專利名稱：抗FGF-2抗體Dab-2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，特別涉及一種抗FGF-2高特異性的鼠源抗體Dab-2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor 2, FGF2)又名堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，是成纖維細胞生長因子家族中的一員，是一種廣泛的有絲分裂原，可通過自分泌或旁分泌的方式促進多種細胞，包括腫瘤細胞的增殖、分化。FGF家族成員主要通過與其高親和力受體的結(jié)合向細胞內(nèi)傳遞信號，發(fā)揮其生物學(xué)活性。FGF-2是一個多功能分子，分子表面具有多種結(jié)合表位，像受體結(jié)合位點，肝素結(jié)合位點，整合素結(jié)合位點等多個表位。針對不同表位的抗體具有不同的功能。而且,針對同一抗原的單克隆抗體具有非常大的多樣性，可變區(qū)序列不同，也代表了單抗的親和力的功能的差異。黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，惡性黑色素瘤仍然是世界范圍內(nèi)最為難治的腫瘤之一，美國每年有25000個惡性黑素瘤新增病例，死亡約6000人。隨著污染的日益加劇，我國黑色素瘤患者日益增多。黑色素瘤細胞是FGF-2高分泌的細胞，這種自分泌或旁分泌的FGF-2可直接刺激腫瘤細胞的增值，促進腫瘤血管新生，加速腫瘤細胞的侵潤和轉(zhuǎn)移。自從1975年單克隆抗體技術(shù)建立以來，各種單克隆抗體相繼出現(xiàn)，這些單克隆抗體在疾病的診斷和治療方面發(fā)揮重要作用。同時也為難治的腫瘤等疾病帶來希望。目前美國FDA批準(zhǔn)用于腫瘤治療的抗體藥物有十多種。其中，2011年首次批準(zhǔn)了治療黑色素瘤的單抗藥物Yervoy, Yervoy是針對VEGFR的抗體藥物,開創(chuàng)了抗體藥物治療黑色素瘤的先例。黑色素瘤存在FGF2的高表達，且有證據(jù)表面FGF2的活性增加與腫瘤血管新生密切相關(guān)，而且FGF-2本身具有促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。所以，針對FGF-2的抗體能夠有效中和黑色素瘤患者體內(nèi)高表達的FGF-2，抑制腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤的生長。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種抗FGF-2抗體Dab_20本發(fā)明的另一目的在于提供所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種抗FGF-2抗體Dab-2，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如下所示QVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEfflGfflDPENGDTVY
APKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCTYDGYFDYffGQGTTLTVSS ；所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如下所示DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVYRYGDTYLHWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFS
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLELKRTVAAP ；編碼所述的重鏈可變區(qū)的基因序列如下所示CAGGTTCAGCTT CAGCAATCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTATCTGCAGCTCAGCCGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACCTATGATGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA ；編碼所述的輕鏈可變區(qū)的基因序列如下所示GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACCGTTATGGAGACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAACCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGACTGTGGCTGCACCA ；編碼所述的重鏈可變區(qū)的基因由345個堿基組成，編碼115個氨基酸，可變區(qū)含有3個⑶R(互補決定簇)區(qū)ADRl編碼5個氨基酸，⑶R2編碼17個氨基酸，⑶R3編碼7個氨基酸。編碼所述的輕鏈可變區(qū)的基因由354個堿基組成，編碼118個氨基酸，可變區(qū)含有3個⑶R(互補決定簇)區(qū)ADRl編碼16個氨基酸，⑶R2編碼7個氨基酸，⑶R3編碼7個
