專利名稱：Rg1抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的針對(duì)多肽RG1的抗體，RG1在前列腺和其他的腫瘤細(xì)胞中被優(yōu)先表達(dá)。特別地，本發(fā)明涉及這些抗體用于癌癥以及癌癥轉(zhuǎn)移灶的治療和檢測(cè)的用途。
背景技術(shù)：
前列腺癌是一種男性經(jīng)常發(fā)生的疾病，其中發(fā)現(xiàn)約三分之一45歲以上年齡的男性都患有前列腺癌。目前存在遺傳的和環(huán)境的病因的證據(jù)，大多數(shù)病例可能是兩種因素的組合的結(jié)果。對(duì)家族性癌癥的研究已經(jīng)表明遺傳易感性在所有前列腺癌患者的約5-10％患者以及約45％年齡小于55歲的男性病例中發(fā)揮著作用。
目前存在前列腺癌以多步驟疾病的形式發(fā)生的證據(jù)，其中一種前驅(qū)病變是前列腺上皮內(nèi)瘤形成(PIN)。疾病的早期是雄激素依賴性的，而晚期是激素非依賴性的。臨床上經(jīng)?？梢詸z測(cè)出被稱為良性前列腺增生癥的前列腺增生性病變，但它可能不是癌癥發(fā)生過程中的一個(gè)階段。但是，它經(jīng)常與前列腺癌相關(guān)。前列腺的癌癥常常是多灶的、通常緩慢生長(zhǎng)的、和異質(zhì)的癌癥。晚期的癌癥經(jīng)常轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)和骨骼。
通過體格檢查和通過前列腺特異抗原(PSA)的血清水平一般可以診斷前列腺癌。根治性前列腺切除術(shù)是局灶病變的治療選擇。目前用睪丸切除術(shù)或GnRH(促性腺激素釋放激素)治療所誘導(dǎo)的雄激素去除和抗雄激素治療治療進(jìn)展性的轉(zhuǎn)移性疾病。但是，進(jìn)展性的疾病(advanceddisease)幾乎常常都變?yōu)榧に氐挚?，并且不能治愈進(jìn)行性疾病(progressive disease)。另外，存在與根治性前列腺切除術(shù)和雄激素去除治療相關(guān)的嚴(yán)重的副作用。這些副作用包括高危的與根治性前列腺切除術(shù)相關(guān)的尿失禁和陽痿以及與雄激素去除治療相關(guān)的骨折和骨質(zhì)疏松。
因此，存在對(duì)用于治療早期和晚期的前列腺癌的新的治療方法的大量需求。也存在對(duì)新的診斷試劑的顯著需求，因?yàn)樵\斷試劑顯著地影響著治療方案。例如，如果疾病已經(jīng)進(jìn)展到超出了前列腺并已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)，那么就不再進(jìn)行根治性前列腺切除術(shù)，因?yàn)樗鼘?duì)進(jìn)展性疾病沒有任何作用，反而可能帶來顯著的不必要的副作用。一種能檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的試劑將具有重大價(jià)值。
已經(jīng)證實(shí)在前列腺癌中存在著特異蛋白表達(dá)的變化，包括p53在晚期前列腺癌中的異常表達(dá)、降低了水平的TGF-β受體、降低了水平的E-cadherin、C-Cam(一種細(xì)胞粘附分子)、和一些整聯(lián)蛋白。在晚期的雄激素非依賴性的腫瘤中，癌基因bcl-2的表達(dá)被明顯地增高，并且高水平表達(dá)bcl-2的患者的預(yù)后是相當(dāng)?shù)牟睢ｋm然已經(jīng)很好地證明了先前提及的基因表達(dá)的變化，但是已經(jīng)鑒定出已被證實(shí)是疾病的病因的基因的表達(dá)沒有發(fā)生變化。因此，鑒定出其表達(dá)與前列腺腫瘤的存在或發(fā)生相關(guān)的新蛋白將是有用的，它能作用為定向于前列腺癌診斷和治療的組合物的分子靶點(diǎn)。
多肽RG1(見美國(guó)專利5,871,969)是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Mindin/F-spondin家族的一種同系物。已證實(shí)RG1多肽在前列腺組織內(nèi)高表達(dá)(見WO98/45442)，以及它應(yīng)當(dāng)是一種用于前列腺癌的診斷和治療以及其中有RG1表達(dá)的其他癌癥的有用的靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了對(duì)RG1多肽具有高度選擇性的抗體、或其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，它可被應(yīng)用于檢測(cè)與疾病狀態(tài)例如前列腺癌、腎癌、結(jié)腸或卵巢癌相關(guān)的RG1表達(dá)的方法，或應(yīng)用于對(duì)這些疾病狀態(tài)的治療。
為了這些目標(biāo)，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與RG1多肽(SEQ ID NO2)中的一個(gè)表位特異性結(jié)合的分離的抗體、或其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體。特別優(yōu)選的是以小于或等于1μM的解離常數(shù)(KD)與RG1多肽的表位結(jié)合的人抗體，更優(yōu)選的是KD小于或等于100nM，以及最優(yōu)選的是KD小于或等于10nM。
根據(jù)本發(fā)明的更加優(yōu)選的實(shí)施方式，提供了分離的抗體和其抗原結(jié)合性抗體片段，其包括一種包括SEQ ID NO26或SEQ ID NO29的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
也提供了分離的抗體和其抗原結(jié)合性抗體片段，其包括一種包括SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30或SEQ ID NO31的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式是一種人抗體，它包括一個(gè)具有SEQ ID NO26的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和一個(gè)具有SEQ IDNO27或SEQ ID NO28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。第二個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式是一種人抗體，它包括一個(gè)具有SEQ ID NO29的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和一個(gè)具有SEQ ID NO30或SEQ ID NO31的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，可以預(yù)期具有與上述的氨基酸序列具有80％序列相同性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
也提供了編碼上述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。優(yōu)選的是一種包括由包括SEQ ID NO20或SEQ ID NO23的核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)的抗體。也優(yōu)選的是一種包括由包括SEQ ID NO21、SEQID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO25編碼的重鏈可變區(qū)的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方式，抗體與可檢測(cè)的標(biāo)記物結(jié)合，用于作為施用給體外細(xì)胞、離體細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞、或多細(xì)胞生物體的診斷試劑的用途。特別優(yōu)選的是一種與放射性標(biāo)記、酶、生色團(tuán)或熒光劑結(jié)合的抗體。特別優(yōu)選的檢測(cè)方法是免疫閃爍法和正電子發(fā)射斷層術(shù)，其中用于免疫閃爍法的抗體將與放射性同位素例如111In或99mTc結(jié)合，或用于正電子發(fā)射斷層的抗體將與43Sc、44Sc、52Fe、55Co、68Ga、64Cu、86Y或94mTc結(jié)合。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了與治療劑例如蓖麻毒素或放射性同位素綴合的抗體，抗體用于施用給體外細(xì)胞、離體細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞、或多細(xì)胞生物體。在這個(gè)方面優(yōu)選的是細(xì)胞毒的治療劑。特別優(yōu)選的治療劑將是與放射性同位素例如90Y和177Lu綴合的抗體。在這個(gè)方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，給人患者施用這些結(jié)合抗體，用于治療以RG1表達(dá)為特征的疾病狀態(tài)例如前列腺癌以及特別是進(jìn)展性的轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過使用螯合劑完成RG1抗體或其抗原結(jié)合性片段與可檢測(cè)的標(biāo)記物或細(xì)胞毒劑的綴合，螯合劑選自由p-SCN-苯基-DTPA和其衍生物、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″，N-tetracetic acid，DOTA)和其衍生物、以及1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-N，N′，N″-triacetic acid，NOTA)和其衍生物所構(gòu)成的組。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種用于治療與RG1多肽表達(dá)相關(guān)的疾病狀態(tài)例如前列腺的方法，其使用了本發(fā)明的免疫綴合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種用于檢測(cè)與RG1多肽表達(dá)相關(guān)的疾病狀態(tài)例如前列腺癌的方法，其使用了本發(fā)明的免疫綴合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了多肽和抗獨(dú)特型的抗體，它們可被用于刺激免疫應(yīng)答。
通過下面的描述，本發(fā)明的其他目的、特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)和方面對(duì)于那些熟練的技術(shù)人員將是顯而易見的。但是要明白僅僅是以舉例說明的方式給出了下面的描述和具體的實(shí)施例，它們說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。通過閱讀下面的描述和通過閱讀本說明書的其他部分，在所闡述的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾對(duì)于本領(lǐng)域人員將是顯而易見的。


圖1111In標(biāo)記的RG1抗體的生物分布用111In放射性標(biāo)記三種RG1抗體(A、B和C)、非特異的hIgG1對(duì)照抗體和ProstascintTM。給帶瘤(LNCaP)的裸鼠靜脈內(nèi)施用放射性標(biāo)記的抗體(比活性0.3mCi/mg)。在注射后6、24、120和150個(gè)小時(shí)將每組12只動(dòng)物殺死(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只動(dòng)物)，并監(jiān)測(cè)放射性標(biāo)記在腫瘤、血液和肝臟內(nèi)的蓄積(見實(shí)施例11)。
圖290Y標(biāo)記的RG1抗體的抗腫瘤作用給帶LNCaP腫瘤的動(dòng)物注射90Y標(biāo)記的抗體(抗RG1抗體B和C或非特異的IgG1，比活性為0.5mCi/mg)。腹腔內(nèi)施用單次劑量的125μCi90Y標(biāo)記的RG1抗體(B、C)。在第32天殺死小鼠，切下腫瘤并稱重(見實(shí)施例12)。
圖3人單克隆抗體B的鏈可變區(qū)的氨基酸序列，包括突變的重鏈可變區(qū)。VL(SEQ ID NO26)、VH(SEQ ID NO27)、VH_2m(SEQ IDNO28)。
圖4人單克隆抗體C的鏈可變區(qū)的氨基酸序列，包括突變的重鏈可變區(qū)。VL(SEQ ID NO29)、VH(SEQ ID NO30)、VH_3m(SEQ IDNO31)。
具體實(shí)施例方式
定義在說明書、實(shí)施例和所附的權(quán)利要求書的用途中，除非另有說明，下面的術(shù)語具有所說明的含義。
“rg1”指的是具有SEQ ID NO1所展示的序列的多核苷酸，以及編碼具有SEQ ID NO2所展示的RG1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，以及編碼RG1變體、衍生物和片段，以及變體和衍生物的片段的多核苷酸。Rg1也指的是那些由RNA構(gòu)成的多核苷酸，以及為編碼SEQ ID NO2所展示的多肽序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈的多核苷酸。
“RG1”指的是具有SEQ ID NO2所展示的氨基酸序列的多肽、其變體和衍生物、和SEQ ID NO2的片段、及其變體和衍生物。當(dāng)指的是SEQID NO2多肽時(shí)，術(shù)語“變體”、“片段”和“衍生物”意味著一種基本上保留了與SEQ ID NO2多肽相同的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的多肽。
“生物學(xué)活性”指的是天然存在的RG1多肽的結(jié)構(gòu)性、調(diào)節(jié)性或生物化學(xué)功能。
“免疫學(xué)活性”指的是(1)天然的、重組的或合成的RG1、或其任何片段誘導(dǎo)合適的動(dòng)物或細(xì)胞中的特異的免疫應(yīng)答以及與特異抗體結(jié)合的能力，或(2)RG1的抗體與RG1體內(nèi)結(jié)合以及觸發(fā)針對(duì)表達(dá)RG1的組織或腫瘤的增強(qiáng)了的細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。
“天然存在的RG1”指的是還沒有被遺傳學(xué)加工的人類細(xì)胞所產(chǎn)生的RG1以及特異地預(yù)期多肽的翻譯后修飾所生成的各種RG1形式都屬于術(shù)語所指的范圍之內(nèi)，翻譯后修飾包括但不限定于乙?；?、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、?；土呀?。
“天然RG1”或“nRG1”指的是處于其天然構(gòu)象的RG1。
“多核苷酸”通常指的是任何的多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。因此，例如，多核苷酸在此指的是單鏈和雙鏈DNA(DNA是單鏈和雙鏈區(qū)的混和物)、單鏈和雙鏈RNA(RNA是單鏈和雙鏈區(qū)的混和物)、包括DNA和RNA的雜交分子(DNA和RNA可以是單鏈的或更常見的是雙鏈的或單鏈和雙鏈區(qū)的混和物)等等。另外，多核苷酸在此指的是包括RNA或DNA或RNA和DNA的三鏈區(qū)。這些區(qū)域內(nèi)的鏈可以來自相同的分子或來自不同的分子。這些區(qū)域可以包括一個(gè)或多個(gè)分子的所有區(qū)域，但更常見的是僅僅包括一些分子的一個(gè)區(qū)域。三螺旋區(qū)域的其中一個(gè)分子是一種寡核苷酸。
術(shù)語“多核苷酸”在此包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的上述的DNA或RNA。因此，具有因?yàn)榉€(wěn)定性或其他的原因而被修飾的骨架的DNA或RNA是在術(shù)語“多核苷酸”在此所指的范圍之內(nèi)。此外，包括稀有堿基例如次黃嘌呤核苷或修飾堿基例如氚標(biāo)記堿基的DNA或RNA(僅舉兩例)，都是在此所用的術(shù)語多核苷酸。
要明白為了實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域人員已知的多種有用的目的，已經(jīng)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行了大量的修飾。在此所采用的術(shù)語“多核苷酸”包括這些多核苷酸的化學(xué)地、酶地、或代謝地修飾的形式，以及病毒和細(xì)胞包括簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞的特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式等等。
“寡核苷酸”指的是相對(duì)短的多核苷酸。術(shù)語常常指的是單鏈的脫氧核糖核苷酸，但它還可以指的是單鏈或雙鏈的核糖核苷酸、RNA:DNA雜合體和雙鏈DNA，等等。通常可以用化學(xué)方法例如那些在自動(dòng)化的寡核苷酸合成器中所應(yīng)用的方法合成寡核苷酸，例如單鏈的DNA探針寡核苷酸。但是，可以用多種其他的方法制備寡核苷酸，這些方法包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)和通過DNA在細(xì)胞和生物體中表達(dá)的方法?！肮押塑账帷被颉暗途垠w”或多核苷酸“片段”、“部分”或“節(jié)段”指的是至少約10個(gè)核苷酸以及最多約60個(gè)核苷酸的多核苷酸序列，優(yōu)選的是約15到30個(gè)核苷酸、以及更優(yōu)選的是約20-25個(gè)核苷酸。
“多肽”在此包括下面所述的所有多肽。多肽的基本結(jié)構(gòu)是熟知的并且在本領(lǐng)域的多種教科書和其他的文獻(xiàn)中已經(jīng)將其描述。在上下文中，術(shù)語在此指的是任何包括兩個(gè)或多個(gè)在直鏈上彼此經(jīng)肽鍵連接在一起的氨基酸的多肽或蛋白。術(shù)語在此指的是短鏈(它在本領(lǐng)域也常被稱作為肽、寡肽和低聚體)和長(zhǎng)鏈(它在本領(lǐng)域一般被稱做為蛋白，它有多種類型)。
要明白多肽常常含有20種常被稱作為20種天然存在的氨基酸的氨基酸以外的氨基酸，在給定的多肽中，多個(gè)氨基酸包括末端的氨基酸都可以被修飾，或通過天然過程例如糖基化和其他的翻譯后修飾，或通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。常見的修飾包括糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的γ羧化、羥基化和ADP核糖基化，在絕大多數(shù)基礎(chǔ)教科書中都描述了這些修飾以及其他的修飾，例如I.E.Creighton，Proteins-Structure and Molecular Properties，2nd Ed.，W.H.Freeman andCompany，New York，1993?？梢垣@得多個(gè)關(guān)于這個(gè)主題的詳盡的綜述，例如Wold，F(xiàn).，in Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp 1-12，1983；Seifter et al.，Meth.Enzymol 182626-646，1990 and Rattan et al.，Protein SynthesisPosttranslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62，1992所提供的綜述。
要明白多肽并非一直都是完全線性的，這一點(diǎn)是熟知的并且上面都有所提及的。例如，作為泛素化的結(jié)果，多肽可以是有分支的，并且它們可以是環(huán)型的，可有或沒有分支，這通常是翻譯后事件的結(jié)果，翻譯后事件包括天然加工事件和非天然存在的人為操作所實(shí)現(xiàn)的事件。通過非翻譯的天然過程和通過完全合成的方法都能合成環(huán)型的、分支的和分支環(huán)型的多肽。
在多肽的任何地方都可以存在修飾，包括肽鏈骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。事實(shí)上，在天然存在的和合成的多肽中，經(jīng)共價(jià)修飾對(duì)多肽的氨基或羧基、或兩個(gè)基團(tuán)的阻斷是常見的，并且這些修飾都可以出現(xiàn)在本發(fā)明的多肽中。例如，在蛋白裂解處理之前，在大腸桿菌中所制備出的多肽的氨基末端的殘基幾乎常常都是N-甲酰甲硫氨酸。
