抗tlr4抗體及其用圖
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng) 本申請(qǐng)請(qǐng)求2012年3月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/617, 164的權(quán)益，其通過(guò)引用 整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般性涉及特異性結(jié)合Toll樣受體4 (TLR-4)的抗體，以及使用所述抗 TLR4抗體作為治療劑和診斷劑的方法。 技術(shù)背景
[0003] Toll受體首先在果蠅diasoMih)中發(fā)現(xiàn)，是I型跨膜蛋白，在該蛋白的細(xì)胞外 部分中具有富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRRs)，并具有一個(gè)或兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。果 蠅Toll受體的哺乳動(dòng)物同源物稱為"Toll樣受體"（TLR)。TLR通過(guò)識(shí)別微生物粒子并激 活針對(duì)這些微生物粒子來(lái)源的免疫細(xì)胞在先天免疫中發(fā)揮作用。
[0004] 在人中，已經(jīng)鑒定了 11種Toll樣受體，TLR1-11，并通過(guò)它們的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與 IL-1受體的同源性和通過(guò)細(xì)胞外富含亮氨酸的重復(fù)序列的存在得以表征。不同類型的TLR 被不同類型的微生物粒子激活。例如，TLR4主要被脂多糖（LPS)激活，而TLR2被脂磷壁質(zhì) (LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)、脂蛋白（BLP)和肽聚糖（PGN)激活。也已經(jīng)鑒定了 Toll受 體同源物例如RP105。
[0005] 已證明TLR4與輔助蛋白髓樣分化蛋白-2 (MD-2)結(jié)合。已發(fā)現(xiàn)此蛋白與TLR4直 接相互作用，并且MD-2具有使TLR4能夠翻譯后修飾以及促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面的能力。 TLR4和MD-2在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。
[0006] 脂多糖（LPS)，革蘭氏陰性菌的組分，是能夠強(qiáng)力激活先天免疫系統(tǒng)的微生物粒 子。LPS經(jīng)由其多鏈（multi-chain)受體將信號(hào)遞送至免疫細(xì)胞，所述受體包含TLR4/MD-2 復(fù)合物作為主要信號(hào)傳導(dǎo)組分。
[0007] 相應(yīng)地，對(duì)于結(jié)合TLR4和調(diào)節(jié)由TLR4/MD-2復(fù)合物介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法和組合 物存在需求。
[0008] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了識(shí)別細(xì)胞表面表達(dá)的人和/或食蟹猴TLR4/MD-2受體的單克隆抗體。所 述抗體能夠阻斷，例如中和TLR4配體例如LPS誘導(dǎo)的受體激活和后續(xù)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。 本發(fā)明的抗體包括結(jié)合人和食蟹猴TLR4/MD-2受體復(fù)合物并獨(dú)立于MD-2的存在還結(jié)合 TLR4的抗體。
[0009] 本發(fā)明提供了特異性結(jié)合細(xì)胞表面上表達(dá)的人和/或食蟹猴TLR4/MD-2受體并能 夠阻斷通過(guò)LPS誘導(dǎo)的受體激活和后續(xù)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的單克隆抗體。示例性單克隆抗 體包括：1A1、1A6、1B12、1C7、1C10、1C12、1D10、1E11、1E11 N103D、1G12、1E11. CU1E11. C2、 1E11. C3UE11. C4UE11. C5UE11. C6UE11. E1UE11. E2UE11. E3UE11. E4, 1E11. E5UE11. C2E1UE11. C2E3、1E11. C2E4 和 1E11. C2E5。
[0010] 這些抗體具有不同的特異性。一些抗體顯示對(duì)人和食蟹猴TLR4兩者的特異性 和/或?qū)θ撕褪承泛颰LR4/ MD-2受體復(fù)合物兩者的特異性，而且它們已經(jīng)顯示抑制經(jīng)由 LPS的受體激活和后續(xù)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。例如1C12、1E11、1E11 N103D、1E11.C1、1E11. C2、1E11. C3、1E11. C4、1E11. C5、1E11. C6、1E11. C2E1、1E11. C2E2、1E11. C2E3、1E11. C2E4 和 1E11. C2E5獨(dú)立于人或食蟹猴MD-2的存在結(jié)合人和食蟹猴TLR4兩者。1A1、1A6、1B12、1C7、 1C10UD10和1G12獨(dú)立于食蟹猴MD-2的存在僅結(jié)合食蟹猴TLR4。1E11. E1、1E11. E2、1E11. E3、1E11.E4和1E11.E5獨(dú)立于人MD-2的存在僅結(jié)合人TLR4。這些抗體在本文中分別稱作 TLR4抗體。
[0011] 本發(fā)明的人源化抗體包含具有 SEQ ID N0: 2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、67、 69、71、73、75、77、89、93、97或101的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明的人源化的抗體包 含輕鏈可變區(qū)，其具有氨基酸序列SEQ ID勵(lì)：4、79、81、83、85或87。