氨基酸。上述抗FGF-2抗體Dab-2的用途由于抗體的生物活性是由抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性的基因序列決定的，因此可采用基因工程方法，將編碼所述的抗FGF-2抗體Dab-2的基因構(gòu)建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體(如Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體(scFv)、納米抗體(Nanobody)、抗體融合蛋白)和IgG全抗體。在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞獲得該抗體基因表達或以此基因為基礎(chǔ)改建后的含有該抗體基因可變區(qū)的任何其他基因。該抗FGF-2抗體Dab-2，可在臨床上進行如下應(yīng)用(I)用于腫瘤的診斷，⑵抑制腫瘤血管新生和抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，(3)抑制肝、肺、腎纖維化的進程。上述的抗FGF-2抗體Dab-2在制備用于診斷和治療腫瘤(黑色素瘤)以及抑制內(nèi)臟(如腎、肝或肺等)纖維化的抗體藥物中的應(yīng)用。一種抗人FGF-2嵌合抗體，是將上述抗FGF-2抗體Dab_2的輕、重鏈可變區(qū)分別與人源抗體的恒定區(qū)融合得到?！N抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體的表達載體,含有編碼所述的抗人FGF-2嵌合抗體的基因序列；所述的抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體的表達載體的制備方法，包括以下步驟(I)設(shè)計引物①輕鏈的上游引物(5’ -3’)AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA ；
②輕鏈的下游引物(5’ -3’)GGGGCAGCCTTGGGCTGACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTCAG ；③輕鏈恒定區(qū)上游引物5’-AGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3’④輕鏈恒定區(qū)下游引物5 ’-TCTAGAATCATTATGAACAITCTGTAGGGG-3’⑤重鏈的上游引物5’-GAGCTCACTCCCAGGITCAGCTTCAGCAATC-3’ ；⑥重鏈的下游引物5’-GGGCCCTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA-3’ ；(2)輕鏈可變區(qū)基因片段的制備以編碼所述的輕鏈可變區(qū)的基因序列為模板，使用引物①和引物②擴增輕鏈可變區(qū)基因片段；(3)人輕鏈恒定區(qū)基因片段的制備以人B淋巴細胞cDNA為模板，使用引物③和引物④擴增得到人輕鏈恒定區(qū)基因片段；(4)嵌合抗體輕鏈基因的制備以步驟(2)得到的輕鏈可變區(qū)片段和步驟(3)得到的人輕鏈恒定區(qū)片段為模板，使用引物①和引物④擴增得到嵌合抗體輕鏈基因；(5)重鏈可變區(qū)基因片段的制備以編碼所述的重鏈可變區(qū)的基因序列為模板，使用引物⑤和引物⑥擴增重鏈可變區(qū)基因片段；(6)抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體表達載體的制備將步驟(4)制備得到的嵌合抗體輕鏈基因通過Xba I和HindIII酶切位點克隆入真核表達載體plgG，得到重組載體PlgG-L ;將步驟(5)制備得到的重鏈可變區(qū)基因片段通過SacI和ApaI酶切位點克隆入真核表達載體plgG-L，得到抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體表達載體pIgG_Dab_2。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明所述的抗FGF-2抗體Dab-2具有親和力高、特異性高的優(yōu)點。


圖I是通過ELISA篩選抗bFGF陽性的噬菌體克隆圖。圖2是抗FGF-2抗體Dab_2的特異性檢測結(jié)果圖。圖3是抗FGF-2嵌合抗體表達目的蛋白的SDS-PAGE圖；泳道I是分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2 3是純化樣品。圖4是抗FGF-2嵌合抗體的ELISA結(jié)果圖。圖5是抗FGF-2嵌合抗體抑制黑色素瘤細胞增殖效果圖。圖6是抗FGF-2嵌合抗體誘導(dǎo)黑色素瘤的細胞凋亡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例I(一 )曬菌體抗體庫的篩選首先將重組人bFGF (北京啟維益成公司)用0. 05mol/L、pH8. 7的碳酸鹽緩沖液稀釋至50 100 ii g/mL,用ImL包被免疫管(Immunotube, NUNC公司)，4°C過夜,次日以質(zhì)量體積比2. 5%的脫脂奶粉加滿免疫管37°C封閉2h，倒去封閉液，加入ImL噬菌體天然抗體庫(約IO13CFU, Enprobiotech公司，貨號EA001)，37°C孵育2h，吸去噬菌體抗體液，以含體積百分比0. 05%吐溫20的PBS(0. 01M,pH7. 2)洗2次(第二輪洗10次，以后洗滌20次以上)，蒸餾水洗滌I次。