與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的立 體結(jié)構(gòu)特異性表位進行識別。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項所述的抗體，其中，所述抗體為來自倉鼠的抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的單克隆抗體，其中，所述抗體是由保藏編號為 FERM BP-10871 或 FERM BP-10872 的雜交瘤產(chǎn)生的。
13.一種人源化抗體，其是通過對由保藏編號為FERM BP-10871或FERM BP-10872的雜 交瘤產(chǎn)生的倉鼠單克隆抗體進行人源化而得到的。
14.權(quán)利要求13所述的人源化抗體或其片段，其包含人源化重鏈和人源化輕鏈， 所述人源化重鏈包含來源于由保藏編號為FERM BP-10872的雜交瘤產(chǎn)生的倉鼠單克隆抗體的3個重鏈互補決定區(qū)CDRs、和來源于人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)框架序列；所述人源化輕鏈包含來源于由保藏編號為FERM BP-10872的雜交瘤產(chǎn)生的倉鼠單克隆 抗體的3個輕鏈互補決定區(qū)CDRs、和來源于人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)框架序列； 并且，3個重鏈互補決定區(qū)⑶Rs分別具有下述氨基酸序列重鏈 CDR1 :Asp Tyr Phe Met Ser，即序列號 11 ；重鏈 CDR2:Gly lie Glu lie Lys Ser Tyr Phe Tyr Ala Thr Tyr Tyr Phe GlySer Val Lys Gly，即序列號12 ；和重鏈 CDR3 :Asn Arg Glu Val Gly Gly Leu Asp Asn，SP序列號 13 ； 3個輕鏈互補決定區(qū)CDRs分別具有下述氨基酸序列輕鏈CDR1 :Thr Leu Arg Ser Gly lie Ser Val Gly Gly Lys Asn lie Tyr,即序列號14；輕鏈 CDR2 :Tyr Ser Ser Tyr Ser Asn Lys Gin Leu Gly Pro，即序列號 15 ；和輕鏈 CDR3 :Ser lie His Glu Ser Asn Ala Tyr Val，SP序列號 16。
15.權(quán)利要求13所述的人源化抗體或其片段，其包含人源化重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述人源化重鏈可變區(qū)含有下述氨基酸序列，即序列號17 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly151015Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr202530Phe Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val354045Xaa Gly lie Glu lie Lys Ser Tyr Phe Tyr Ala Thr Tyr Tyr Phe Gly505560Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Set Lys Asn Thr 65707580Xaa Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr859095Tyr Cys Thr Xaa Asn Arg Glu Val Gly Gly Leu Asp Asn Trp Gly Gin100105110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115120式中，第49位的Xaa為Gly或Ala、第81位的X為Leu或Val ；以及第100位的Xaa為 Thr 或 Arg ；所述輕鏈可變區(qū)含有下述氨基酸序列，即序列號18 GinXaaValLeuThrGinProXaaSerLeuSerAlaSerProGlyAla151015SerAlaSerLeuThrCysThrLeuArgSerGlylieSerValGlyGly202530LysAsnlieTyrTrpTyrGinGinLysProGlySerProProGinXaa354045XaaLeuXaaTyrSerSerTyrSerAsnLysGinLeuGlyProGlyVal505560Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Xaa Ser Ala Asn Ala Xaa lie65707580Leu Leu lie Ser Gly Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 859095Ser lie His Glu Ser Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100105110Thr Val Leu Gly 115式中，第2位的Xaa為Ser或Ala，第8位的Xaa為Ser或Ala，第48位的Xaa為Tyr 或Phe，第49位的Xaa為Leu或Phe，第51位的Xaa為Lys、Phe或Arg，第74位的Xaa為 Ala 或 Thr，第 79 位的 Xaa 為 Gly 或 Ala。
16.權(quán)利要求15所述的人源化抗體或其片段，其具有序列號5記載的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)和序列號7記載的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
17.—種阿爾茨海默病的治療和/或預(yù)防藥物的篩選方法，其包括使受檢物和權(quán)利要 求1 16中任一項所述的抗體與淀粉樣蛋白球體接觸，并以受檢物對淀粉樣蛋白球體的結(jié) 合性為指標來選擇候補物質(zhì)。
18.—種阿爾茨海默病個體的檢測方法，其包括使從懷疑具有阿爾茨海默病的個體 獲得的生物試樣與權(quán)利要求1 16中任一項所述的抗體接觸，測定該樣品中有無與該抗體 發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。
19.一種神經(jīng)細胞保護劑，其含有權(quán)利要求1 16中任一項所述的抗體。
20.一種阿爾茨海默病的檢測用的試劑，其含有權(quán)利要求1 16中任一項所述的抗體。
21.一種藥品，其含有權(quán)利要求1 16中任一項所述的抗體。
22.—種阿爾茨海默病的治療和/或者預(yù)防藥物，其含有權(quán)利要求1 16中任一項所 述的抗體。
23.用于檢測權(quán)利要求1 16中任一項所述的抗體的固相載體，其特征在于，其是包覆 淀粉樣蛋白球體而成的。
24.一種產(chǎn)生權(quán)利要求7或8所述的抗體的雜交瘤。
25.保藏編號為FERMBP-10871或FERM BP-10872的雜交瘤。
26.一種核酸，其含有對權(quán)利要求13 16中任一項所述的人源化抗體的重鏈或輕鏈進 行編碼的序列或其片段。
27.一種用于表達權(quán)利要求13 16中任一項所述的人源化抗體或片段的表達載體，其 含有對所述抗體或片段進行編碼的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性低、且對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對β淀粉樣蛋白纖維或β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高的抗體等。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對淀粉樣前體蛋白的反應(yīng)性高、且具有下述任意1個以上的特征的抗體。(i)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應(yīng)性高；(ii)對淀粉樣蛋白球體的反應(yīng)性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應(yīng)性高；(iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經(jīng)細胞死亡的誘導的活性。
文檔編號C07K16/18GK101878301SQ20088011386
公開日2010年11月3日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者井手野祥次, 佐藤道夫, 保理江智, 內(nèi)藤幸嗣, 堀井肇, 星美奈子, 野田宗宏 申請人:國立大學法人京都大學