出現(xiàn)在多肽中的修飾常常是多肽是如何被制備的一種體現(xiàn)。例如，對(duì)于通過在宿主中表達(dá)所克隆的基因制備出的多肽，通過宿主細(xì)胞翻譯后的修飾能力以及在多肽氨基酸序列中所存在的修飾信號(hào)都可以確定出大部分的修飾的性能和程度。例如，熟知的是糖基化通常不會(huì)發(fā)生在細(xì)菌宿主例如大腸桿菌中。因此，當(dāng)需要糖基化時(shí)，應(yīng)當(dāng)在糖基化宿主中表達(dá)多肽，這通常是真核細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞通?？梢赃M(jìn)行與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同的翻譯后的糖基化，因此，已經(jīng)發(fā)展出昆蟲表達(dá)系統(tǒng)以有效地表達(dá)具有天然模式的糖基化等等的哺乳動(dòng)物蛋白。類似的考慮適用于其他的修飾。
一般而言，術(shù)語多肽在此包括所有的這些修飾，特別是那些出現(xiàn)在在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多核苷酸所合成的多肽中的修飾。
“衍生物”指的是分別來源于天然存在的rg1、RG1或來源于與RG1結(jié)合的抗體的多核苷酸或多肽，通過化學(xué)修飾例如泛素化、標(biāo)記(例如放射性核素、各種酶的修飾)、PEG化(聚乙二醇衍生化)或通過在人類蛋白中正常不會(huì)存在的氨基酸例如鳥氨酸的插入或取代(或編碼這樣的一種氨基酸的核苷酸的取代)。
“編碼多肽的多核苷酸”在此包括多核苷酸，它包含編碼本發(fā)明的多肽，特別是編碼具有SEQ ID NO2所展示的氨基酸序列的RG1多肽的核苷酸序列。該術(shù)語包括那些包含編碼多肽的單一連續(xù)區(qū)域或不連續(xù)區(qū)域(例如，被內(nèi)含子所阻斷的)連同其他區(qū)域的多核苷酸。
多肽“片段”、“部分”、或“節(jié)段”是一段至少約5個(gè)氨基酸長(zhǎng)的氨基酸殘基、常常是至少約7個(gè)氨基酸長(zhǎng)、常見的是至少約9到13個(gè)氨基酸長(zhǎng)、以及在不同的實(shí)施方式中，是至少約17個(gè)以上氨基酸長(zhǎng)?！捌巍敝傅氖蔷哂信c上面所提及的RG1多肽、或RG1的抗體、及其變體或衍生物的氨基酸序列的部分序列但不是全部序列完全相同的氨基酸序列的多肽。
“缺失”被定義為一種多核苷酸或氨基酸序列的變化，其中相應(yīng)地有一個(gè)或多個(gè)多核苷酸或氨基酸殘基是不存在的。
“插入”或“添加”是多核苷酸或氨基酸序列的變化，與天然存在的多肽或氨基酸相比，它相應(yīng)地造成了一個(gè)或多個(gè)多核苷酸或氨基酸殘基的添加。
“取代”是相應(yīng)地由不同的多核苷酸或氨基酸對(duì)一個(gè)或多個(gè)多核苷酸或氨基酸的取代所造成的。
術(shù)語多核苷酸或多肽的“變體”在此是被如下描述的，以及在本說明書的其他地方被更詳細(xì)地描述。
多核苷酸的變體是一種在多核苷酸序列上不同于另一種參照多核苷酸的多核苷酸。差異通常是被限定的，使得參照的和變體的多核苷酸序列總體上是極為相似的，并且在多個(gè)區(qū)域上都是相同的。
變體的多核苷酸序列的變化可以是沉默(silent)變化。也就是說，它們不變更多核苷酸編碼的氨基酸。如果變更被限定于這種類型的沉默變化，變體將編碼具有與參照氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。也如下面所提及的，變體的多核苷酸序列的變化可以變更參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所討論的，這些多核苷酸的變化可以造成參照序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截?cái)唷?br> 多肽的變體是一種在氨基酸序列上不同于另一種參照多肽的多肽。差異通常是被限定的，使得參照的和變體的序列總體上是極為相似的，并且在多個(gè)區(qū)域上都是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上的差異可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加、缺失、融合和截?cái)啵梢砸匀魏蔚慕M合形式出現(xiàn)。通過利用遺傳密碼中的“多余信息”可以合成或選擇出編碼這些相同或相似多肽的重組變體。可以引入各種密碼子取代例如產(chǎn)生各種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的沉默變化，以優(yōu)化克隆到質(zhì)粒或病毒載體內(nèi)或在特殊的原核或真核系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)。也可以引入突變以修飾多肽的性能，以改變配體結(jié)合的親和力、鏈間親和力、或多肽降解或轉(zhuǎn)換速度。
如在此所討論的那樣，預(yù)期多肽、抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的較小變異都在本發(fā)明所包含的范圍之內(nèi)，假定氨基酸序列的較小變異保留了原始序列的至少80％、更優(yōu)選的至少85％、90％、95％和最優(yōu)選的99％的序列。特別地，預(yù)期保守氨基酸取代屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。保守區(qū)域是那些在其側(cè)鏈有所相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的取代。遺傳學(xué)編碼的氨基酸通常被分成以下幾種家族(1)酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；(3)非極性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不帶電荷的極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸是脂酰羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂酰家族；和苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳香家族。例如，預(yù)計(jì)異亮氨酸或纈氨酸對(duì)亮氨酸、谷氨酸對(duì)天冬氨酸、絲氨酸對(duì)蘇氨酸的孤立的取代、或一種結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸對(duì)一種氨基酸的相似的取代不會(huì)對(duì)所形成的分子的結(jié)合力或性能造成重要影響是合乎情理的，特別是如果取代沒有涉及框架位置內(nèi)的氨基酸時(shí)。通過比較多肽衍生物和未修飾多肽的比活性可以容易地確定出氨基酸變化是否形成了功能性多肽。對(duì)于本應(yīng)用的目的，本發(fā)明包括保持了對(duì)RG1表位的結(jié)合親和力(KD)小于1μM的權(quán)利要求的抗體的變體。
用下面的術(shù)語描述兩種或多種多核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系“參照序列”、“比較窗”、“序列相同性”、“序列相同性百分比”、“基本上相同性”、“相似性”、和“同源的”?！皡⒄招蛄小笔怯米鳛樾蛄斜容^的基礎(chǔ)的給定序列；參照序列可以是更大的序列的亞組，例如，全長(zhǎng)cDNA或序列表列內(nèi)所給出的基因序列的節(jié)段，或者參照序列可以包括完整的cDNA或基因序列。參照序列通常是至少18個(gè)核苷酸或6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，經(jīng)常是至少24個(gè)核苷酸或8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，以及常常是至少48個(gè)核苷酸或16個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸或氨基酸序列中的每個(gè)序列都可以(1)包括一個(gè)在兩個(gè)分子之間是相似的序列(即完整的核苷酸或氨基酸序列的一部分)；和(2)還可以包括在兩個(gè)多核苷酸或氨基酸序列之間是有分歧的序列，所以通常通過比較兩個(gè)分子在“比較窗”之上的序列進(jìn)行兩個(gè)(或多個(gè))分子之間的序列比較，以鑒定并比較序列的局部區(qū)域的相似性?！氨容^窗”在此指的是一個(gè)至少18個(gè)連續(xù)核苷酸位點(diǎn)或6個(gè)氨基酸的概念性節(jié)段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以與至少18個(gè)連續(xù)核苷酸或6個(gè)氨基酸序列的參照序列比較，并且其中對(duì)于兩個(gè)序列的最佳排列，當(dāng)與參照序列(沒有包括添加或缺失)比較時(shí)，比較窗內(nèi)的多核苷酸序列的部分可以包括20％或小于20％的添加、缺失、取代、等等(即缺口)。通過Smith和Waterman的局部同源性算法Adv.Appl.Math.2482(1981)、通過Neddleman和Wunsch的同源性排列算法J.Mol.Biol.48443(1970)、通過Pearson和Lipman的搜索相似性方法Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988)、通過計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)的算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)、Geneworks、或MacVector軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)、或通過觀察、和所選擇的各種方法生成的最佳排列(即生成了比較窗之上的最高百分比的同源性)可以進(jìn)行用于排列比較窗的序列的最佳排列。
術(shù)語“序列相同性”意思是兩個(gè)多核苷酸或氨基酸序列在比較窗之上是相同的(即以核苷酸對(duì)核苷酸或殘基對(duì)殘基為基礎(chǔ))。通過比較兩種在比較窗之上最佳排列的序列，確定出在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如，A、T、G、U或I)或殘基的位點(diǎn)的數(shù)目以得到匹配位點(diǎn)的數(shù)目、用匹配位點(diǎn)的數(shù)目除以比較窗內(nèi)的位點(diǎn)的總數(shù)目(即窗口大小)、并用100乘以結(jié)果得到序列相同性的百分比，計(jì)算出術(shù)語“序列相同性百分比”。術(shù)語“基本上相同性”在此表示一個(gè)多核苷酸或氨基酸序列的一種特征，其中當(dāng)與參照序列在至少18個(gè)核苷酸(6個(gè)氨基酸)位點(diǎn)的比較窗之上，經(jīng)常是在至少24-48個(gè)核苷酸(8-16個(gè)氨基酸)的比較窗之上進(jìn)行比較時(shí)，多核苷酸或氨基酸包括具有至少85％序列相同性、優(yōu)選地至少90到95％序列相同性、更常見的至少99％序列相同性的序列，其中通過在比較窗之上比較參照序列和可能包含缺失或添加的序列計(jì)算出序列相同性百分比，這些序列所包括的缺失或添加是參照序列的20％或小于20％。參照序列可以是更大序列的亞組。當(dāng)被用于描述多肽時(shí)，通過比較一個(gè)多肽的氨基酸序列及保守氨基酸取代與第二個(gè)多肽的序列可以確定出術(shù)語“相似性”。當(dāng)被用于描述多核苷酸時(shí)，術(shù)語“同源的”表示當(dāng)具有合適的核苷酸插入或缺失的兩個(gè)多核苷酸或其指定序列被最佳排列并被比較時(shí)，兩者的至少70％的核苷酸、常從約75％到99％的核苷酸、和更優(yōu)選的至少約98到99％的多核苷酸都是相同的。
“抗體”或“抗原結(jié)合性抗體片段”指的是一種完整抗體、或它的能與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異結(jié)合的片段。當(dāng)解離常數(shù)小于或等于1μM，優(yōu)選的是小于或等于100nM和最優(yōu)選的是小于或等于10nM時(shí)，認(rèn)為抗體或抗原結(jié)合性抗體片段與抗原特異結(jié)合。通過本領(lǐng)域已知的方法可以測(cè)定出結(jié)合力，一個(gè)實(shí)例是應(yīng)用BIAcoreTM設(shè)備。抗體片段包括完整抗體的一個(gè)部分、優(yōu)選地包括完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；雙特異性體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及抗體片段所形成的多特異性抗體(C.A.K Borrebaeck，editor(1995)AntibodyEngineering(Breakthroughs in Molecular Biology)，Oxford University Press；R.Kontermann&S.Duebel，editors(2001)Antibody Engineering(SpringerLaboratory Manual)，Springer Verlag)。除“雙特異性”或“雙功能性”抗體以外的抗體都被理解為是具有相同的結(jié)合位點(diǎn)。
“表位”包括任何能特異地與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體結(jié)合的蛋白決定簇。表位的決定簇通常是由化學(xué)活性的表面分子簇構(gòu)成的，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且這些決定簇常常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征和特異的電荷特征。如果在用本領(lǐng)域人員熟知的任一種方法實(shí)施的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)中，一種抗體表現(xiàn)出與第二種抗體競(jìng)爭(zhēng)，那么就認(rèn)為這兩種抗體是“與相同的表位結(jié)合的”。
“重組”或“重組DNA分子”指的是非天然存在的多核苷酸序列，或通過序列的兩個(gè)彼此分離的節(jié)段的人為組合所制成的多核苷酸序列。經(jīng)“重組產(chǎn)生的”意思是常常通過化學(xué)合成方法或通過對(duì)多核苷酸的分離片段的人為處理例如通過遺傳加工技術(shù)所實(shí)現(xiàn)的人為組合。通常進(jìn)行這樣的處理以用一個(gè)編碼相同的或保守氨基酸的多余密碼子取代另一個(gè)密碼子，同時(shí)常常引入或去除序列識(shí)別位點(diǎn)。同樣地，通過進(jìn)行這樣的處理將多核苷酸節(jié)段與所需的功能結(jié)合在一起，以生成單一的遺傳實(shí)體，它包括在常見的天然形式中所沒有發(fā)現(xiàn)的所需功能的組合。通過設(shè)計(jì)可以包含限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、控制序列、或其他有用的特性。“重組DNA分子”包括克隆和表達(dá)載體。“重組”也可以指的是編碼多肽的并用重組DNA技術(shù)所制備的多核苷酸。
“分離的”意思是“經(jīng)人為地”從它的天然狀態(tài)中所變更的，即如果它是天然存在的，那么它已經(jīng)被改變或已經(jīng)將其從其原始環(huán)境中取出，或者是上述兩者。例如，以其天然狀態(tài)天然地出現(xiàn)在活體動(dòng)物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或多肽卻是“分離的”，如在此所應(yīng)用的術(shù)語。例如，對(duì)于多核苷酸，術(shù)語分離的意思是與天然存在的染色體和細(xì)胞分開的多核苷酸。多核苷酸和多肽可以存在于例如不是天然存在的組合物的組合物例如培養(yǎng)基劑型、用于例如往細(xì)胞內(nèi)引入多核苷酸或多肽的溶液、用于化學(xué)或酶反應(yīng)的組合物或溶液，并且其中所剩下的分離的多核苷酸或多肽也屬于在此所應(yīng)用的術(shù)語的含義之內(nèi)。
“基本上純化的”和“基本上均質(zhì)的”可交換地使用，并用于描述RG1多肽或其片段、或編碼相同多肽的多核苷酸節(jié)段，其中這些多肽或多核苷酸是與天然伴行成分相互分開的。RG1多肽或其片段、或編碼相同多肽的DNA節(jié)段基本上沒有天然伴隨成分，當(dāng)它與在它的天然狀態(tài)中所伴行的自然污染物分開時(shí)。因此，化學(xué)合成的或是在不同于其天然來源細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將基本上沒有天然伴隨成分。相似地，化學(xué)合成的或是在不同于其天然來源細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多核苷酸將基本上沒有天然伴隨成分。
“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”指的是一種方法，其中如在1987年7月28日提交的美國(guó)專利No.4,683,195種所述的擴(kuò)增DNA的特異部分。一般而言，必須得到相關(guān)的多肽片段的末端或超出該末端的序列信息，這樣可以設(shè)計(jì)出寡核苷酸引物；這些引物將彼此指向，并且在序列上與所擴(kuò)增的模板的反向鏈?zhǔn)窍嗤幕蛳嗨频摹蓚€(gè)引物的5’末端核苷酸將與擴(kuò)增材料的末端相同?？梢杂肞CR從總的基因組DNA、從總的細(xì)胞RNA所轉(zhuǎn)錄的eDNA、質(zhì)粒序列等中擴(kuò)增出特異的DNA序列(常見于Mullis etal.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51263，1987；Erlich，ed.，PCRTechnology，Stockton Press，NY，1989)。
“嚴(yán)格性”通常出現(xiàn)在從約Tm(解鏈溫度)-5℃(探針的Tm以下5℃)到約Tm以下20℃到25℃的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域人員明白可以用嚴(yán)格雜交鑒定或檢測(cè)出相同的多核苷酸序列或鑒定或檢測(cè)出相似的或相關(guān)的多核苷酸序列。術(shù)語“嚴(yán)格條件”在此意思是僅僅當(dāng)序列之間具有至少95％以及優(yōu)選地至少97％相同性時(shí)才會(huì)發(fā)生雜交。
“雜交”在此應(yīng)當(dāng)“包含”任何的經(jīng)堿基配對(duì)將一條多核苷酸鏈與互補(bǔ)鏈結(jié)合在一起的方法(Coombs，J.，Dictionary of Biotechnology，StocktonPress，New York，N.Y.，1994)。
“治療有效劑量”指的是緩解了疾病狀態(tài)的癥狀或狀況的多肽或其抗體、拮抗劑、或抑制劑包括反義分子和核酶的量。當(dāng)一個(gè)劑量減慢或終止了腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)，或發(fā)現(xiàn)其縮小了腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的大小、使得導(dǎo)致了對(duì)象的壽命被延長(zhǎng)時(shí)，那么就認(rèn)為該劑量是治療癌癥或其轉(zhuǎn)移灶的治療有效劑量。如果一個(gè)劑量導(dǎo)致了患者的總體生活質(zhì)量的改善即減輕疼痛，那么也認(rèn)為該劑量是治療有效的。通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法可以確定出這些化合物的治療療效和毒性，例如ED50(在50％人群中治療有效的劑量)和LD50(使得50％人群致死的劑量)。治療和毒性作用之間的劑量比值是治療指數(shù)，它可被表示為比值ED50/LD50。
“治療”在此覆蓋了對(duì)患者的疾病狀態(tài)的治療，這些疾病狀態(tài)包括以增高了水平的RG1為特征的疾病狀態(tài)，例如前列腺癌或進(jìn)展性的轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
具體實(shí)施方式
抗體本發(fā)明涉及與RG1多肽特異性結(jié)合的，特別是與具有氨基酸序列SEQ ID NO2的RG1多肽特異性結(jié)合的抗體、其抗原結(jié)合性抗體片段、以及抗體和片段的變體。這些抗體例如可以是多克隆的或單克隆的抗體。更優(yōu)選的是單克隆的抗體。仍更優(yōu)選的是嵌合的或人源化的抗體，以及仍更優(yōu)選的是人抗體。