[0012] 三個(gè)重鏈CDR包括與下列至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多相同的氨基酸序 GFPIRYGYS (SEQ ID NO: 55).GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56).GYPIRHGYS (SEQ ID NO: 57), GFPIGQGYS (SEQ ID NO: 58)、GYPIWGGYS (SEQ ID NO: 59)和 GYPIGGGYS (SEQ ID NO: 60)的可變重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1 (VH⑶Rl，本文也稱為⑶RH1)氨基酸序列；IHYSGYT (SEQ ID NO: 26)的可變重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 (VH⑶R2,本文也稱為⑶RH2)氨基酸序列；和選自 ARKDSGW/Q/D/EMAPY (SEQ ID NO: 111)(其中乂1和乂2每個(gè)獨(dú)立地是任何疏水氨基酸)、 ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27).ARKDSGRLLPY (SEQ ID NO: 28).ARKDSGKWLPY (SEQ ID NO: 29), ARKDSGHLMPY (SEQ ID NO: 30), ARKDSGHNYPY (SEQ ID NO: 31), ARKDSGKNFPY (SEQ ID NO: 32)、ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 33)、ARKDSGHNLPY (SEQ ID NO: 34)、ARKDS⑶YFPY (SEQ ID NO: 35)和 ARKDSGRYWPY (SEQ ID NO: 36)的可變重鏈互補(bǔ)決定區(qū) 3 (VH CDR3， 本文也稱為CDRH3)氨基酸序列。三個(gè)輕鏈CDR包括與下列至少90%、92%、95%、97%、98%、 99%或更多相同的氨基酸序列：QSISDH (SEQ ID N0: 37)的可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1 (VL ⑶R1，本文也稱為⑶RL1)氨基酸序列；YAS (SEQ ID N0: 38)的可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 (VL 〇?2，本文也稱為〇)1^2)氨基酸序列；和選自006(￥/沁（0/^)$/^)?乂1'(5￡0 10勵(lì)：112) (其中 X 是任何疏水氨基酸)、QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)、QQGNDFPVT (SEQ ID N0: 61)、 QQGYDEPFT (SEQ ID NO: 62)、QQGYDFPFT (SEQ ID NO: 63)、QQGYDYPFT (SEQ ID NO: 64) 和QQGYEFPFT (SEQ ID NO: 65)的可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(VL CDR3,本文也稱為CDRL3)氨 基酸序列?？贵w結(jié)合人和食蟹猴TLR4/MD-2復(fù)合物，當(dāng)不與人和食蟹猴MD-2復(fù)合時(shí)結(jié)合人 和食蟹猴TLR4,結(jié)合人TLR4/MD-2復(fù)合物，當(dāng)不與人MD-2復(fù)合時(shí)結(jié)合人TLR4,當(dāng)不與食蟹 猴MD-2復(fù)合時(shí)結(jié)合食蟹猴TLR4/MD-2復(fù)合物或食蟹猴TLR4。
[0013] 本發(fā)明的抗TLR4抗體還包括如下抗體，其包括與SEQ ID N0: 2、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、67、69、71、73、75、77、89、93、97 或 101 的氨基酸序列至少 90%、92%、95%、97%、 98%、99%或更多相同的重鏈可變氨基酸序列，和/或與SEQ ID N0: 4、79、81、83、85或87的 氨基酸序列至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變氨基酸。
[0014] 本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合人和/或食蟹猴TLR4和/或人和/或食蟹猴TLR4/MD-2 復(fù)合物，其中所述抗體結(jié)合人和/或食蟹猴TLR4上在SEQ ID N0: 23(人TLR4)和/或SEQ ID N0: 24 (食蟹猴TLR4)的殘基289-375之間包括一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的表位。例 如，TLR4抗體特異性結(jié)合包括SEQ ID NO: 23 (人）和/或SEQ ID NO: 24 (食蟹猴）的殘 基349的表位。在一些實(shí)施方案中，表位還包括額外的殘基，例如選自下列的殘基：SEQ ID NO: 23 (人）和/或SEQ ID NO: 24 (食蟹猴）的至少殘基328和329 ;SEQ ID NO: 23 (人） 和/或SEQ ID NO: 24 (食蟹猴）的至少殘基351;和SEQ ID NO: 23 (人）和/或SEQ ID NO: 24 (食蟹猴）的至少殘基369-371，及其任意組合。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合Toll樣受體4 (TLR4)的分離的抗體， 其中所述抗體結(jié)合包括SEQ ID N0: 23的至少殘基349的表位和包括SEQ ID N0: 24的 至少殘基349的表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包括具有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的重 鏈，所述互補(bǔ)決定區(qū)包括GYSITGGYS (SEQ ID N0: 25)的可變重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1 (⑶RH1) 氨基酸序列；IHYSGYT (SEQ ID N0: 26)的可變重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(⑶RH2)氨基酸序列；和 ARKDSGftiMAMxpPY (SEQ ID NO: 111)的可變重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 (CDRH2)氨基酸序列， 其中乂1是N、Q、D或E，X 2是任何疏水氨基酸，并且X 3是任何疏水氨基酸；以及具有三個(gè)⑶R 的輕鏈，所述互補(bǔ)決定區(qū)包括QSISDH (SEQ ID N0: 37)的可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1 (⑶RL1) 氨基酸序列；YAS (SEQ ID N0: 38)的可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 (⑶RL2)氨基酸序列；和 QQGHSFPLT(SEQ ID N0: 39)的可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(CDRL3)氨基酸