然后用2種方法回收結(jié)合于固相的噬菌體抗體①先加入ImL新鮮XLl-Blue菌(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，37°C孵育15min后轉(zhuǎn)入IOmL含20 y g/mLAmp (氨芐青霉素)、10yg/mL Tet(四環(huán)素)的SB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含細菌培養(yǎng)用胰化蛋白陳309g，酵母提取物209g，19gMoPs,pH7. 0);②再將細菌感染回收后的免疫管用蒸餾水洗滌2次，力口A ImL洗脫液(0. ImL HCl、以甘氨酸調(diào)至pH = 2. 2后加入BSA至質(zhì)量體積比為0. I % )，于37°〇靜置151^11，進行 洗脫回收，將洗脫液吸出后，立即加入40111 2mol/L Tris溶液中和，再加入 IOmL XLl-Blue 細胞(0D600 = 0. 8) 37°C靜置 15min,接著加入 IOmL 含 20 y g/mLAmp、10 u g/mL Tet的SB培養(yǎng)基。從2次回收的菌液分別取出適量鋪盤測定CFU，其余細菌37°C培養(yǎng)3h，擴大體積到50mL，加入I. 7 X IO12PFU輔助病毒VCSM13 (廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司)，30°C振蕩培養(yǎng)過夜。次日回收上清，常規(guī)PEG沉淀，所得的次級噬菌體抗體庫可進行下一輪的篩選。按相同方法進行3輪淘選，得到陽性噬菌體Fab抗體克隆。( 二)噬菌體抗體的制備及抗bFGF特異性的檢測從篩選第4輪的培養(yǎng)盤隨機挑取集落在含有50 u g/mL Amp的2YT培養(yǎng)液中37°C過夜培養(yǎng)，第二天取30 ill細菌到ImL LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入輔助病毒VCSMl3，30°C培養(yǎng)過夜，收取上清。按以下程序進行ELISA檢測將抗原(即bFGF)稀釋至10 u g/mL,用50 ill稀釋后的抗原包被ELISA板，2h后棄去孔內(nèi)液體，用質(zhì)量體積比3%脫脂奶-PBS溶液(即用0. 01M、pH7. 2的PBS配制的脫脂奶溶液)封閉后加入噬菌體抗體液(即第三輪篩選獲得的陽性噬菌體)，37°C孵育Ih，用質(zhì)量體積比0. 05% Tween20-PBS溶液(即用0. OlM pH7. 2的PBS配制)洗滌3次，加入HRP-抗M13抗體(Promega公司)進行反應(yīng)，洗滌后加入TMB底物顯色，讀取A450值。篩選到的具有與bFGF特異性結(jié)合的噬菌體抗體克隆的ELISA結(jié)果如圖I所示，圖I的結(jié)果表明，通過三輪噬菌體展示篩選，篩選到了抗bFGF陽性的噬菌體Fab抗體克隆，結(jié)果顯示，Dan-2, Dab-Il和Dab_E3均具有很好的bFGF親和力，其中Dan-2抗體的bFGF親和性最高。將篩選獲得的親和力最高的抗bFGF陽性噬菌體抗體克隆Dan-2送上海生物工程有限公司測序，得到如下序列編碼所述的重鏈可變區(qū)的基因序列如下所示CAGGTTCAGCTTCAGCAATCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCCTATCTGCAGCTCAGCCGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACCTATGATGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA ；編碼所述的輕鏈可變區(qū)的基因序列如下所示GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACCGTTATGGAGACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAACCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATdu JJ B il ^ Luw du d -T7 HMU C個吁,4—HMU Uf U8 al, ^ du JJ B il4:v*lJ^^*tv :M 5 i V r、0^$0 l-xxxcqEOod( fevf/ 9 §p^-s^$0 )聆盤釤菡農(nóng)(啶<<S133X) IOds 蔣(啶<<S133X) I onx^lr。I-XXXCqEOOd 拉躺遛餾鍘鏨迆瑚(efl 平惡容 I、0^ ^ Iofi盤迆瑚VNaU^頰豳-KE^il餾蔣豳-K拉躺趙回釧辰洱趙回蓉CR4Sl^lr 豳-KE 稍遛餾 sMt:s,mJ (I)酵電蔣拉躺 xxxcqsood(fcvf/9R4slazc^}fl 平惡容銫)R4 SI 釤「面農(nóng)(啶<<T3J133X) I Mqx 蔣(啶<<T3J133X) I 0 - S〔 §0〕