預(yù)期在本發(fā)明所屬范圍之內(nèi)的抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、以及抗體和片段的變體以小于或等于1μM的解離常數(shù)(KD)與RG1多肽的一個(gè)表位結(jié)合。更優(yōu)選的是以小于或等于100nM的KD與RG1多肽結(jié)合的抗體。最優(yōu)選的是以小于或等于10nM的KD與RG1多肽結(jié)合的抗體。預(yù)期也在本發(fā)明所屬范圍之內(nèi)是識(shí)別并與下面所述的抗體結(jié)合的表位相同的表位結(jié)合的抗體，利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究可以確定這些抗體。
本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、以及抗體和片段的變體由一種輕鏈可變區(qū)和一種重鏈可變區(qū)構(gòu)成。在這個(gè)方面的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中的是抗體、其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，其包括一種與氨基酸序列SEQ ID NO26或SEQ ID NO29具有至少80％、更優(yōu)選的至少90％、仍更優(yōu)選的至少95％、和仍更優(yōu)選的99％序列相同性的輕鏈可變區(qū)。也優(yōu)選的實(shí)施方式是抗體、其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，其包括一種與氨基酸序列SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30或SEQ ID NO31具有至少80％、更優(yōu)選的至少90％、仍更優(yōu)選的至少95％、和仍更優(yōu)選的99％序列相同性的重鏈可變區(qū)(見圖3和4)。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式是抗體、其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO26或SEQ ID NO29的輕鏈可變區(qū)，它們相應(yīng)地是由核苷酸序列SEQ ID NO20和23編碼的。
也特別優(yōu)選的實(shí)施方式是抗體、其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，包括一種具有選自SEQ ID NO27、28、30或31的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，它們相應(yīng)地是由核苷酸序列SEQ ID NO21、22、24和25編碼的。
在這個(gè)方面的更優(yōu)選的實(shí)施方式是抗體、或其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO26的輕鏈可變區(qū)以及還包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO27或SEQ ID NO28的重鏈可變區(qū)，和第二種抗體包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO29的輕鏈可變區(qū)以及還包括具有一種氨基酸序列SEQ ID NO30或SEQ ID NO31的重鏈可變區(qū)。
最優(yōu)選的是人抗體、或其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，如下(1)一種抗體，其包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO26的輕鏈可變區(qū)和一種具有氨基酸序列SEQ ID NO27的重鏈可變區(qū)，(b)一種抗體，其包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO26的輕鏈可變區(qū)和一種具有氨基酸序列SEQ ID NO28的重鏈可變區(qū)，(c)一種抗體，其包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO29的輕鏈可變區(qū)和一種具有氨基酸序列SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)，(d)一種抗體，其包括一種具有氨基酸序列SEQ ID NO29的輕鏈可變區(qū)和一種具有氨基酸序列SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)。
抗體生產(chǎn)可以將RG1多肽、片段或衍生物、或表達(dá)它們的細(xì)胞用作為免疫原以生成它們的抗體(Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，NY(1989))?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)這些抗體和片段(C.A.KBorrebaeck，editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in MolecularBiology)；Oxford University Press；R.Kontermann&S.Duebel，editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual)，SpringerVerlag)。
通過往動(dòng)物體內(nèi)直接注射多肽或通過給動(dòng)物(優(yōu)選的是非人的動(dòng)物)施用多肽都可以得到所生成的抗RG1的抗體。然后所得到的抗體本身將與多肽結(jié)合。通過這種方式，也可以用甚至僅僅編碼多肽的一個(gè)片段的序列生成與整個(gè)天然多肽結(jié)合的抗體。然后這些抗體可被用于從表達(dá)多肽的組織中分離出多肽。不需要使用純化的RG1蛋白或RG1肽生成RG1的抗體的可選擇的方法包括DNA免疫接種法，其中利用編碼RG1的DNA生成表達(dá)載體或病毒，并用該載體或病毒轉(zhuǎn)染或感染宿主的組織細(xì)胞，使得在用于生成抗體的動(dòng)物中表達(dá)RG1；或基于細(xì)胞的免疫接種法，其中在免疫接種過程中使用體外形成的表達(dá)RG1的細(xì)胞株。
利用任何技術(shù)都可以制備單克隆抗體，它們提供了用連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的抗體。實(shí)例包括用雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，Nature 256495-497，1975)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，Immunology Today 472，1983)和EBV雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)人單克隆抗體(Cole et al.，inMonoclonal Antibodies and Cancer，Alan R.Liss，Inc.，77-96，1985)。對(duì)于使用表達(dá)RG1的細(xì)胞株的基于細(xì)胞的免疫接種法，可以用消減免疫接種使得動(dòng)物對(duì)親代細(xì)胞株產(chǎn)生免疫耐受(Sleiste，H.M.and Rao，A.G.，J.Immunological Methods 261213-220，2002)。
另外，發(fā)展出了用于生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)，可以使用將小鼠抗體基因剪接到人抗體基因中以得到具有合適的抗原特異性和生物學(xué)活性的分子的技術(shù)(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855，1984；Neuberger et al.，Nature 312604-608，1984；Takeda et al.，Nature 314452-454，1985)。同樣的，所述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利No.4,946,778)可適用于生產(chǎn)RG1特異的單鏈抗體。
此外，用在美國(guó)專利Nos.5,877,397和5,569,825中所述的方法可以生產(chǎn)“人”抗體，在此將其全部?jī)?nèi)容一同并入?yún)⒖?，或通過應(yīng)用異種小鼠TM，如在Mendez et al.Nature Genetics 15146-156，1997中所述的那樣。利用噬菌體展示技術(shù)也可以生成這些抗體(Rader et al.，Current Opinion inBiotechnology 8155-168，1997；Aujame et al.，Human Antibodies 8155-168，1997)。人抗體的生成是非常吸引人的，因?yàn)轭A(yù)計(jì)這些抗體可使得人對(duì)小鼠或小鼠來源的單克隆抗體的內(nèi)在的免疫原性的和過敏性的應(yīng)答最小化。在實(shí)施例4中描述了識(shí)別RG1多肽(SEQ ID NO2)的表位的人抗體的生成。
通過體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群中的生產(chǎn)或通過篩選重組免疫球蛋白庫(kù)或高特異性結(jié)合試劑的名單也可以生成抗體，如在Orlandi et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833-3837，1989和Winter及Milstein(Nature 349293-299，1991)所闡述的那樣。
也可以生成含有RG1的特異結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。使用抗體片段而不是整個(gè)抗體常常具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楦〕叽绲钠慰梢詫?dǎo)致更快的清除，并且也可以更好地接近實(shí)體腫瘤。
這些片段包括但不限定于F(ab’)2片段，它可以通過胃蛋白酶消化抗體分子而生成，和Fab片段，它可以通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵橋而生成。同樣地，可以構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)，使得容許對(duì)具有所需特異性的單克隆Fab片段的快速的和容易的鑒定(Huse et al.，Science 2561270-1281，1989)。從大腸桿菌和各種真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中都可以表達(dá)并分泌Fab、Fv和ScFv抗體片段，這使得可以生產(chǎn)大量的這些抗體。同樣地，可以從大腸桿菌中定向地回收Fab’-SH片段，并化學(xué)地結(jié)合形成F(ab’)2片段(Carter et al.，Bio Technology 10163-167(1992))。用于生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域人員是已知的。也包括單鏈Fv片段(scFv)、微型雙功能抗體(diabody)、微抗體(minibody)和其他的基因工程加工的抗體片段(見美國(guó)專利No.5,5761894和5,587,458；Hudson et al.Nature Medicine9129-133，2003)。Fv和sFv片段是具有完整的結(jié)合位點(diǎn)并缺少恒定區(qū)的抗體種類的實(shí)例，因此，它們?cè)隗w內(nèi)應(yīng)用中更可能表現(xiàn)出非特異結(jié)合力的減低，并特別優(yōu)選地用作為顯像劑(C.A.K Borrebaeck，editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology)，OxfordUniversity Press；R.Kontermann&S.Duebel，editors(2001)AntibodyEngineering(Springer Laboratory Manual)，Springer Verlag)?？贵w片段也可以是“線性抗體”。例如，如在美國(guó)專利No.5,641,870中所述的抗體。這些線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
預(yù)期在此所述的抗體或抗體片段的變體也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，利用用于保守和非保守突變的任一種技術(shù)和指南都可以制備出這些變體，例如美國(guó)專利No.5,364,934。變異包括編碼抗體的一個(gè)或多個(gè)密碼子的取代、缺失或插入，造成了與天然抗體序列相比時(shí)的氨基酸序列的變化。這些預(yù)期屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)的變異的應(yīng)用包括那些導(dǎo)致(1)對(duì)蛋白裂解或氧化滅活的易感性的降低；(2)對(duì)形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力或?qū)乖慕Y(jié)合親和力的變更；(3)體內(nèi)清除或生物分布的變更；(4)抗體同種型或同種異型的變化；(5)抗體的功能特性例如Fc受體結(jié)合力的變化；(6)減少或增加了免疫原性的表位序列的變更；和(7)這些類似物的生理化學(xué)或功能特性的其他變化的應(yīng)用。通過使得在RG1抗體和同源蛋白之間高度同源的區(qū)域內(nèi)所造成的氨基酸序列變化的數(shù)目最小化，可以找出確定插入、取代或缺失氨基酸殘基而沒有反向地影響所需活性的指導(dǎo)。通過系統(tǒng)地進(jìn)行序列的氨基酸插入、缺失或取代并測(cè)試所形成的變體的天然序列所表現(xiàn)出的活性，可以確定出所容許的變異。
一種取代變體的特別優(yōu)選的類型包含取代親代抗體(例如人抗體)的一個(gè)更高可變區(qū)的殘基。一般而言，相對(duì)于從中生成變體的親代抗體，所選定的用于進(jìn)一步發(fā)展的所形成的變體將具有改良的生物學(xué)性能。用于生成這些取代變體的便利方法包含使用噬菌體展示的親和力突變(Schier R.，J.Mol.Biol.，263551-67，1996)。然后如在此所述的篩選變體的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)(見實(shí)施例4)。為了鑒定出能成為用于修飾的較好的侯選者的高變區(qū)的殘基，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定出對(duì)抗原結(jié)合起到重要作用的高變區(qū)的殘基。在一種或多種相關(guān)檢測(cè)中具有更優(yōu)性能的抗體可用于進(jìn)一步的發(fā)展。
可用在此所給出的RG1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)選擇出用于生成抗體的RG1多肽的特異區(qū)域。本領(lǐng)域人員要明白，抗體所定向的RG1多肽的區(qū)域或表位可以隨著預(yù)期應(yīng)用的不同而不同。例如，預(yù)期用于檢測(cè)前列腺細(xì)胞上的膜結(jié)合的RG1的免疫檢測(cè)法中的抗體應(yīng)當(dāng)定向于RG1多肽上的可接近的表位。利用各種本領(lǐng)域已知的其他方法可以容易地鑒定出表現(xiàn)出免疫原性結(jié)構(gòu)的RG1多肽的區(qū)域以及其他的區(qū)域和結(jié)構(gòu)域，這些方法是例如Chou-Fasman、Gamier-Robson、或Jameson-Wolf分析。含有這些殘基的片段特別地適用于生成抗RG1抗體。有用的片段包括但不限定于序列PLGGESICSAGAPAKYSIT(SEQ ID NO8)；HSSDYSMWRKNQYVS(SEQ ID NO10)；DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SEQ ID NO11)；和NEIVDSASVPET(SEQ ID NO12)。在實(shí)施例4中描述了針對(duì)這些區(qū)域的多克隆抗體的生成。
識(shí)別RG1的表位的抗體的用途本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合性抗體片段、和其變體在診斷性檢測(cè)法、顯像方法學(xué)、和用于治療癌癥的治療性方法中可能是特別有用的，RG1在這些癌癥中是過量表達(dá)的，包括前列腺癌、腎癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。
本發(fā)明提供了各種用于檢測(cè)RG1多肽和用于診斷癌癥例如前列腺癌的免疫學(xué)檢測(cè)法。這些檢測(cè)法通常包括一種或多種能識(shí)別并結(jié)合RG1多肽的RG1抗體。最優(yōu)選的抗體將與RG1選擇性結(jié)合，且不會(huì)與非RG1的多肽結(jié)合(或弱結(jié)合)。檢測(cè)法包括本領(lǐng)域熟知的各種免疫學(xué)檢測(cè)格式，包括但不限定于各種類型的放射免疫檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法等等。另外，本發(fā)明也提供了能檢測(cè)前列腺癌的免疫顯像方法，包括但不限定于利用標(biāo)記的RG1抗體的放射閃爍顯像方法。這些檢測(cè)法在癌癥例如前列腺癌的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和預(yù)后上可能是臨床有用的。
可以采用上述的抗體通過將抗體連接到用于經(jīng)親和色譜法的分離和/或純化的固相支持物上，分離或鑒定出表達(dá)多肽的克隆，或純化本發(fā)明的多肽。
另外，可以利用細(xì)胞分選和純化技術(shù)用RG1抗體分離RG1陽性細(xì)胞。具體的，利用基于抗體的細(xì)胞分選或親和純化技術(shù)，可以用RG1抗體從異種移植的腫瘤組織、從培養(yǎng)物的細(xì)胞等中分離出前列腺癌細(xì)胞。本發(fā)明的RG1抗體的其他用途包括生成模擬RG1多肽的抗獨(dú)特型抗體。
可以用RG1抗體檢測(cè)是否存在前列腺癌或腫瘤轉(zhuǎn)移?？梢杂肦G1抗體檢測(cè)在各種生物學(xué)樣本包括血清、前列腺和其他組織活檢樣本中是否存在這些含RG1的細(xì)胞。另外，可以在多種顯像方法中使用RG1抗體，例如使用99mTc(或其他同位素)綴合的抗體的免疫閃爍法。例如，可以用與一種最近描述的使用111In結(jié)合的抗PSMA抗體的顯像方案相似的顯像方案檢測(cè)復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌(Sodee et al.，Clin.Nuc.Med.21759-766，1997)?？梢允褂玫钠渌臋z測(cè)方法是正電子發(fā)射斷層(見Herzoget al.，J.Nucl Med.342222-2226，1993)。
本發(fā)明的RG1抗體可以被可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記，或可以與第二種分子例如細(xì)胞毒劑結(jié)合，并可被用于將第二種分子靶向于RG1陽性細(xì)胞(Vitetta，E.S.et al.，Immunotoxin Therapy，in DeVita，Jr，V.et al.，eds，CancerPrinciples and Practice of Oncology，4th ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，2624-2636，1993)。細(xì)胞毒劑的實(shí)例包括但不限定于蓖麻毒素、阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、足葉乙甙、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、二羥基炭疽菌素二酮(Dihydroxy anthracin dione)、放線菌素D、白喉毒素、Epothilones、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、糖皮質(zhì)激素和其他的化療藥物、以及放射性同位素。用抗體與一種具有所需的抗腫瘤細(xì)胞學(xué)活性的合適的細(xì)胞因子、化學(xué)因子、干擾素、或生長(zhǎng)因子的遺傳的或化學(xué)的融合都可以生成細(xì)胞毒的或抗增殖的靶向的融合蛋白(Asgeirsdottir etal.，Biochem.Pharmacol.151729-1739，2003)。合適的可檢測(cè)的標(biāo)記物包括但不限定于放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。用于免疫治療或用于用作為可檢測(cè)的標(biāo)記物的合適的放射性同位素包括下面的同位素銻-124、銻-125、砷-74、鋇-103、鋇-140、鈹-7、鉍-j206、鉍-207、鎘-109、鎘-115m、鈣-45、鈰-139、鈰-141、鈰-144、銫-137、鉻-51、鈷-56、鈷-57、鈷-58、鈷-60、鈷-64、鉺-169、銪-152、釓-153、金-195、金-199、鉿-175、鉿-181、銦-111、碘-123、碘-131、銥-192、鐵-55、鐵-59、氪-85、鉛-210、镥-177、錳-54、汞-197、汞-203、鉬-99、釹-147、镎-237、鎳-63，鈮-95、鋨-185+191、鈀-103、鉑-195m、鐠-143、钷-147、鏷-233、鐳-2226、錸-186、銣-86、釕-103、釕-106、鈧-44、鈧-46、硒-75、銀-110m、銀-11、鈉-22、鍶-85、鍶-89、鍶-90、硫-35、鉭-182、锝-99m、碲-125、碲-132、鉈-170、鉈-204、釷-228、釷-232、錫-113、鈦-44、鎢-185、釩-48、釩-49、鐿-169、釔-88、釔-90、鋅-65、和鋯-95。
