專利名稱：粗毛韌革菌菌絲體多糖的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說本發(fā)明涉及通過粗毛韌革菌培養(yǎng)生產(chǎn)粗毛韌革菌菌絲體多糖的方法，由該方法獲得的粗毛韌革菌菌絲體多糖，以及含有該多糖的藥物組合物和/或保健品。所述的粗毛韌革菌菌絲體多糖具有預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物，特別是其具有降低血糖和血脂功效，使其為降低血糖和血脂提供理想藥物。
背景技術(shù)：
糖尿病是目前中老年人的常見病和多發(fā)病，由糖尿病引起的并發(fā)癥嚴(yán)重危及人類的生命健康?，F(xiàn)有西藥類降糖藥物難免有副作用，而天然中藥類降糖藥物大多數(shù)降糖不明顯，同時(shí)受物種資源的限制。而以藥用真菌液體培養(yǎng)生產(chǎn)降糖藥物則沒有上述缺點(diǎn)。粗毛韌革菌，是金耳的寄生菌，與金耳菌種共同形成金耳子實(shí)體，生長(zhǎng)于海拔1900-3300米的櫟樹和樺樹樹干上。民間對(duì)金耳的認(rèn)識(shí)和藥用有著非常悠久的歷史，早在明朝時(shí)期，著名的藥物學(xué)家李時(shí)珍在他的《本草綱目》中詳細(xì)記載金耳。如“其金色者(當(dāng)指金耳)治癖飲積聚，服痛金蒼”。另外，《中國(guó)藥用真菌》、《中國(guó)中藥大典宗旨》、《云南食用菌》對(duì)金耳的藥用價(jià)值均有詳細(xì)介紹。金耳性溫寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，調(diào)氣，平陰陽；臨床上治神經(jīng)衰弱，肺熱，哮喘，慢性支氣管炎，高血壓，肝炎等疾病。近代科學(xué)研究證明金耳子實(shí)體用水煮成粘稠狀后加白糖，制成的制劑可以治療“肺熱”、感冒、咳嗽、哮喘和高血壓。近年來對(duì)金耳的研究表明其能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)。Kiho等發(fā)現(xiàn)腹腔注射金耳子實(shí)體水溶性多糖和醇溶多糖對(duì)正常小鼠，鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠以及基因缺陷型糖尿病小鼠均具降血糖作用。毛述永等發(fā)現(xiàn)口服云南金耳子實(shí)體水溶性多糖對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型大鼠具有顯著降血糖作用。目前由于對(duì)金耳野生資源的過度利用已經(jīng)對(duì)該資源形成了 很大的威脅。而傳統(tǒng)人工栽培方式周期長(zhǎng)，需要數(shù)月才能形成一代子實(shí)體。長(zhǎng)期的栽培過程造成了子實(shí)體成分特別是那些生物活性物質(zhì)不穩(wěn)定，使得從子實(shí)體中提取活性成分缺少商業(yè)可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種以粗毛韌革菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過液體深層培養(yǎng)、提取等步驟，制備粗毛韌革菌菌絲體多糖。本發(fā)明所使用的粗毛韌革菌為市售的任意一種粗毛韌革菌菌種。該菌屬于真菌門，傘菌綱，非裙菌目(也叫多孔菌目)，革菌科，學(xué)名Stereum hirsutum (Willd) Pers,又叫粗皮硬革菌、粗毛硬革菌。不形成或很難形成子實(shí)體，菌絲體遇氫氧化鉀溶液變暗或變黑。生殖菌絲疏松地交織在一起，分枝，有鎖狀聯(lián)合，近無色。本發(fā)明所述的粗毛韌革菌菌絲體多糖的制備方法，包括以粗毛韌革菌為黑發(fā)菌株，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、一級(jí)或多級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，離心、水洗和烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體，菌絲體通過水解、中和、超濾、濃縮和結(jié)晶步驟獲得菌絲體多糖；具體的，在本發(fā)明所述的搖瓶培養(yǎng)中，其搖瓶培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40,玉米粉5 25,蛋白胨I 20, KH2PO4I 6, MgSO4I 4,加水至適當(dāng)體積,起始PH值為5.0 8.0，培養(yǎng)條件是:裝液量為60 150mL/250mL，培養(yǎng)溫度22 30°C，轉(zhuǎn)速120 160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24 48小時(shí)；在本發(fā)明所述的一級(jí)或多級(jí)種子培養(yǎng)中，其種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40，玉米粉5 25，蛋白胨I 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，消泡劑
0.1 0.8，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;培養(yǎng)條件是:按種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3 lv/v/m，培養(yǎng)時(shí)間80 90小時(shí)；在本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20 80，玉米粉10 40，麩皮5 30，蛋白胨3 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，CaCO3O 10，消泡劑0.2 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;培養(yǎng)條件是:接種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.3 lv/v/m，培養(yǎng)時(shí)間120 180小時(shí)。

按照該發(fā)酵工藝，其中在進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)之前，首先將粗毛韌革菌的斜面菌種接入新配制的土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 248小時(shí)；其中所述的土豆培養(yǎng)基的組成可參見諸葛健和王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，1994:P367。由本發(fā)明的方法獲得的粗毛韌革菌菌絲體得率為2 30g/L發(fā)酵液。所述的菌絲體通過水解、中和、超濾、濃縮和結(jié)晶步驟制備菌絲體多糖的方法包括以下步驟:A.水解-在菌絲體中加入5 50倍I 4% NaOH溶液，80°C水解I 6小時(shí)，2500 4000rpm離心5 20分鐘，菌絲體用水洗滌2 3次，洗滌液并入水解液中；B.中和-合并后的水解液用鹽酸中和至pH6.0 8.5, 2500 4000rpm離心,取濾液；C超濾-用0.1微米的膜微濾，再用分子量5000 30000的膜超濾；D.濃縮-用酒精濃縮超濾液，使之沉淀；E.結(jié)晶-濾出濃縮沉淀物，用濃酒精洗滌后烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體多糖。