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X 6/9 Pf-ZHM V^COZZTSOT Zo司)0. 5 il L，T4連接酶緩沖液2. 5 il L，補水至25 u L。16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (Invitrogen公司)感受態(tài)細胞。(4)可溶性表達將上述連接反應(yīng)成功構(gòu)建的pComb3xTT_Fab可溶性表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151菌株(Promega公司)。挑取陽性克隆進行原核表達，將鑒定正確的克隆接種2mL SB培養(yǎng)基(上海華壹生物科技有限公司)，37°C、200rpm的速度振蕩培養(yǎng)8 9小時，接著將培養(yǎng)得到的ImL菌液接種至50mL含有濃度20 u g/mLAmp的SB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ 0.6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)2 8小時，誘導(dǎo)表達之后將菌體離心，棄去上清，0. 01M, pH7. 2的PBS重懸菌體，超聲破碎。12000g/min離心之后取上清。 (5)表達產(chǎn)物的ELISA鑒定用0. 05mol/L、pH8. 7的碳酸鹽緩沖液將FGF-2 (北京啟維益成公司)分別稀釋重組VEGF(Sigma公司)、重組VEGF(Sigma公司)、重組白介素-2(IL_2,Sigma公司)和牛血清白蛋白(BSA, Sigma公司)成1000ng/mL包被液。在96孔板中分別加入100 u L/孔的重組人FGF-2、IOOng/孔重組VEGF、IOOng/孔IL-2和BSA包被液，4°C包被過夜。用質(zhì)量體積比5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉30分鐘，加入100 ii L PBS (廣州展晨生物科技有限公司GMS)洗滌2次，每次5分鐘。加入上述制備得到的抗FGF-2Fab抗體的表達上清50 u L，37°C孵育I小時，PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入HRP-羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗(按體積比為I : 5000稀釋，Promega公司)。洗滌5次，每次5分鐘，加入TMB底物顯色，讀取A450值。結(jié)果顯示，表達的抗FGF-2Fab抗體僅能與FGF-2結(jié)合，呈現(xiàn)較高的親和力，二對其他的VEGF、11-2、BSA等均沒有反應(yīng)。表面其能夠特異性的結(jié)合FGF-2。(三)抗人FGF-2抗體Dab-2輕、重鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽產(chǎn)物在制備用于診斷或治療腫瘤中的應(yīng)用以本發(fā)明所述的抗體Dab-2輕重鏈可變區(qū)基因出發(fā)，可以構(gòu)建并表達多種形式的蛋白，如用來構(gòu)建嵌合抗體。用所述抗Dab-2的抗體可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)通過基因拼接(嵌合PCR)構(gòu)建成人-鼠嵌合抗體，從抗人FGF-2抗體Dab-2出發(fā)構(gòu)建的人-鼠嵌合抗體抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用見圖。由于其完整保留了鼠源抗體的親和力，同時又能夠降低免疫原性，不容易在患者體內(nèi)產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA反應(yīng))，在腫瘤治療中將能發(fā)揮良好的治療效果。以本發(fā)明所述的抗體Dab-2輕、重鏈可變區(qū)基因出發(fā)，還可以構(gòu)建人源化抗體針對可變區(qū)的人源化改造，包括CDR移植,表面氨基酸殘基修飾，表位導(dǎo)向選擇等。與嵌合抗體相比，人源化抗體主要保留了鼠源抗體可變區(qū)中的三個CDR區(qū)，其余的骨架區(qū)均更換成人源的氨基酸，從而進一步降低免疫原性?？筛玫拈_發(fā)成抗體藥物用于腫瘤等疾病的治療。小分子抗體Fab，主要由重鏈的可變區(qū)CHl區(qū)以及完整的輕鏈組成；單鏈抗體ScFv，用一個連接肽(Gly4Ser) 3連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成；雙鏈抗體Dabody,用一個小連接肽Gly4Ser連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成雙鏈抗體,是二價抗體，故親和力比ScFv要高。雙特異性或雙功能抗體，與其他的抗體分子通過構(gòu)建成雙特異性或雙功能的Diabody或者全抗體來實現(xiàn)。重組蛋白融合蛋白，通過與其他的效應(yīng)蛋白融合構(gòu)成抗體融合蛋白等。示例(I)抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體的構(gòu)建和表達將所獲的的抗FGF-2抗體Dab-2的輕重鏈可變區(qū)基因分別與人源抗體的恒定區(qū)通過嵌合PCR方法構(gòu)建成嵌合抗體。具體過程如下①輕鏈的上游引物(5，-3，)AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA ；②輕鏈的下游引物(5，-3，)GGGGCAGCCTTGGGCTGACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTCAG ；