利用一種螯合劑完成對(duì)抗體的放射性標(biāo)記，螯合劑與抗體共價(jià)連接，在螯合劑內(nèi)插入有放射性核素。優(yōu)選的螯合劑可見于Srivagtava et al.Nucl.Med.Bio.18589-603，1991和McMurry et al.，J.Med.Chem.413546-3549，1998.或來源于H.Chong，K.et al.，J.Med.Chem.453458-3464，2002所發(fā)表的所謂的NOTA螯合劑，在此將其全部?jī)?nèi)容一同并入?yún)⒖肌Ｌ貏e優(yōu)選地用于放射性同位素與RG1抗體結(jié)合的螯合劑是雙功能螯合劑p-SCN-Benzyl-DTPA(Brechbiel et al.Inorg.Chem.252772-2781，1986)的衍生物，例如，環(huán)己基-DTPA(CHX-A″-DTPA，Wu et al.，Bioorg.Med.Chem.101925-1934，1997)和MX-DTPA(1B4M-DTPA，McMurry et al.，J.Med.Chem.，413546-3549，1998)，以及1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′″-三乙酸(NOTA)(Chong et al.J.Med.Chem.453458-3464，2002)。用Nikula et al.Nucl.Med.Biol.3387-390，1995的方法可以完成結(jié)合。特別優(yōu)選的用作為用于免疫閃爍法的可檢測(cè)的標(biāo)記物是放射性同位素111In或99mTc。用于正電子發(fā)射斷層的優(yōu)選的可檢測(cè)的標(biāo)記物是43Sc、44Sc、52Fe、55Co、68Ga、64Cu、86Y和94mTc。對(duì)于免疫治療，可以使用發(fā)射β射線的放射性同位素46Sc、47Sc、48Sc、72Ga、73Ga、90Y、67Cu、109Pd、111Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、和188Re，以及發(fā)射α射線的放射性同位素211At、211Bi、212Bi、213Bi和214Bi。優(yōu)選的是90Y、177Lu、72Ga、153Sm、67Cu和212Bi，特別優(yōu)選的是90Y和177Lu。
前列腺癌和其他癌癥的免疫治療本發(fā)明提供了各種用于治療前列腺癌和其他癌癥的免疫治療的方法，包括抗體治療、體內(nèi)疫苗和離體免疫治療方法。其他癌癥包括腎癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。在一種方法中，本發(fā)明提供了可被全身使用以治療前列腺癌的RG1抗體。例如，可以將未結(jié)合的RG1抗體引入到患者體內(nèi)，使得抗體與前列腺癌細(xì)胞上、內(nèi)或與之相關(guān)的RG1結(jié)合，并介導(dǎo)細(xì)胞和腫瘤的破壞，作用機(jī)理可以包括補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解、抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性、變更RG1的生理功能、和/或抑制配體結(jié)合或信號(hào)傳導(dǎo)途徑。如上所述的，也可以治療性地使用與細(xì)胞毒劑例如蓖麻毒素或放射性同位素結(jié)合的RG1抗體，以將細(xì)胞毒劑直接轉(zhuǎn)運(yùn)到帶有RG1的前列腺腫瘤細(xì)胞，并據(jù)此破壞腫瘤細(xì)胞。
利用RG1抗體的前列腺癌免疫治療可以遵循從已經(jīng)被成功地應(yīng)用于其他類型癌癥的各種方法中所生成的教訓(xùn)，其他類型的癌癥包括但不限定于結(jié)腸癌(Arlen et al.，Crit.Rev.Immunol.18133-138，1998)、多發(fā)性骨髓瘤(Ozaki et al.，Blood 903179-3186，1997；Tsunenari et al.，Blood 902437-2444，1997)、胃癌(Kasprzyk et al，Cancer Res.522771-2776，1992)、B細(xì)胞淋巴瘤(Funakoshi et al.，Immunther.Emphasis Tumor lmmunol.1993-101，1996)、白血病(Zhong et al.，Leuk.Res.20581-589，1996)、結(jié)直腸癌(Moun et al.，Cancer Res.546160-6166，1994；Velders et al.，CancerRes.554398-4403，1995)、和乳腺癌(Shepard et al.，J.Clin.Immunol.11117-127，1991)。
本發(fā)明還提供了配制成的含有RG1多肽或其片段的疫苗。腫瘤抗原在抗癌癥治療中所用的用于產(chǎn)生體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的疫苗中的用途在本領(lǐng)域是熟知的，并且利用人的PSMA和嚙齒類動(dòng)物的PAP免疫原的腫瘤抗原已經(jīng)被應(yīng)用于前列腺癌(Hodge et al.，Int.J.Cancer 63231-237，1995；Fong et al.，J.Immunol.1593113-3117，1997)。通過采用RG1多肽、或其片段、或編碼RG1的核酸分子以及能表達(dá)并合適地呈遞RG1免疫原的重組載體可以容易地實(shí)踐這些方法。
例如，可以用病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)編碼RG1的核酸分子。在本發(fā)明的這個(gè)部分的實(shí)踐中可以使用的各種病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括，但不限定于牛痘、禽痘、金絲雀痘、腺病毒、流感病毒、骨髓灰質(zhì)炎病毒、腺伴隨病毒、慢病毒、和新培斯病毒(Restifo，in Curr.Opin，Immunol.8658-663，1996)。利用將編碼RG1多肽或其片段的裸DNA引入到患者體內(nèi)(即經(jīng)肌肉內(nèi)注射)以誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答，也可以使用非病毒的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以采用全長(zhǎng)的人rg1 cDNA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以采用人rg1 cDNA的片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以采用編碼特異的T淋巴細(xì)胞(CTL)表位的rg1核酸分子。用特異的算法(例如Epimer，布朗大學(xué))可以確定CTL表位，以鑒定出在RG1多肽內(nèi)能與特異的HLA等位基因最佳結(jié)合的肽。
也可以采用各種離體策略。一種方法包含用樹突狀細(xì)胞呈遞作為人免疫系統(tǒng)的抗原的RG1多肽的用途。樹突狀細(xì)胞表達(dá)I型和II型MHC、B7輔助刺激因子、和IL-12，因此它是非常專門的抗原呈遞細(xì)胞。在前列腺癌中，用前列腺特異性膜抗原(PSMA)肽致敏的自體樹突狀細(xì)胞正被用于I期臨床試驗(yàn)，以刺激前列腺癌患者的免疫系統(tǒng)(Tjoa et al.，Prostate 2865-69，1996；Murphy et al.，Prostate 29371-380，1996)?？梢杂脴渫粻罴?xì)胞給具有I型和II型MHC分子的T細(xì)胞呈遞RG1多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，用能與MHC分子結(jié)合的RG1多肽致敏自體樹突狀細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用完整RG1多肽致敏樹突狀細(xì)胞。仍是另一個(gè)實(shí)施方式包含利用本領(lǐng)域已知的各種加工載體的遺傳加工使得rg1基因在樹突狀細(xì)胞內(nèi)的過度表達(dá)，這些加工載體例如是腺病毒(Arthur et al.，Cancer Gene Ther.417-25，1997)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(Henderson et al.，CancerRes.563763-3770，1996)、慢病毒、腺伴隨病毒、DNA轉(zhuǎn)染(Ribas et al.，Cancer Res.572865-2869，1997)、和腫瘤來源的RNA轉(zhuǎn)染(Ashley et al.，J.Exp.Med.1861177-1182，1997)。
在抗癌癥治療中，抗獨(dú)特型抗RG1抗體也可被用作為一種用于誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)RG1多肽的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的疫苗。具體地，抗獨(dú)特型抗體的生成在本領(lǐng)域是熟知的，并且它可以被容易地適用于生成模擬RG1多肽上的一個(gè)表位的抗獨(dú)特型抗RG1抗體(見，例如，Wagner et al.，Hybridoma1633-40，1997；Foon et al.，J.Clin.Invest.96334-342，1995；Herlyn et al.，Cancer Immunol Immunother 4365-76，1996)。如當(dāng)前其他的定向于腫瘤抗原的抗獨(dú)特型抗體所實(shí)踐的那樣，這樣一種抗獨(dú)特型抗體可被用于抗獨(dú)特型治療。
可以采用遺傳免疫接種方法生成定向于表達(dá)RG1的癌癥細(xì)胞的預(yù)防性或治療性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。利用在此所述的編碼RG1的DNA分子，可以將包括編碼RG1多肽/免疫原以及合適的調(diào)節(jié)序列的構(gòu)建體直接注射到個(gè)體的肌肉或皮膚內(nèi)，這樣肌肉或皮膚的細(xì)胞可以攝取構(gòu)建體并表達(dá)所編碼的RG1多肽/免疫原。RG1多肽/免疫原可以被表達(dá)為細(xì)胞表面的多肽或被分泌。RG1多肽/免疫原的表達(dá)引起針對(duì)前列腺癌的預(yù)防性或治療性的體液和細(xì)胞免疫的生成。可以使用本領(lǐng)域已知的各種預(yù)防性和治療性的遺傳免疫接種法(其綜述，見在因特網(wǎng)網(wǎng)址www.genweb.Com中所發(fā)表的信息和參考文獻(xiàn))。
用于鑒定與RG1結(jié)合的試劑的檢測(cè)法本發(fā)明也涉及可被用于鑒定與RG1結(jié)合的試劑(即抗體、肽等)的檢測(cè)法和方法。具體地，通過RG1配體或其他試劑或成分與RG1結(jié)合的能力和/或抑制/刺激RG1活性的能力可以鑒定與RG1結(jié)合的試劑。
如上所述，用含有作為抗原區(qū)的肽免疫接種合適的哺乳動(dòng)物對(duì)象，得到抗體，預(yù)計(jì)RG1多肽的這些部分是抗體的靶點(diǎn)。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究中使用這些試劑以鑒定出第二代抑制試劑并阻斷RG1活性。
與RG1多肽結(jié)合的試劑例如RG1抗體可被用于調(diào)控RG1的活性，用于將抗腫瘤藥物靶向于合適的哺乳動(dòng)物，或用于鑒定阻斷與RG1相互作用的試劑。通過使用與RG1結(jié)合的試劑可以靶向于或鑒定表達(dá)RG1的細(xì)胞。
如何使用RG1結(jié)合試劑依賴于RG1結(jié)合試劑的性質(zhì)。例如，RG1結(jié)合試劑可被用于將結(jié)合的毒素例如白喉毒素、霍亂毒素、蓖麻毒素或假單胞菌外毒素轉(zhuǎn)運(yùn)給表達(dá)RG1的細(xì)胞；調(diào)控RG1活性；直接殺死表達(dá)RG1的細(xì)胞；或篩選鑒定出競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試劑。例如，RG1抑制試劑可被用于直接抑制表達(dá)RG1的細(xì)胞的生長(zhǎng)，而RG1結(jié)合試劑可被用作為診斷性試劑。
藥物組合物和給藥本發(fā)明也涉及藥物組合物，它可以包括單獨(dú)的rg1多核苷酸、RG1多肽、抗體、激動(dòng)劑、拮抗劑、或抑制劑、或組合有至少一種其他的試劑例如穩(wěn)定化合物，可以用任何無菌的、生物兼容的藥用載體施用藥物組合物，藥用載體包括但不限定于鹽水、緩沖鹽、葡萄糖、和水。在混和有賦形劑或藥用可接受載體的藥物組合物中，這些分子中的任何一種都可以被單獨(dú)地施用給患者，或聯(lián)合其他的試劑、藥物或激素一起施用給患者藥用可接受載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，藥用可接受載體是藥用的惰性物質(zhì)。
本發(fā)明也涉及藥物組合物的給藥?？诜蚰c外途徑實(shí)現(xiàn)這樣的給藥。腸外送藥的方法包括局部、動(dòng)脈內(nèi)(直接到腫瘤)、肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、或鼻內(nèi)給藥。除了活性成分以外，這些藥物組合物可以含有合適的藥用可接受載體，包括可促進(jìn)將活性化合物加工到制劑內(nèi)的可藥用使用的賦形劑和輔料。在最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co，Easton，Pa.)中可找到更多的關(guān)于劑型和給藥的技術(shù)的內(nèi)容。
利用本領(lǐng)域熟知的藥用可接受載體可以配制成適用于口服給藥的劑量的用于口服給藥的藥物組合物。這些載體能使得藥物組合物被制劑為能被患者消化的片劑、藥丸、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等。
通過活性化合物和固體賦形劑的組合可以得到用于口服使用的藥用制劑，在按需加入合適的輔料之后，任意地碾磨所形成的混和物和加工顆粒的混和物以得到片劑或錠劑核。合適的賦形劑是碳水化合物或蛋白填充劑例如糖包括乳糖、蔗糖、甘露糖、或山梨糖；來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯、或其他植物的淀粉；纖維素例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、或羧甲基纖維素鈉；以及樹膠包括阿拉伯樹膠和西黃蓍樹膠。如果需要，可以加入分解劑或增溶劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯酮、瓊脂、海藻糖、或其鹽，例如海藻酸鈉。
給錠劑核提供合適的涂層例如濃縮的糖溶液，它也可以包含阿拉伯樹膠、滑石粉。聚乙烯吡咯酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液、和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混和物?？梢越o片劑或錠劑涂層加上染料或色素，用于產(chǎn)品識(shí)別或描繪活性化合物的量即劑量。
可以口服使用的藥用劑型包括用凝膠制成的push-fit膠囊、以及用凝膠制成的軟的、密封的膠囊以及一種涂層例如甘油或山梨糖。Push-fit膠囊可以含有與填充劑或結(jié)合劑例如乳糖或淀粉、潤(rùn)滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂以及任意的穩(wěn)定劑混和的活性成分。在軟膠囊中，活性成分可以溶解或懸浮在合適的液體中，例如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二醇，有或沒有穩(wěn)定劑。
用于腸外給藥的藥用劑型包括活性化合物的水溶液。對(duì)于注射，本發(fā)明的藥物組合物可以制劑于水溶液中，優(yōu)選地是在生理兼容的緩沖液例如Hank溶液、Ringer溶液、或生理緩沖鹽水中。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液的粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的懸浮液可被制成為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油例如麻油、或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯、或脂質(zhì)體。任意地，懸浮液也可以含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解性的試劑，以容許制備高度濃縮的溶液。
對(duì)于局部或鼻部給藥，在制劑中使用了適用于所需穿透的特殊屏障的穿透劑。這些穿透劑在本領(lǐng)域通常是已知的。
試劑盒本發(fā)明還涉及藥用包裝和試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)裝滿前面所提及的本發(fā)明的組合物的一種或多種成分的容器。與這些容器在一起的可以是政府部門所給出的通知形式，它規(guī)定了藥用的或生物學(xué)的產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售，反映了施用給人的產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的部門的批準(zhǔn)。
生產(chǎn)和儲(chǔ)存可以以本領(lǐng)域已知的方式生產(chǎn)本發(fā)明的藥物組合物，例如通過傳統(tǒng)的混和、溶解、顆?；?、制錠、碾磨、乳化、包囊化、裝填或凍干過程的方式。
藥物組合物可以被提供為一種鹽，并且可以由多種酸形成，這些酸包括但不限定于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽在水或其他的質(zhì)子溶劑中可能具有更高的溶解性，其中它們是相應(yīng)的游離堿形式。在其他情況中，優(yōu)選的制劑可以是一種親脂性粉末，在使用之前將其與緩沖液聯(lián)合，其中該粉末含有1mM 50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露糖，pH范圍為4.5到5.5。
在已經(jīng)制備出制劑于可藥用載體中的包括本發(fā)明的化合物的藥物組合物之后，將它們放置在合適的容器中，并被標(biāo)記為用于所適用病變的治療。對(duì)于施用RG1，這些標(biāo)記將包括施用的量、頻率和方法。
治療有效劑量適用于本發(fā)明的藥物組合物包括組合物，其中含有實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的即治療以RG1表達(dá)為特征的特殊的疾病狀態(tài)的有效量的活性成分。對(duì)有效劑量的確定是在本領(lǐng)域人員的能力范圍之內(nèi)。
對(duì)于任何化合物，最初可以在細(xì)胞培養(yǎng)物檢測(cè)中例如腫瘤細(xì)胞或可以在動(dòng)物模型通常是小鼠、兔、狗或豬中估計(jì)出治療有效劑量。也可用動(dòng)物模型得到所需的濃度范圍和給藥途徑。然后可以用這些信息確定出施用給人的劑量和途徑。
治療有效劑量指的是緩解癥狀或狀況的蛋白或其抗體、拮抗劑、或抑制劑的量。用細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法可以確定出這些化合物的治療療效和毒性，例如ED50(在人群的50％中治療有效的劑量)和LD50(使得人群的50％致死的劑量)。治療和毒性作用之間的劑量比值是治療指數(shù)，它可被表示為比值ED50/LD50。表現(xiàn)出較大的治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。從細(xì)胞培養(yǎng)物檢測(cè)和動(dòng)物研究中得到的數(shù)據(jù)可用于制定出人類應(yīng)用的劑量范圍。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選地是處于包括ED50且具有很小的或沒有毒性的循環(huán)濃度的范圍之內(nèi)。在這個(gè)范圍內(nèi)的劑量的不同依賴于所采用的劑量形式、患者的嚴(yán)重程度、和給藥途徑。
每個(gè)醫(yī)生都結(jié)合所治療的患者的情況選擇實(shí)際的劑量。調(diào)整劑量和給藥方式以提供活性部分的有效水平或保持所需的作用?？梢员豢紤]到的其他因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度例如腫瘤大小和位置；患者的年齡、體重和性別；飲食、給藥的時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)的敏感性、和對(duì)治療的耐受性/反應(yīng)性。根據(jù)特殊制劑的半衰期和清除率，可以每3到4天、每周、或每?jī)芍芤淮问┯瞄L(zhǎng)時(shí)間作用的藥物組合物。
根據(jù)給藥的途徑，正常劑量的量可以從0.1到100,000微克不等，最高到約1g的總劑量。在文獻(xiàn)中提供了特殊劑量的指導(dǎo)和給藥方法，見美國(guó)專利Nos.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。本領(lǐng)域人員將采用與蛋白或其抑制劑有所不同的多核苷酸的劑型。相似地，多核苷酸或多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)將特異于特殊的細(xì)胞、狀況、位置等。放射性標(biāo)記的抗體的優(yōu)選的比活性的范圍可以從0.1到10mCi/mg蛋白(Riva et al.，Clin.Cancer Res.53275s-3280s，1999；Wong et al.，Clin.Cancer Res.63855-3863，2000；Wagner et al.，J.Nuclear Med.43267-272，2002)。
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步地描述了本發(fā)明。所提供的實(shí)施例只被用于參照具體實(shí)施方式
來說明本發(fā)明。這些實(shí)例雖然舉例說明了本發(fā)明的某些特異的部分，但是它并沒有限制或限定所闡述的發(fā)明的范圍。
除非有不同的詳細(xì)說明，都用本領(lǐng)域人員熟知的和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施所有的實(shí)施例?？梢匀缭跇?biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中所述的那樣實(shí)施下面實(shí)施例的常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，例如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989。
實(shí)施例1人rg1多核苷酸的鑒定通過查詢Incyte′s LifeSeq數(shù)據(jù)庫(kù)將rg1鑒定為一種在前列腺中表達(dá)的基因。利用Incyte提供的用于搜索數(shù)據(jù)庫(kù)的目的的“Protein Fuction”工具，通過對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋搜索，鑒定出其核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)核苷酸序列是在經(jīng)注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)的細(xì)胞粘附分子的分類中，并被描繪為f-spondin的同源物。對(duì)rg1多核苷酸序列在數(shù)據(jù)庫(kù)的一組文庫(kù)中的分布的電子Northem分析發(fā)現(xiàn)rg1在前列腺文庫(kù)中是高水平表達(dá)的，而在大量的其他組織文庫(kù)中是較低水平表達(dá)的，包括來自正常和腫瘤組織的組織文庫(kù)。
在將一組數(shù)據(jù)庫(kù)中的rg1克隆裝配成連續(xù)的多核苷酸序列之后，編輯連續(xù)序列，在預(yù)先裝配的多核苷酸中鑒定出全長(zhǎng)的編碼序列。該序列編碼與f-spondin和與Mindin-2同源的蛋白。從用于實(shí)驗(yàn)研究的Incyte中得到Incyte克隆1640796、1712252、和1880265，以及克隆3360733被鑒定為含有最5’端的核苷酸序列。將這個(gè)克隆完全測(cè)序，它含有完全的所預(yù)計(jì)的RG1蛋白的編碼序列。在SEQ ID NO1中顯示了該序列。
實(shí)施例2Rg1mRNA表達(dá)利用Taqman檢測(cè)法(Perkin-Elmer)，用半定量PCR確定出rg1 mRNA在各種來自正常和腫瘤組織的樣本中以及在細(xì)胞株中的表達(dá)。根據(jù)從斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院泌尿外科得到的改良的Gleason分級(jí)系統(tǒng)，已經(jīng)將前列腺正常、良性和腫瘤組織樣本分級(jí)。用標(biāo)準(zhǔn)方法從這些組織樣本中分離到RNA。來自其他腫瘤和正常組織的RNA購(gòu)自商業(yè)化來源，包括Clonetech和Biochain。前列腺腫瘤細(xì)胞株(PC3、LNCaP和DU145)來自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，并利用含血清的培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)方法將其培養(yǎng)繁殖。在裸鼠中建立起來源于這些細(xì)胞株的異種移植的腫瘤，并在植入近4-6周后，從小鼠中收集這些腫瘤。用標(biāo)準(zhǔn)方法從腫瘤中分離到RNA。
用引物CGC GCA TAG CTC CGA CTA C(SEQD NO3)和GCCGCG TCC GCA AAG(SEQ ID NO4)和Taqman探針6-FAM-AGGAAGAAC CAG TAC GTC AGTAAC GGG CTG-Tamra(SEQ ID NO5)進(jìn)行基于Taqman的PCR分析。
用Perkin Elmer的引物表達(dá)軟件設(shè)計(jì)并用Synthetic Genetics合成這些引物和探針。用前列腺RNA進(jìn)行PCR反應(yīng)30-40個(gè)循環(huán)，并將其定量以生成用于相互比較的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)分析證實(shí)在前列腺中檢測(cè)到最高豐度的rg1 mRNA，以及在一些其他組織中檢測(cè)到顯著更低水平的rg1mRNA。
實(shí)施例3在BHK細(xì)胞中的RG1的生產(chǎn)克隆從Incyte質(zhì)粒3360733中得到RG1編碼區(qū)。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)PCR擴(kuò)增編碼序列中，引物為SST115(5′-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3′)(SEQ ID NO6)和SST113(5′-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3′)(SEQ ID NO7)，PCR反應(yīng)使用了1×Pfu Turbo聚合酶緩沖液(Stratagene，LaJolla，CA)/200μM各種dNTP/0.2U Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)。PCR擴(kuò)增條件如下95℃下3分鐘，(95℃下15秒，60℃下30秒，72℃下2分鐘)×35，72℃下7分鐘。用QIAquick PCR柱(Qiagen，Valencia，CA)純化所形成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用XbaI和PmII限制性內(nèi)切酶消化得到1010bp的片段，利用BIO101 GeneClean試劑盒(Vista，CA)將該片段從1％瓊糖脂凝膠中純化出來。將所純化的片段連接到(利用Epicientre Fast Link試劑盒，(Epicenter，Madison，WI))經(jīng)XbaI和PmII消化的非細(xì)胞致病的Sindbis表達(dá)載體中(Agapov et al，1998，PNAS 9512989-12994)，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)(Life Technologies，Gaithersburg，CA)以及在含有氨芐西林(100μg/ml)的LB瓊脂平板上進(jìn)行選擇。在含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出氨芐西林耐藥性克隆，經(jīng)序列分析顯示它含有所插入的RG1編碼序列。這個(gè)質(zhì)粒被命名為pPEG6。
表達(dá)根據(jù)產(chǎn)品說明書，利用Lipofectamine Plus試劑(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)用兩微克pPEG6轉(zhuǎn)染1-3×105個(gè)牛倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞(BHK細(xì)胞)。在轉(zhuǎn)染之后，將細(xì)胞在加有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中孵育24-48個(gè)小時(shí)，此時(shí)將細(xì)胞從1份分為10份，并通過加入嘌呤霉素(終濃度2.5μg/ml)和含有血清的DMEM開始選擇含有質(zhì)粒的細(xì)胞。在細(xì)胞匯合之后(加入博來霉素4-5天后)，用PBS洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞從1份分為10份，加入含血清的DMEM和5μg/ml嘌呤霉素。在2-3天之后，用沒有血清的DMEM和5μg/ml嘌呤霉素置換培養(yǎng)基，再生長(zhǎng)2-3天，用使用RG1抗體的Western分析檢測(cè)在培養(yǎng)基中是否存在RG1蛋白?？蓹z測(cè)到1μg/ml水平的RG1蛋白。
純化將被轉(zhuǎn)染為穩(wěn)定地過度表達(dá)并分泌RG1蛋白到培養(yǎng)基內(nèi)的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)培養(yǎng)在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中。當(dāng)在次融合時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)換到無血清的培養(yǎng)基中24-48個(gè)小時(shí)。收集培養(yǎng)基，離心去除細(xì)胞并儲(chǔ)存在-80℃。在純化之前將培養(yǎng)基迅速融化并保存在冰中。加入蛋白酶抑制劑，并用冷的20mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.5)將培養(yǎng)基稀釋10倍，在整個(gè)純化過程中都要保持在4℃。以0.5ml/min的流速將所稀釋的樣本裝柱到Q-Sepharose陰離子交換柱中，然后用相同的緩沖液沖洗。在收集成分的同時(shí)，用線性NaCl梯度(0-80％1M NaCl的緩沖液溶液，每分鐘0.5％)進(jìn)行洗脫。用SDS PAGE和Western印跡法確定出所洗脫的RG1在接近75mM的NaCl中。匯總含有RG1的部分，用超濾法濃縮，并在Superdex75凝膠過濾柱中進(jìn)一步純化。將所純化的BHK-RG1用作生成特異于天然的RG1(nRG1)蛋白的人單克隆抗體的免疫原，以及用作為篩選和描繪這些抗體的抗原。
實(shí)施例4抗體的生成多克隆抗體形成了抗來源于RG1蛋白序列的5種合成的多肽序列的兔多克隆抗血清。選擇這些序列是因?yàn)樗鼈冊(cè)诘鞍妆砻娴念A(yù)期位點(diǎn)，使得生成更可能識(shí)別表面表位的抗血清。用氨基丁酸(Abu)置換半胱氨酸殘基，這有助于合成。下面列出了五種肽的特異的氨基酸序列、在RG1蛋白上的位點(diǎn)以及命名。

肽經(jīng)附加的羧基末端的半胱氨酸與鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)共價(jià)結(jié)合，并被用作為一種免疫原。相似地，制備牛血清白蛋白(BSA)綴合物，用于經(jīng)ELISA分析抗血清的滴度。
用每種肽免疫都接種兩只動(dòng)物。在弗氏完全佐劑(0.5mg/動(dòng)物)中進(jìn)行最初的免疫接種，隨后在3周的間隔內(nèi)用肌肉內(nèi)應(yīng)用的0.25mg/動(dòng)物的弗氏不完全佐劑強(qiáng)化。抽取定期測(cè)試的血樣，并用ELISA測(cè)定抗特異的BSA-肽綴合物的抗體滴度，并與免疫接種前的血清進(jìn)行比較?？闺?C和3C的抗血清表現(xiàn)出是有活性的?？闺?C的抗血清不能識(shí)別RG1多肽。沒有測(cè)試抗肽4C和5C的抗血清。
單克隆抗體通過用RG1肽和在大腸桿菌中所表達(dá)的6-組氨酸標(biāo)記的RG1融合蛋白免疫轉(zhuǎn)基因小鼠生成了抗RG1的單克隆抗體。用骨髓瘤細(xì)胞融合這些動(dòng)物的脾細(xì)胞生成了雜交瘤細(xì)胞。用ELISA篩選所形成的雜交瘤，篩選出產(chǎn)生針對(duì)RG1肽和蛋白的抗體的雜交瘤。
通過對(duì)含有斷裂的小鼠重鏈和小鼠κ輕鏈位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫接種也能制備出具有對(duì)天然RG1的特異性的人單克隆抗體(美國(guó)專利No.5,877,397)。用在穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞株中所產(chǎn)的純化RG1蛋白免疫來自C57BL/6J近交系(Medarex)的轉(zhuǎn)基因小鼠(見實(shí)施例3)。
將抗原與弗氏完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5881)混和用于方案1中的第一次和第二次的免疫接種，在此之后將抗原與弗氏不完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5506)混和。對(duì)于第二種方案，弗氏完全佐劑被用于第一次免疫接種，在此之后使用弗氏不完全佐劑。通過使用乳化針頭，每只小鼠都接受了100μLPBS中的與佐劑按1∶1混和的25μg天然RG1(nRG1)。將0.2mL所制備的抗原注射到小鼠的腹腔內(nèi)。
雜交瘤制備將P3×63ag8.653骨髓瘤細(xì)胞株(ATCC CRL1580，lotF-15183)用于融合。融化原始的ATCC瓶，并培養(yǎng)增殖細(xì)胞。從該次增殖中制備出冷凍瓶的種子儲(chǔ)存物。將細(xì)胞保持培養(yǎng)3-6個(gè)月，每周分瓶?jī)纱?。將來自P388D1(ATCC，TIB-63FL)的上清液用作為用于雜交瘤的條件培養(yǎng)基。簡(jiǎn)單地，細(xì)胞生長(zhǎng)并增殖到200ml。靜止培養(yǎng)物生長(zhǎng)～7天。倒出已耗竭的上清液，并將其過濾通過0.2μm無菌濾器。使用該細(xì)胞株3-6個(gè)月，然后融化一個(gè)新瓶的細(xì)胞。
含有5％FBS(Hyclone，#AKE11828)的DMEM(Cellgro#10013271、10013270)和P/S(Celigro#，30002029)被用于培養(yǎng)骨髓瘤和P388D1細(xì)胞。將其他的培養(yǎng)基添加物加入到雜交瘤生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，它們包括5％Origen-Hybridoma克隆因子(IGEN#，36684、36908)、5％P388D1條件培養(yǎng)基(11/15/00、12/21/00DH)、10％FCS(Hyclone，#AKE11828)、β巰基乙醇(Gibco#1076640)、Genetacin(Gibco#1079874)、Hepes(Cellgro-#25060041)和HAT(Sigma，H 0262；1.0×10-4M次黃嘌呤、4.0×107M氨基嘌呤、1.6×10-5M胸腺嘧啶核苷)、或HT(Sigma，H0137；1.0×10-4M次黃嘌呤、1.6×10-5M胸腺嘧啶核苷)。
利用PEG和標(biāo)準(zhǔn)方法將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。將所形成的雜交瘤平鋪到50個(gè)96孔板內(nèi)，每孔種植200μL用于第一次融合。在融合后10-12天時(shí)進(jìn)行對(duì)人IgG、κ抗體的最初的ELISA篩選。然后用6-His捕獲ELISA篩選人IgG、κ陽性孔。該篩選導(dǎo)致從3種融合種分離到8種人抗體三種IgM、一種IgG3、和四種IgG1亞型抗體。
首先將來自具有抗原結(jié)合性抗體的孔中的雜交瘤轉(zhuǎn)移到24孔板中，再次重新篩選特異性。用限制性稀釋亞克隆天然的RG1特異性雜交瘤，以保證單克隆性。通過將細(xì)胞冷凍在IGEN冷凍培養(yǎng)基中，保存在發(fā)育過程的一些階段上的與天然RG1(nRG1)結(jié)合的產(chǎn)抗體的雜交瘤。冷凍來自這些細(xì)胞株的培養(yǎng)基并用于如下面所述的抗體的純化。確定出8種抗體的4種具有能保證進(jìn)一步研究的足夠多的特異性的抗體。
抗體的純化利用蛋白G瓊脂糖親和層析法從細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化出如上所述的四種抗RG1的人單克隆抗體。用離心和過濾去除培養(yǎng)基的細(xì)胞。將培養(yǎng)基流經(jīng)蛋白G柱。然后將柱在PBS中洗滌以去除未綴合的物質(zhì)。用100mM甘氨酸(pH 2.5)洗脫所綴合的抗體，并往洗脫部分中加入10％v/v 1M Tris(pH 8)進(jìn)行快速中和。匯集含有抗體的洗脫部分，經(jīng)PBS透析，用SDS PAGE測(cè)試純度，并用ELISA檢測(cè)抗原結(jié)合活性。
抗體的篩選利用一些不同的檢測(cè)方法進(jìn)行抗體的篩選
A.hIgGγκELISA篩選用1μg/ml抗人IgGκ或抗人IgGκ的PBS溶液(50μl/孔)包被96孔微量滴定板(Falcon，#3912)過夜。抽吸板，并用含有5％小雞血清的0.05％Tween20 PBS溶液在室溫下封閉板(100μl/孔)，然后用PBS-tween洗滌三次。將用于篩選的雜交瘤上清液按1∶2稀釋于封閉緩沖液中，并在室溫下孵育1個(gè)小時(shí)(100μl/孔)。在孵育之后，在加入100μl/孔的第二抗體(HRP抗人IgG Fc(Jackson，#109-036-098)或HRP抗人IgGκ(Sigma，#A-7164))之前，將板在封閉緩沖液中洗滌三次。在室溫下孵育第二抗體1個(gè)小時(shí)，然后將板在封閉緩沖液中洗滌2次。用10ml含有80μl ABTS(Sigma，#A1888)、8μl H2O2/板的檸檬酸磷酸緩沖液(pH 4.0)將板顯像，并在A415-490nm下進(jìn)行讀數(shù)。
B.RG1結(jié)合ELISA用0.5-1μg/ml純化天然RG1蛋白的PBS溶液(50μl/孔)在4℃下包被96孔微量滴定板過夜。抽吸板，然后加入100μl/孔PBS-Tween+5％小雞血清封閉反應(yīng)，隨后在室溫下孵育1個(gè)小時(shí)。然后將板在封閉緩沖液中洗滌3次。然后以50μl/孔往每個(gè)孔內(nèi)加入系列稀釋的樣本(血清、雜交瘤上清液、純化單克隆抗體等)，在室溫下孵育1個(gè)小時(shí)，然后在封閉緩沖液中洗滌3次。然后用HRP抗人IgG Fc第二抗體的封閉緩沖液溶液在室溫下孵育孔1個(gè)小時(shí)，然后如前洗滌3次。用上述的底物將板顯像，并用96孔板讀板器測(cè)定A405nm。
C.捕獲ELISA方法為了確定單克隆抗體與天然構(gòu)象的RG1蛋白的結(jié)合，使用了捕獲ELISA格式。在BHK細(xì)胞中表達(dá)含有6個(gè)組氨酸表達(dá)標(biāo)記的RG1蛋白(6His-RG1)，并將其用作為抗原。依照標(biāo)準(zhǔn)方法利用NiNTA瓊脂糖親和層析法從條件培養(yǎng)基中純化出6His-RG1。
用1.5μg/ml濃度的純化6His-RG1的PBS加上0.2％BSA溶液(PBS/BSA，100μl/孔)在4℃下過夜將純化6His-RG1捕獲于96孔NiNTA板之上(QiagenNiNTA HisSorb)。用含有0.05％Tween20的PBS(PBST)洗滌板3次。用PBS/BSA稀釋樣本(雜交瘤上清液、血清、純化單克隆抗體等)，并將樣本在板中室溫下孵育1-2個(gè)小時(shí)(50μl/孔)，然后用PBST洗滌3次。將第二抗體(HRP標(biāo)記的山羊抗人IgGFc)在PBS/BSA中稀釋到1∶5000，以50μl/孔加入到板中，并在室溫下孵育1個(gè)小時(shí)。