③輕鏈恒定區(qū)上游引物5’-AGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3’④輕鏈恒定區(qū)下游引物5’-TCTAGAATCATTATGAACATTCTGTAGGGG-3⑤重鏈的上游引物5’-GAGCTCACTCCCAGGITCAGCTTCAGCAATC-3’ ；⑥重鏈的下游引物5’ -GGGCCCTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA-3，；(2)以上述pComb3XTT-Fab-geneIII表達載體和人B淋巴細胞cDNA(為取外周血淋巴細胞，抽總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到)為模板，通過嵌合PCR擴增將鼠源的輕鏈可變區(qū)與人源的輕鏈恒定區(qū)構(gòu)建成嵌合輕鏈基因片段。其具體過程是以pC0mb3XTT-Fab-geneIII表達載體為模板，引物①和引物②擴增輕鏈可變區(qū)，以人B淋巴細胞cDNA為模板，擴增人輕鏈恒定區(qū)。以這兩種PCR產(chǎn)物為模板，引物①和引物④擴展全長的嵌合抗體輕鏈。擴增輕鏈可變區(qū)基因片段反應(yīng)體系和條件為pComb3XTT-Fab-geneIII表達載體I u L, dNTP 混合物(濃度 2mM) 4u L, IOX 緩沖液 5 y L，I y L Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/V- 1，Promega) 0. 5 u I,引物①和引物②(10 u mol/L)各I y L,添加去離子水至50 u L。PCR反應(yīng)條件為94°C 4min,50°C 45Sec，72°C lmin，29 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin0擴增人輕鏈恒定區(qū)基因片段反應(yīng)體系和條件為人B淋巴細胞cDNA為模板3 U L，dNTP 混合物(濃度 2mM) 4u L, IOX 緩沖液 5 y L，I y L Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/u I,Promega) 0. 5 iil，引物③和引物④(10 u mol/L)各I y L，添加去離子水至50 y L。PCR反應(yīng)條件為94°C 4min,50°C 40Sec，72°C 45Sec，26 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin0嵌合PCR擴增完整嵌合抗體輕鏈基因片段應(yīng)體系和條件為前兩部擴增得到的輕鏈可變區(qū)基因片段和人輕鏈恒定區(qū)基因片段各I U L為模板，dNTP混合物(濃度2mM) 4 u L，緩沖液51^，1111 Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/y 1，Promega) 0. 5 y 1，引物①和引物④(10 u mol/L)各I y L，添加去離子水至50 u L。PCR反應(yīng)條件為-MV 4min, 50°C 50Sec,72°C lmin, 28個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收并純化，得到PCR擴增的嵌合抗體輕鏈基因片段。(3)以引物⑤和引物⑥擴展出鼠源重鏈可變區(qū)基因片段，與PlgG(美國Script研究所，該表達載體包含人的重鏈恒定區(qū)序列)載體上的人重鏈恒定區(qū)鏈接構(gòu)成完整的嵌合抗體重鏈基因片段。擴增人重鏈可變區(qū)基因片段反應(yīng)體系和條件為pComb3XTT-Fab-geneIII表達載體 I ii L，dNTP 混合物(濃度 2mM) 4u L,緩沖液 5 y L，I y L Blend Taq DNA 聚合酶(2. 5U/V- 1，Promega) 0. 5 u I,引物①和引物②(10 u mol/L)各I y L,添加去離子水至50 u L。PCR反應(yīng)條件為94°C 4min，50°C 50Sec，72°C lmin，28個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收并純化，得到PCR擴增的人重鏈可變區(qū)基因片段。(4)將嵌合抗體的輕鏈基因片段和重鏈基因片段連接真核表達載體plgG。酶切反應(yīng)通過Xba I (Takara公司)和HindIII (Takara公司)分別雙酶切(按說明書操作，37°C酶切6小時)pIgG載體和PCR擴增的嵌合抗體輕鏈基因片段片段，通過酶切產(chǎn)物回收試劑盒回收載體片段和輕鏈基因片段片段，T4DNA連接酶(Promega公司，按照說明書操作)連接，構(gòu)建嵌合抗體載體plgG-L。通過SacI (Takara公司)和ApaI (Takara公司)分別雙酶切(按說明書操作，37°C酶切6小時)載體plgG-L和PCR擴增的嵌合抗體重鏈基因片段，通過酶切產(chǎn)物回收試劑盒回收載體片段和重鏈基因片段片段，T4DNA連接酶(Promega公司，按照說明書操作)連接，構(gòu)建嵌合抗體載體pIgG_Dab_2。以上構(gòu)建過程，陽性克隆篩選過程如下連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (Promega公司)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定。將pIgG-Dab-2陽性克隆送上海生物工程公司測序，證實得到目的載體。