用PBST洗滌板3次，并如在ELISA中的那樣顯像。用ELISA板讀板器測(cè)定在405nm中的吸光度。
D.BIAcore表面等離子共振(SPR)檢測(cè)法利用SPR進(jìn)一步篩選親代雜交瘤上清液，使得通過親和力將克隆定性分級(jí)。利用標(biāo)準(zhǔn)的胺結(jié)合和60μg/ml抗體的乙酸溶液(pH 4.0)以及經(jīng)HEPES緩沖的鹽水(HBS)的流動(dòng)相將兔抗人IgGFc(Pierce，31142)固定到感受器芯片上(Biacore，BR-1000-12)。雜交瘤培養(yǎng)基以5μl/min的速度流經(jīng)表面，使得抗體被捕獲到表面上，然后用HBS洗滌到基線水平。然后將純化的、天然的BHK-RG1蛋白(400nM)流經(jīng)表面并用SPR測(cè)定結(jié)合力。在注射結(jié)束之后，將HBS流經(jīng)表面以測(cè)定抗體RG1復(fù)合物的解離。SPR測(cè)定值對(duì)時(shí)間的斜率是解離速度的指示，斜率越大，解離速度越快，因此抗體的親和力就越低。
實(shí)施例5抗體的Western印跡法分析用Western印跡測(cè)試抗血清對(duì)RG1的特異性。在COS細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的RG1上、LNCaP細(xì)胞分泌的天然RG1上和從所轉(zhuǎn)染的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)生成的RG1上測(cè)試RG1特異性的抗血清(上面的那些所生成的抗序列1C和3C的抗血清)。在從LNCaP腫瘤、LNCaP細(xì)胞、PC3腫瘤、PC3細(xì)胞和一些人前列腺腫瘤的臨床樣本中制備的裂解液中進(jìn)一步測(cè)試RG1特異性抗血清。將細(xì)胞和組織裂解在去污劑緩沖液中。在煮沸5分鐘之后，將10μl每種裂解液裝入到12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以分離蛋白。然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過在存在同源和異源肽時(shí)的結(jié)合驗(yàn)證RG1抗體的結(jié)合特異性。RG1特異性抗血清可以檢測(cè)出在除PC-3細(xì)胞和PC-3腫瘤以外的所有樣本中的蛋白。
對(duì)特異于天然RG1的人單克隆抗體的Western印跡法分析證實(shí)這些抗體只在非還原的條件下才能識(shí)別印跡中的RG1。這說明這些單克隆抗體與RG1的更天然的形式結(jié)合。
實(shí)施例6對(duì)LNCaP細(xì)胞分泌的天然RG1蛋白的純化通過Western印跡法分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)生長(zhǎng)的LNCaP細(xì)胞能分泌天然RG1蛋白。為了純化天然蛋白，將細(xì)胞在缺乏血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48個(gè)小時(shí)。收集這個(gè)無血清的條件培養(yǎng)基，離心去除所有細(xì)胞，超濾濃縮近50倍。然后用20mM乙酸鈉緩沖液(pH 6.5)將所濃縮的培養(yǎng)基稀釋10倍，并將其裝入到Q-瓊脂糖陰離子交換柱中。柱洗脫液由氯化鈉梯度(每分鐘0.5％)構(gòu)成，收集2.0ml級(jí)份。如Western印跡和SDS PAGE所確定的那樣，洗脫的RG1蛋白是在近75mM NaCl水平。天然RG1蛋白以比在細(xì)菌中所表達(dá)的6組氨酸-RG1融合蛋白稍微更小的分子量移動(dòng)，可能是因?yàn)樗鄙偃诤想摹?br> 實(shí)施例7對(duì)前列腺和前列腺癌轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的RG1的免疫組化染色用LifeSpan Biosciences，Inc.確定出RG1蛋白在各種人體組織中的表達(dá)，包括腎臟、肺、胰腺、肌肉、腦和前列腺、以及淋巴結(jié)和骨轉(zhuǎn)移灶。附加的前列腺組織來自斯坦福大學(xué)斯坦福學(xué)院的泌尿外科，并在Berlex進(jìn)行測(cè)試。利用標(biāo)準(zhǔn)方法將組織切片脫蠟。用多克隆抗體RG1-3C作為第一抗體，以及檢測(cè)系統(tǒng)由使用載體ABC-AP試劑盒(AK5002)和載體紅色底物試劑盒(SK5002)所構(gòu)成。作為陰性對(duì)照，在缺少第一抗體時(shí)進(jìn)行染色。
檢查了RG1在來自一些患者的前列腺腫瘤和正常前列腺組織中的表達(dá)。在所有病例中，在前列腺腫瘤樣本中都看到了代表RG-1表達(dá)的強(qiáng)染色。正常前列腺組織中的RG-1表達(dá)有所不同，從幾乎沒有直至明顯染色。
也用免疫組化在已知含有前列腺腫瘤轉(zhuǎn)移灶的淋巴結(jié)和骨骼樣本中檢測(cè)RG1的表達(dá)。正常的淋巴結(jié)或骨骼都沒有顯示出染色。
實(shí)施例8RG1抗體的測(cè)序用標(biāo)準(zhǔn)方法確定如在上述的實(shí)施例4中所生成并純化的兩種人RG1抗體(C和B)的核酸序列。B的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列被命名為SEQID NO20以及B的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列被命名為SEQ ID NO21。C的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列被命名為SEQ ID NO23以及C的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列被命名為SEQ ID NO24。
確定出這些鏈的可變區(qū)的相應(yīng)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，并將其命名為SEQ ID NO26(B的輕鏈)；SEQ ID NO27(B的重鏈)；SEQ ID N029(C的輕鏈)；SEQ ID NO30(C重鏈)。見圖3和4。
實(shí)施列9RG1抗體的結(jié)合常數(shù)的確定用BIAcore確定出單克隆抗體與天然RG1蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(KD、Ka和Kd)，其中利用了一種捕獲格式，其中可溶性的天然RG1蛋白與固定在感受器芯片上的單克隆抗體結(jié)合。利用標(biāo)準(zhǔn)的胺結(jié)合方法將免疫純的兔抗人IgGFc(Pierce，31142)共價(jià)地固定到感受器芯片CM5(Biacore，BR-1000-12)上。按5μl/min的速度使用稀釋在10mm乙酸(pH4.0)中的100μg/ml抗體。HBS-EP(Biacore，BR-1001-88)被用作為流動(dòng)相。用乙醇胺封閉未反應(yīng)的位點(diǎn)。用HBS將單克隆抗體稀釋到200nM，每個(gè)循環(huán)以10μl/min的速度注射50μl。BHK-RG1的系列稀釋物(12.5-400nM)與固定的單克隆抗體結(jié)合。在完成20μl/min共8分鐘的抗原注射之后，馬上測(cè)定解離動(dòng)力學(xué)。在每個(gè)循環(huán)之后，用25μl 10mm甘氨酸(pH 1.8)再生表面，然后用HBS洗滌。
通常地，進(jìn)行5種濃度和培養(yǎng)基對(duì)照的測(cè)試。利用產(chǎn)品產(chǎn)家所提供的軟件(BIAevaluation 3.0)將數(shù)據(jù)安裝到1∶1 Langmuir模型中，計(jì)算出動(dòng)力學(xué)常數(shù)。平衡常數(shù)是在納摩爾范圍內(nèi)，具有較好的解離速率(10-4s-1)。表1顯示了4種人抗體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
表1人RG-1抗體A、B、C和D的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。通過將從BIAcore研究中所得到的數(shù)據(jù)安裝到1∶1 Langmuir模型中確定出這些抗體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。Ka結(jié)合速率(1/s)；Kd解離速率(1/s)；KD親和力(M)。

實(shí)施例10對(duì)RG1抗體的放射性標(biāo)記螯合劑與RG1抗體的結(jié)合利用采用自Nikula et al，Nucl.Med.Biol.，Vol.22，No.3，pp.387-390，1995的方法將雙功能的螯合劑p-SCN-Benzyl-DTPA(Macrocyclics，Inc.)共價(jià)地連接到抗體上。在使用之前，要使得本過程中所用的所有試劑和設(shè)備都沒有金屬，以避免螯合劑的失活。用低金屬試劑、高純度(MilliQ)水和經(jīng)處理去除了微量金屬的Chelex制備所有的溶液。用10mM EDTA沖洗所有的設(shè)備，然后用MilliQ水充分沖洗。
在利用AKTA層析系統(tǒng)上的Pharmacia 26/10脫鹽柱將緩沖液更換為50mM碳酸鹽緩沖液、150mM NaCl(pH 8.5)之前，首先用1mM EDTA在室溫下處理純化的單克隆抗體(-20mg)1個(gè)小時(shí)，以去除所有的金屬。匯集含抗體的部分并用超濾(Centricon 30)將其濃縮到近2mg/ml。在無水DMSO中新鮮制備100mg/ml p-SCN-Benzyl-DTPA儲(chǔ)存液。將50-100倍摩爾過量的DTPA用于結(jié)合反應(yīng)，容許該反應(yīng)在室溫下進(jìn)行過夜。然后反應(yīng)混和物被緩沖液更換為50mM乙酸鈉、150mM NaCl(pH 6.5)(放射性標(biāo)記緩沖液)，并經(jīng)超濾濃縮到至少3mg/ml。該緩沖液中的抗體綴合物在4℃下可穩(wěn)定數(shù)周。用BCA確定蛋白濃度，并用ELISA驗(yàn)證抗原結(jié)合活性。
RG1抗體的放射性標(biāo)記用90Y或111In在無金屬的條件下放射性標(biāo)記DTPA綴合的抗體，以用于帶瘤動(dòng)物的體內(nèi)研究。通常地，將10mg抗體綴合物與10mCi[90Y]Cl3或[111In]Cl3(PerkinElmer Life Sciences)在室溫下混和1個(gè)小時(shí)，在厚厚的屏護(hù)后面將其輕輕地混和。將EDTA加到1mM，并在室溫下孵育10分鐘。然后將反應(yīng)混和物在已在無金屬的PBS中預(yù)平衡的Pharmacia 26/10脫鹽柱中跑柱，以將放射性標(biāo)記的抗體與未結(jié)合的90Y分離，并更換緩沖液。收集1ml成分，并匯集含抗體的部分。用BCA確定蛋白濃度。利用針對(duì)90Y的液相閃爍計(jì)數(shù)儀和針對(duì)111In的γ計(jì)數(shù)儀確定出1μl樣本中的總放射性。
比活性被計(jì)算為每mg蛋白的mCi，通常是在0.25到1.0mCi/mg的范圍內(nèi)。根據(jù)Nikula et al，Nucl.Med.Biol.22387-390，1995用瞬時(shí)薄層色譜法(ITLC)確定出放射學(xué)純度。通常的，大于98％的放射性與蛋白相關(guān)。用ELISA確定出放射性綴合物對(duì)未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)抗體的抗原結(jié)合活性(90Y綴合物)，或利用對(duì)固定的RG1蛋白的固相放射免疫結(jié)合檢測(cè)確定出放射性綴合物對(duì)未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)抗體的抗原結(jié)合活性(111In綴合物)。在所有情況中，放射性綴合物與未結(jié)合抗體的抗原結(jié)合力沒有區(qū)別。
實(shí)施例11111In標(biāo)記的RG1抗體的腫瘤特異性蓄積通過給5-6周大的雄性無胸腺裸鼠的側(cè)腹部皮下注射1×10-7個(gè)基質(zhì)膠中的LNCaP細(xì)胞建立腫瘤異種移植物。當(dāng)腫瘤達(dá)到150-400mm3體積時(shí)(腫瘤細(xì)胞移植后近4-6周)，進(jìn)行生物分布研究。給四組12只帶有LNCaP異種移植物的小鼠靜脈內(nèi)施用111In標(biāo)記的人RG1抗體(C、B、A)和非特異性人IgG1對(duì)照抗體(比活性，0.3mCi/mg)。在切除腫瘤之前，經(jīng)心臟穿刺將小鼠放血。去除血液、腫瘤和所有的主要器官，在分析天平上稱重，并在γ計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)放射性。通過累計(jì)在血液、單個(gè)器官和剩余尸體中所測(cè)定到的放射性確定全身清除率。所有數(shù)據(jù)都進(jìn)行放射性同位素衰減的糾正。結(jié)果表示為每克組織的注射劑量的百分比。RG1特異性抗體顯示出高度的腫瘤特異性蓄積(見圖1)。
實(shí)施例1290Y標(biāo)記的RG1抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制通過給5-6周大的雄性無胸腺小鼠的側(cè)腹部皮下注射1×10-7個(gè)基質(zhì)膠中的LNCaP細(xì)胞建立腫瘤異種移植物。當(dāng)腫瘤達(dá)到50-350mm3體積時(shí)(腫瘤細(xì)胞植入后5周)，開始治療。將帶瘤動(dòng)物平等地分配到四個(gè)治療組(n＝13/組)。給帶LNCaP異種移植物的小鼠單次腹腔內(nèi)注射施用放射性標(biāo)記的抗體B、C和非特異性IgG1(125μCi/動(dòng)物)。第四個(gè)治療組給予腹腔內(nèi)注射鹽水。在注射后32天內(nèi)，監(jiān)測(cè)90Y標(biāo)記的RG1特異性抗體對(duì)LNCaP來源的腫瘤的生長(zhǎng)的作用。同時(shí)，殺死動(dòng)物和取出并稱量腫瘤。通過監(jiān)測(cè)體重確定健康狀況。當(dāng)與在90Y標(biāo)記的非特異性抗體或載體對(duì)照所注射的動(dòng)物中看到的結(jié)果比較時(shí)，90Y標(biāo)記的特異性人RG1抗體的單次給藥產(chǎn)生了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制(見圖2)。
實(shí)施例13RG1抗體在CHO細(xì)胞內(nèi)的克隆和表達(dá)誘變進(jìn)行對(duì)編碼抗RG1抗體B和C的可變區(qū)的野生型cDNA的定向誘變，生成在人體內(nèi)更常被表達(dá)的同種異型體。用QuickChang多點(diǎn)定向誘變方法(Stratagene)進(jìn)行誘變，用TOPO/BVH和TOPO/CVH(Medarex)作為模板。用引物(GGGGAGGCTTGGTACAACCTGGGGGGTCCCTGAG；SEQ ID NO14)和(GAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAG；SEQ ID NO15)把點(diǎn)突變H13Q、M90T和M92V引入到B cDNA內(nèi)(BVH_3m)，以及把H13Q、M90T引入到C cDNA內(nèi)(CVH_2m)。用DNA序列分析確認(rèn)突變，突變分別造成了具有序列SEQ ID NO22和SEQ ID NO25的突變的重鏈可變區(qū)。SEQID NO28和SEQ ID NO31分別給出了這兩種重鏈可變區(qū)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。
表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體pIE_SRγ1fa(Medarex)含有分別編碼人IgG1(fa單倍體)和κ鏈的CH和CL區(qū)的cDNA。為了容許將C和B輕鏈可變區(qū)克隆到pIE_SRγ1fa的框架內(nèi)，用引物對(duì)BVKF(GGGAAGCTTGCCACCATGGAAACCCCAGCG；SEQ ID NO16)和BVKR(CAGTCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCC；SEQ ID NO17)分別往BVL和CVL cDNA的5’和3’末端引入相互兼容的HindIII/Bsiw位點(diǎn)(下劃線部分)。將所形成的PCR生成的VL cDNA克隆到pIE_SRγ1fa的HindIII/Bsiw位點(diǎn)以形成pIE/BVL和CVL。用相同的策略構(gòu)建出將VH(包括BVH、BVH_3m、CVH和CVH_2m)融合到pIE/BVL和CVL的框架內(nèi)。簡(jiǎn)單地，用引物對(duì)CVH_F(GTCAGGATGCGGCCGCCACCATGGAGTTTGTGCTGAGCT；SEQ ID NO18)和CVH_R(ACCGATGGGCCCTTGGTGGA；SEQ ID NO19)將Notl/Apal位點(diǎn)引入到PCR擴(kuò)增的VH cDNA的末端。用Notl/Apal消化PCR產(chǎn)物，并將其插入到pIE/BVL和pIE/CVL的CH區(qū)的上游，保證相應(yīng)pIE衍生物中的VH區(qū)是在具有CH區(qū)的框架內(nèi)。最終的構(gòu)建體被命名為pIE/B、pIE/B_3m、pIE/C和pIE/C_2m。已經(jīng)用DNA序列分析驗(yàn)證了所有的插入。
DG44和DXB11細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和選擇/擴(kuò)增在轉(zhuǎn)染前1天，將加有F12培養(yǎng)基和5％FCS的約4×106個(gè)DG44和DXB11細(xì)胞平鋪在P100皿中。利用Lipfectamine 2000(hvitrogen)和24μg線性質(zhì)粒DNA(pIE/B_3m或pIE/C_2m)/P100進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后4個(gè)小時(shí)更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后應(yīng)用選擇條件近24個(gè)小時(shí)。
首先用含有5％經(jīng)透析的FBS、2Mm L-谷氨酰胺和G428(400μg/ml)，但缺乏核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行選擇。達(dá)到約90％細(xì)胞融合時(shí)，將細(xì)胞分成4×P100皿，并用加有不同濃度的甲氨蝶呤的G418進(jìn)行輔助選擇。在1周后，在存在輔助選擇培養(yǎng)基時(shí)，將存活細(xì)胞按100個(gè)細(xì)胞/板平鋪到96孔板內(nèi)。用測(cè)定重組抗體表達(dá)的ELISA篩選存活克隆。用存在漸增濃度的甲氨蝶呤時(shí)的連續(xù)選擇擴(kuò)增10個(gè)表現(xiàn)出最高表達(dá)水平的克隆的基因拷貝數(shù)目，所選的克隆適合于用于制備原始細(xì)胞庫(kù)的無血清培養(yǎng)基。
*****在此將在上面說明書中所提及的所有文獻(xiàn)和專利一同并入?yún)⒖肌ｋm然參照于本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域人員應(yīng)當(dāng)明白只要不脫離本發(fā)明的真實(shí)的精神和范圍都可以進(jìn)行各種改變以及可以取代等價(jià)物。另外，可以對(duì)本發(fā)明的目的、精神和范圍進(jìn)行修飾以適應(yīng)于特殊的情況、材料、物質(zhì)的組成、方法、方法步驟。所有的這些修飾都被認(rèn)為是在所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
序列表<110>舍林股份公司<120>RG1抗體及其用途<130>51791BWOM1<150>US 60/489,032<151>2003-07-22<160>31<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1785<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(296)..(1291)<223>