(5)嵌合抗體的表達將獲得的重組pIgG-Dab-2嵌合抗體表達載體質(zhì)粒通過Fugen 6試劑(Roche公司)，按照試劑說明書操作步驟瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞(中科院上海細胞所)表達。(6)表達上清純化過程收集的細胞表達上清用50%的飽和硫酸銨沉淀，4°C放置過夜后，8500rpm離心20min，棄上清，于沉淀中加入8mL PB (20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl,pH7. 4)使之溶解,經(jīng)PB透析后，用0. 45 iim濾膜過濾,然后用Ni SepharoseTM 6Fast Flow進行純化先用5倍柱體積的平衡緩沖液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，5mM咪唑，pH7. 4)平衡，然后以250iil/min的流速上樣，上樣后用平衡緩沖液(20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，5mM咪唑，PH7. 4)沖洗，然后用含有200mmol/L咪唑的PB洗脫雜蛋白，用含有300mmol/L咪唑的PB洗脫目的蛋白。最后將所收集的目的蛋白301 超濾管超濾并用？85(0.01511101/1、？11值7.4)置換，得到抗FGF-2嵌合抗體。用12% SDS-PAGE電泳鑒定純化后的抗FGF-2嵌合抗體，結(jié)果(圖3)顯示在分子量70kD和40kD左右出現(xiàn)目的蛋白帶，分別代表了嵌合抗體的完整重鏈和輕鏈。并且純化后抗體的純度達到了 95%以上。(7)用ELISA檢測表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性將重組人FGF-2用0. 05mol/L，pH值9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋至0. 5 ii g/mL，以IOOii L/孔包被ELISA板，37°C孵育3h后棄去孔內(nèi)液體，PBST (含體積百分比0. 05% Tween20和0. 015mol/L、pH值7. 4的PBS)洗滌3次。用質(zhì)量百分比5%脫脂奶-PBST封閉后，以100 u L/孔加入一定濃度步驟(6)制備的抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體，37°C孵育lh，用PBST洗滌3次后，IOOii L/孔加入按體積比I : 5萬稀釋的羊抗人IgGl-Fc-HRP多抗(santa cruz公司)，37°C孵育lh，PBS_T洗滌5次之后加A TMB顯色，測A450值，實驗以PBS為陰性對照。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明通過真核表達的抗FGF-2嵌合抗體同樣具有結(jié)合FGF-2的活性。嵌合抗體稀釋到60ng時ELISA的光吸收值仍在I. 0以上，表面該嵌合抗體具有較好的FGF-2親和力。(8)檢測該抗FGF-2嵌合抗體的抗腫瘤活性取對數(shù)期黑色素瘤B16細胞(中科院上海細胞所)，轉(zhuǎn)入96孔細胞培養(yǎng)板(1000個細胞/孔)，37°C孵育9h后，加入純化的腹水型FGF2單抗(200 y g/mL)。37°C孵育72h，加入CCK8試劑(CCK8試劑盒，上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司，產(chǎn)品貨號SUNBI008008) 10 u L，37°C孵育2h，酶標(biāo)儀檢測A450值。結(jié)果如圖5所示，說明嵌合抗體可有效抑制黑色素瘤細胞的增殖，具有較好的抗腫瘤作用。取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16細胞，以I X IOVmL密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板；8h后加入含體積百分比0. 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制的各濃度的FGF2嵌合抗體(50 u g/mL, 100 u g/mL, 200 u g/mL)，空白對照組為不含抗體的0. 5%血清濃度的DMEM，陰性對照組為與FGF2單抗相同濃度的非免疫IgG，繼續(xù)培養(yǎng)96h后；根據(jù)AnnexinV-FITC/PI試劑盒(廣州佰默生物科技有限公司)說明說處理細胞，上流式細胞儀檢測。結(jié)果如圖6所示，說明嵌合抗體可有效誘導(dǎo)黑色素瘤細胞凋亡，表明該抗bFGF嵌合抗體能夠通過誘導(dǎo)黑色素瘤發(fā)生凋亡，并通過誘發(fā)凋亡來抑制黑色素瘤細胞的增殖，從而達到治療腫瘤的作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方 式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗FGF-2抗體Dab-2，其特征在于所述的抗FGF-2抗體Dab_2的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗FGF-2抗體Dab-2，其特征在于編碼所述的重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示；編碼所述的輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.