<400>1agaaaggggt gcggcagcac tgccagggga agagggtgat ccgacccggg gaaggtcgct60gggcagggcg agttgggaaa gcggcagccc ccgccgcccc cgcagcccct tctcctcctt120tctcccacgt cctatctgcc tctcgctgga ggccaggccg tgcagcatcg aagacaggag180gaactggagc ctcattggcc ggcccggggc gccggcctcg ggcttaaata ggagctccgg240gctctggctg ggacccgacc gctgccggcc gcgctcccgc tgctcctgcc gggtg atg 298Met1gaa aac ccc agc ccg gcc gcc gcc ctg ggc aag gcc ctc tgc gct ctc 346Glu Asn Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala Leu5 10 15ctc ctg gcc act ctc ggc gcc gcc ggc cag cct ctt ggg gga gag tcc 394Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Gln Pro Leu Gly Gly Glu Ser20 25 30atc tgt tcc gcc gga gcc ccg gcc aaa tac agc atc acc ttc acg ggc 442Ile Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr Ser Ile Thr Phe Thr Gly35 40 45aag tgg agc cag acg gcc ttc ccc aag cag tac ccc ctg ttc cgc ccc 490Lys Trp Ser Gln Thr Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Leu Phe Arg Pro50 55 60 65cct gcg cag tgg tct tcg ctg ctg ggg gcc gcg cat agc tcc gac tac 538Pro Ala Gln Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp Tyr70 75 80agc atg tgg agg aag aac cag tac gtc agt aac ggg ctg cgc gac ttt 586Ser Met Trp Arg Lys Asn Gln Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp Phe85 90 95gcg gag cgc ggc gag gcc tgg gcg ctg atg aag gag atc gag gcg gcg 634Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu Ile Glu Ala Ala
100 105 110ggg gag gcg ctg cag agc gtg cac gcg gtg ttt tcg gcg ccc gcc gtc682Gly Glu Ala Leu Gln Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val115 120 125ccc agc ggc acc ggg cag acg tcg gcg gag ctg gag gtg cag cgc agg730Pro Ser Gly Thr Gly Gln Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gln Arg Arg130 135 140 145cac tcg ctg gtc tcg ttt gtg gtg cgc atc gtg ccc agc ccc gac tgg778His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg Ile Val Pro Ser Pro Asp Trp150 155 160ttc gtg ggc gtg gac agc ctg gac ctg tgc gac ggg gac cgt tgg cgg826Phe Val Gly Val Asp Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp Arg165 170 175gaa cag gcg gcg ctg gac ctg tac ccc tac gac gcc ggg acg gac agc874Glu Gln Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp Ser180 185 190ggc ttc acc ttc tcc tcc ccc aac ttc gcc acc atc ccg cag gac acg922Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr Ile Pro Gln Asp Thr195 200 205gtg acc gag ata acg tcc tcc tct ccc agc cac ccg gcc aac tcc ttc970Val Thr Glu Ile Thr Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser Phe210 215 220 225tac tac cca cgg ctg aag gcc ctg cct ccc atc gcc agg gtg aca ctg1018Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ile Ala Arg Val Thr Leu230 235 240gtg cgg ctg cga cag agc ccc agg gcc ttc atc cct ccc gcc cca gtc1066Val Arg Leu Arg Gln Ser Pro Arg Ala Phe Ile Pro Pro Ala Pro Val245 250 255ctg ccc agc agg gac aat gag att gta gac agc gcc tca gtt cca gaa1114Leu Pro Ser Arg Asp Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu260 265 270acg ccg ctg gac tgc gag gtc tcc ctg tgg tcg tcc tgg gga ctg tgc1162Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys275 280 285gga ggc cac tgt ggg agg ctc ggg acc aag agc agg act cgc tac gtc1210Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val290 295 300 305cgg gtc cag ccc gcc aac aac ggg agc ccc tgc ccc gag ctc gaa gaa1258Arg Val Gln Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu310 315 320gag gct gag tgc gtc cct gat aac tgc gtc taa gaccagagcc ccgcagcccc 1311Glu Ala Glu Cys Val Pro Asp Asn Cys Val325 330tggggccccc cggagccatg gggtgtcggg ggctcctgtg caggctcatg ctgcaggcgg 1371ccgagggcac agggggtttc gcgctgctcc tgaccgcggt gaggccgcgc cgaccatctc 1431tgcactgaag ggccctctgg tggccggcac gggcattggg aaacagcctc ctcctttccc 1491aaccttgctt cttaggggcc cccgtgtccc gtctgctctc agcctcctcc tcctgcagga 1551
taaagtcatc cccaaggctc cagctactct aaattatgtc tccttataag ttattgctgc1611tccaggagat tgtccttcat cgtccagggg cctggctccc acgtggttgc agatacctca1671gacctggtgc tctaggctgt gctgagccca ctctcccgag ggcgcatcca agcgggggcc1731acttgagaag tgaataaatg gggcggtttc ggaagcgtca aaaaaaaaaa aaaa 1785<210>2<211>331<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Asn Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys Ala Leu Cys Ala1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gly Gln Pro Leu Gly Gly Glu20 25 30Ser Ile Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr Ser Ile Thr Phe Thr35 40 45Gly Lys Trp Ser Gln Thr Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Leu Phe Arg50 55 60Pro Pro Ala Gln Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp65 70 75 80Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gln Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp85 90 95Phe Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu Ile Glu Ala100 105 110Ala Gly Glu Ala Leu Gln Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala115 120 125Val Pro Ser Gly Thr Gly Gln Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val Gln Arg130 135 140Arg His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg Ile Val Pro Ser Pro Asp145 150 155 160Trp Phe Val Gly Val Asp Ser Leu Asp Leu Cys Asp Gly Asp Arg Trp165 170 175Arg Glu Gln Ala Ala Leu Asp Leu Tyr Pro Tyr Asp Ala Gly Thr Asp180 185 190
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr Ile Pro Gln Asp195 200 205Thr Val Thr Glu Ile Thr Ser Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser210 215 220Phe Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ile Ala Arg Val Thr225 230 235 240Leu Val Arg Leu Arg Gln Ser Pro Arg Ala Phe Ile Pro Pro Ala Pro245 250 255Val Leu Pro Ser Arg Asp Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro260 265 270Glu Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu275 280 285Cys Gly Gly His Cys Gly Arg Leu Gly Thr Lys Ser Arg Thr Arg Tyr290 295 300Val Arg Val Gln Pro Ala Asn Asn Gly Ser Pro Cys Pro Glu Leu Glu305 310 315 320Glu Glu Ala Glu Cys Val Pro Asp Asn Cys Val325 330<210>3<211>19<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>3cgcgcatagc tccgactac 19<210>4<211>15<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>4gccgcgtccg caaag 15<210>5<211>30<212>DNA<213>artificial sequence
<220>
<223>probe<400>5aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg 30<210>6<211>36<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>6tccctctaga gccaccatgg aaaaccccag cccggc 36<210>7<211>35<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer2<400>7aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg35<210>8<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Pro Leu Gly Gly Glu Ser Ile Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr1 5 10 15Ser Ile Thr<210>9<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gln Thr Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro1 5 10 15Leu Phe Arg
<210>10<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gln Tyr Val Ser1 5 10 15<210>11<211>23<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro His Phe Ala1 5 10 15Thr Ile Pro Gln Asp Thr Val20<210>12<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr1 5 10<210>13<211>330<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>13Met Glu Asn Val Ser Phe Ser Leu Asp Arg Thr Leu Trp Val Phe Leu1 5 10 15Leu Ala Met Leu Gly Ser Thr Ala Gly Gln Pro Leu Gly Gly Glu Ser20 25 30Val Cys Thr Ala Arg Pro Leu Ala Arg Tyr Ser Ile Thr Phe Thr Gly35 40 45Lys Trp Ser Gln Thr Ala Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Leu Phe Arg Pro50 55 60Pro Ala Gln Trp Ser Ser Leu Leu Gly Ala Ala His Ser Ser Asp Tyr65 70 75 80Ser Met Trp Arg Lys Asn Glu Tyr Val Ser Asn Gly Leu Arg Asp Phe
85 90 95Ala Glu Arg Gly Glu Ala Trp Ala Leu Met Lys Glu Ile Glu Ala Ala100 105 110Gly Glu Lys Leu Gln Ser Val His Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val115 120 125Pro Ser Gly Thr Gly Gln Thr Ser Ala Glu Leu Glu Val His Pro Arg130 135 140His Ser Leu Val Ser Phe Val Val Arg Ile Val Pro Ser Pro Asp Trp145 150 155 160Phe Val Gly Ile Asp Ser Leu Asp Leu Cys Glu Gly Gly Arg Trp Lys165 170 175Glu Gln Val Val Leu Asp Leu Tyr Pro His Asp Ala Gly Thr Asp Ser180 185 190Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala Thr Ile Pro Gln Asp Thr195 200 205Val Thr Glu Ile Thr Ala Ser Ser Pro Ser His Pro Ala Asn Ser Phe210 215 220Tyr Tyr Pro Arg Leu Lys Ser Leu Pro Pro Ile Ala Lys Val Thr Phe225 230 235 240Val Arg Leu Arg Gln Ser Pro Arg Ala Phe Ala Pro Pro Ser Leu Asp245 250 255Leu Ala Ser Arg Gly Asn Glu Ile Val Asp Ser Leu Ser Val Pro Glu260 265 270Thr Pro Leu Asp Cys Glu Val Ser Leu Trp Ser Ser Trp Gly Leu Cys275 280 285Gly Gly Pro Cys Gly Lys Leu Gly Ala Lys Ser Arg Thr Arg Tyr Val290 295 300Arg Val Gln Pro Ala Asn Asn Gly Thr Pro Cys Pro Glu Leu Glu Glu305 310 315 320Glu Ala Glu Cys Ala Pro Asp Asn Cys Val325 330<210>14<211>34
<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>14ggggaggctt ggtacaacct ggggggtccc tgag34<210>15<211>45<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>15gaacagcctg agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcaag 45<210>16<211>30<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>16gggaagcttg ccaccatgga aaccccagcg 30<210>17<211>30<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>17cagtcgtacg tttgatctcc accttggtcc 30<210>18<211>31<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>18gcggccgcca ccatggagtt tgtgctgagc t31<210>19<211>20