權(quán)利要求I或2所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應(yīng)用，其特征在于所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子Dab-2抗體可用于制備診斷和治療腫瘤和/或抑制內(nèi)臟纖維化的抗體藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為黑色素瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應(yīng)用，其特征在于所述的內(nèi)臟為腎、肝或肺。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應(yīng)用，其特征在于所述的抗體藥物為將編碼所述的抗FGF-2抗體Dab-2的基因構(gòu)建、表達，得到的多種形式的小分子基因工程抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗FGF-2抗體Dab-2的應(yīng)用，其特征在于所述的小分子基因工程抗體為Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體、納米抗體、抗體融合蛋白或IgG全抗體。
8.一種抗人FGF-2嵌合抗體，其特征在于將權(quán)利要求I所述的抗FGF-2抗體Dab-2的重鏈可變區(qū)、權(quán)利要求I所述的抗FGF-2抗體Dab-2的輕鏈可變區(qū)分別與人源抗體的恒定區(qū)融合得到抗人FGF-2嵌合抗體。
9.一種抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體的表達載體,其特征在于含有權(quán)利要求2所述的重鏈可變區(qū)的基因序列和所述的輕鏈可變區(qū)的基因序列。
10.權(quán)利要求9所述的抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體的表達載體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)設(shè)計引物 ①輕鏈的上游引物如SEQID NO. 5所示； ②輕鏈的下游引物如SEQID NO. 6所示； ③輕鏈恒定區(qū)上游引物如SEQID NO. 7所示； ④輕鏈恒定區(qū)下游引物如SEQID NO. 8所示； ⑤重鏈的上游引物如SEQID NO. 9所示； ⑥重鏈的下游引物如SEQID NO. 10所示； (2)輕鏈可變區(qū)基因片段的制備以編碼所述的輕鏈可變區(qū)的基因序列為模板，使用引物①和引物②擴增輕鏈可變區(qū)基因片段； (3)人輕鏈恒定區(qū)基因片段的制備以人B淋巴細胞cDNA為模板，使用引物③和引物④擴增得到人輕鏈恒定區(qū)基因片段； (4)嵌合抗體輕鏈基因的制備以步驟⑵得到的輕鏈可變區(qū)片段和步驟⑶得到的人輕鏈恒定區(qū)片段為模板，使用引物①和引物④擴增得到嵌合抗體輕鏈基因； (5)重鏈可變區(qū)基因片段的制備以編碼所述的重鏈可變區(qū)的基因序列為模板，使用引物⑤和引物⑥擴增重鏈可變區(qū)基因片段； (6)抗人FGF-2抗體Dab-2嵌合抗體表達載體的制備將步驟(4)制備得到的嵌合抗體輕鏈基因通過Xba I和HindIII酶切位點克隆入真核表達載體plgG，得到重組載體plgG-L ；將步驟(5)制備得到的重鏈可變區(qū)基因片段通過SacI和ApaI酶切位點克隆入真核表達載體plgG- L,得到抗人FGF-2抗體Dab_2嵌合抗體表達載體pIgG_Dab_2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗FGF-2抗體Dab-2及其應(yīng)用。該抗FGF-2抗體Dab-2的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。編碼重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO.3所示。編碼輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO.4所示。該抗FGF-2抗體Dab-2具有高親和力和特異性。將編碼該抗FGF-2抗體Dab-2的基因構(gòu)建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體，如Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體、納米抗體、抗體融合蛋白和IgG全抗體等，可用于制備診斷和治療腫瘤和/或抑制內(nèi)臟纖維化的抗體藥物。
文檔編號G01N33/574GK102617734SQ201110449690
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者唐勇, 姜浩武, 宋其芳, 王宏, 王盼盼, 鄧寧, 黃建芳 申請人:暨南大學(xué)