<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>19accgatgggc ccttggtgga 20<210>20<211>381<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga60gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc120ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa180cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca240gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag300cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatagta gctcgctcac tttcggcggg360gggaccaagg tggagatcaa a 381<210>21<211>441<212>DNA<213>Homo sapiens<400>21atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag60gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc120tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgttatgc actggcttcg ccaggctcca180ggaaaaggtc tggagtgggt atcagttatt ggtactggtg gtgtcacaca ctatgcagac240tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa300atgaacagcc tgagagccga ggacatggct atgtattact gtgcaagatg gggttactat360ggttcgggga gttatgagaa tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc420gtctcttcag cctccaccaa g 441<210>22<211>441<212>DNA<213>Homo sapiens<400>22atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag60
gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacaacctg gggggtccct gagactctcc120tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgttatgc actggcttcg ccaggctcca180ggaaaaggtc tggagtgggt atcagttatt ggtactggtg gtgtcacaca ctatgcagac240tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa300atgaacagcc tgagagccga ggacacggct gtgtattact gtgcaagatg gggttactat360ggttcgggga gttatgagaa tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc420gtctcttcag cctccaccaa g 441<210>23<211>381<212>DNA<213>Homo sapiens<400>23atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga60gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc120ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa180cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca240gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag300cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcactcac tttcggcgga360gggaccaagg tggagatcaa a 381<210>24<211>423<212>DNA<213>Homo sapiens<400>24atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag60gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc120tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgtcatgc actgggttcg ccaggctcca180ggaaaaggtc tggagtgggt atcagtaatt ggtactggtg gtgtcacaaa ctatgcagac240tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa300atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact gtgcaagatg gggggactgg360gatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc420aag 423<210>25<211>423<212>DNA
<213>Homo sapiens<400>25atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag60gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacaacctg gggggtccct gagactctcc120tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgtcatgc actgggttcg ccaggctcca180ggaaaaggtc tggagtgggt atcagtaatt ggtactggtg gtgtcacaaa ctatgcagac240tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa300atgaacagcc tgagagccga ggacacggct gtgtattact gtgcaagatg gggggactgg360gatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc420aag 423<210>26<211>127<212>PRT<213>Homo sapiens<400>26Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser20 25 30Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser35 40 45Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala50 55 60Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro65 70 75 80Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr100 105 110Ser Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125<210>27<211>147<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>27Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Met20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Val Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr His Tyr Ala Asp65 70 75 80Ser Val Lys Gly Arg Phe Met Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser85 90 95Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asn Asp115 120 125Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala130 135 140Ser Thr Lys145<210>28<211>147<212>PRT<213>Homo sapiens<400>28Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Val Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr His Tyr Ala Asp65 70 75 80Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser85 90 95Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asn Asp115 120 125Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala130 135 140Ser Thr Lys145<210>29<211>127<212>PRT<213>Homo sapiens<400>29Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser20 25 30Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser35 40 45Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala50 55 60Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro65 70 75 80Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr100 105 110Gly Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125<210>30<211>141
<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Met20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp65 70 75 80Ser Val Lys Gly Arg Phe Met Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser85 90 95Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly115 120 125Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140<210>31<211>141<212>PRT<213>Homo sapiens<400>31Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp
65 70 75 80Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser85 90 95Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly115 120 125Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140
權(quán)利要求
1.一種分離的人抗體、或其抗原結(jié)合性抗體片段、或其變體，其與RG1多肽中存在的表位特異性結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的抗體、或抗原結(jié)合性抗體片段，其中與其結(jié)合的所述RG1多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的抗體、或抗原結(jié)合性抗體片段，其中與RG1多肽結(jié)合的KD等于或小于1μM。
4.權(quán)利要求1的抗體、或抗原結(jié)合性抗體片段，其中與RG1多肽結(jié)合的KD等于或小于10nM。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO26或SEQ ID NO29具有至少80％序列相同性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30或SEQ IDNO31具有至少80％序列相同性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)由包括SEQ ID NO20或SEQ ID NO23的核苷酸序列編碼。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)由包括SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、或SEQ IDNO25的核苷酸序列編碼。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括具有SEQ ID NO26的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO27或SEQ ID NO28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
10.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包括具有SEQ ID NO29的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO30或SEQ ID NO31的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
11.權(quán)利要求9的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO27的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求9的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO28的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求10的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO30的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求10的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO31的氨基酸序列。
15.一種抗體，其識(shí)別并結(jié)合與權(quán)利要求9的抗體所結(jié)合的表位相同的表位。
16.一種抗體，其識(shí)別并結(jié)合與權(quán)利要求10的抗體所結(jié)合的表位相同的表位。
17.權(quán)利要求1的抗體片段，其中所述抗體片段選自由Fv片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、scFv片段、微抗體片段和微型雙功能抗體片段所構(gòu)成的組。
18.一種包括權(quán)利要求1的人單克隆抗體或抗體片段的免疫綴合物，其中所述抗體或抗體片段與一種分子綴合，所述分子為治療劑或可檢測(cè)的標(biāo)記物。
19.權(quán)利要求18的免疫綴合物，其中所述治療劑是一種細(xì)胞毒劑。
20.權(quán)利要求19的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞毒劑選自由蓖麻毒素、阿霉素、柔紅霉素、泰素TM(紫杉醇)、溴化乙錠、絲裂霉素、足葉乙甙、替尼泊苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、二羥基炭疽菌素二酮(Dihydroxy anthracin dione)、放線菌素D、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、糖皮質(zhì)激素和放射性同位素所構(gòu)成的組。
21.權(quán)利要求20的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞毒劑是一種放射性同位素，其選自由46Sc、47Sc、48Sc、72Ga、73Ga、90Y、67Cu、109Pd、11Ag、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、211Bi、212Bi、213Bi和214Bi構(gòu)成的組。
22.權(quán)利要求18的免疫綴合物，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是放射性標(biāo)記、酶、生色團(tuán)、或熒光劑。
23.權(quán)利要求22的免疫綴合物，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是放射性標(biāo)記，其選自由43Sc、44Sc、52Fe、55Co、68Ga、64Cu、86Y、94mTc、111In、和99mTc構(gòu)成的組。
24.權(quán)利要求18的免疫綴合物，其中所述抗體或抗體片段與所述治療劑或可檢測(cè)的標(biāo)記物的綴合利用一種螯合劑，所述螯合劑選自由p-SCN-芐基-DPTA和其衍生物、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)和其衍生物、以及1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)和其衍生物構(gòu)成的組。
25.權(quán)利要求24的免疫綴合物，其中所用的螯合劑是環(huán)己基-DTPA(CHX-A”-DTPA)或MX-DTPA(1B4M-DTPA)。
26.一種用于選擇性破壞一種表達(dá)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的人RG1多肽的細(xì)胞的方法，其包括將權(quán)利要求20的免疫綴合物與細(xì)胞反應(yīng)使得細(xì)胞被破壞。
27.一種用于治療人類患者的疾病狀態(tài)的方法，其中所述疾病狀態(tài)與具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的RG1多肽的表達(dá)相關(guān)，且其中所述方法包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求19的免疫綴合物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫綴合物的治療劑是90Y或177Lu。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病狀態(tài)是前列腺癌、腎癌、卵巢癌或結(jié)腸直腸癌。
30.一種用于檢測(cè)對(duì)象的疾病狀態(tài)的方法，其中所述疾病狀態(tài)與具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的RG1多肽的表達(dá)有關(guān)，且其中所述方法包括(a)給對(duì)象施用權(quán)利要求22的免疫綴合物；(b)檢測(cè)所述免疫綴合物在對(duì)象內(nèi)的結(jié)合；以及(c)確定與在無疾病的對(duì)照對(duì)象中檢測(cè)到的結(jié)合的水平相比，對(duì)象中的免疫綴合物的結(jié)合的水平是否升高。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述檢測(cè)的方法是免疫閃爍法。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫綴合物的可檢測(cè)的標(biāo)記物是111In或99mTc。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述檢測(cè)的方法是正電子發(fā)射斷層。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述免疫綴合物的可檢測(cè)的標(biāo)記物選自由43Sc、44Sc、52Fe、55Co、68Ga、64Cu、86Y或94mTc構(gòu)成的組。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述疾病狀態(tài)是癌癥。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)RG1多肽的抗體、和抗原結(jié)合性抗體片段。本發(fā)明還涉及將抗體、和抗體片段用于診斷性和治療性應(yīng)用的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1826138SQ200480021178
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日
發(fā)明者理查德·哈金斯, 德博拉·帕克斯, 戈登·帕里, 雷娜特·帕里, 道格拉斯·施奈德 申請(qǐng)人:舍林股份公司