按此工藝菌絲體多糖的得率為5 15g/100g菌絲體。本發(fā)明的又一目的是提供了所述粗皮韌革菌菌絲體多糖在藥物和保健品制備中的應(yīng)用。其中所述的藥品和保健品具有降低血糖血脂的功能。本發(fā)明的又一目的是提供了用本發(fā)明的方法制備得到的粗皮韌革菌菌絲體多糖在制備預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法所制備的粗皮韌革菌菌絲體多糖的降血糖降脂功能，可通過下面的藥劑實(shí)驗(yàn)證明:選取空腹小鼠，以無菌的pH4.6檸檬酸緩沖液配制4%的四氧嘧啶(alloxan)注射液，按體重160mg/kg劑量一次性腹腔注射造型，120小時(shí)后，選擇空腹血糖值大于13mmol/L的小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，組間差異小于0.5mmol/L,設(shè)陽性對(duì)照(I，生理鹽水);陽性藥物組(II，二甲雙胍，劑量120mg/kg體重)；給藥組(III，粗毛韌革菌菌絲體多糖，劑量100mg/kg體重)均采用口服給藥,每隔10天測(cè)定空腹血糖一次,實(shí)驗(yàn)時(shí)間30天,最后一天分析血漿總膽固醇機(jī)三磷酸甘油酯含量。
上述試驗(yàn)給藥IOd后，粗皮韌革菌菌絲體多糖組與對(duì)照組相比，血糖指標(biāo)均顯著降低(pH< 0.05)，給藥30天后，粗皮韌革菌菌絲體多糖組與對(duì)照組相比，血清總膽固醇、三磷酸甘油酯指標(biāo)均顯著降低(pH < 0.05)可見粗皮韌革菌菌絲體多糖IOd即能顯著降低高血糖小鼠血糖和30天即能降低血脂指標(biāo)。因此證實(shí)了粗皮韌革菌菌絲體多糖具有制備降血糖和血脂功能的保健品和/或藥品的用途。應(yīng)用本發(fā)明的粗毛韌革菌培養(yǎng)方法，可以大規(guī)?；蚬I(yè)化生產(chǎn)粗皮韌革菌菌絲體多糖和含有該混合物的藥物組合物。由于該藥物組合物中所含有的粗皮韌革菌菌絲體多糖來源于天然菌種的培養(yǎng)，因此沒有任何毒副作用，從而為糖尿病患者提供了理想的藥物，并為粗毛韌革菌的應(yīng)用開創(chuàng)了廣闊的前景，
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的材料及工藝，給出了下述的實(shí)施例。但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:粗毛韌革菌發(fā)酵液和菌絲體多糖的制備1、用新配置的土豆培養(yǎng)基(葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，1994:P367)斜面轉(zhuǎn)接粗毛韌革菌菌種，27 °C培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿斜面后，將斜面菌種接入裝有60mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶(共84瓶)，于22°C、90轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)24小時(shí)。其中所述搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨I ,KH2PO4I ,MgSO4I，起始pH值為5.0。2、將上述培養(yǎng)的菌種5000m L接入裝有45L種子培養(yǎng)基的75L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體積為50L ;維持罐溫22°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度90轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.3v/v/m，發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。其中種子罐中的種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH2PO4I, MgSO4I，消泡劑0.5，起始pH值為5.0。3、將50L種子罐菌種接入裝有600L發(fā)酵液培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的總體為650L ;維持罐溫22°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度90轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.3v/v/m，發(fā)酵時(shí)間150小時(shí)，其中發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉10，麩皮5，蛋白胨3，KH2PO4I, MgSO4I, CaCO3O，消泡劑0.5，起始pH值為5.0。經(jīng)上述步驟后得到粗毛韌革菌發(fā)酵液，經(jīng)過離心、水洗和80°C烘干，得到1.2Kg粗毛韌革菌菌絲體。4、粗毛韌革菌菌絲體加入5倍重量的4% NaOH溶液，80°C水解1.5小時(shí)，2500rpm離心20分鐘，菌絲體用水洗滌2 3次，洗滌液并入水解液中并用鹽酸中和至pH8.0,2500rpm離心，取濾液；濾液用0.1微米的膜微濾，再用分子量30000的膜超濾；超濾液濃縮，濃縮液用酒精沉淀，次日濾出濃縮沉淀物，用濃酒精洗滌后烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體多糖。菌絲體多糖的得率為5g/100g菌絲體。實(shí)驗(yàn)例2:粗毛韌革菌培養(yǎng)液和菌絲體多糖的制備1、用新配置的土豆培養(yǎng)基(諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，1994:P367)斜面轉(zhuǎn)接粗毛韌革菌菌種，培養(yǎng)溫度25°C，待菌絲體長(zhǎng)滿斜面后，將斜面菌種接入裝有90mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶(共40瓶)，25°C、120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)36小時(shí)。2、將上述培養(yǎng)的菌種4000mL接入裝有50L種子培養(yǎng)基的100L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體為54L ;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度120轉(zhuǎn)每分鐘，通風(fēng)量I: 0.5v/v/m，培養(yǎng)時(shí)間90小時(shí)。3、將30L種子罐菌種接入裝有300L發(fā)酵液培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中，發(fā)酵液的總體為350L ;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度120轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量I: 0.8v/v/m，發(fā)酵時(shí)間120小時(shí)，得到粗毛韌革菌培養(yǎng)液。上述步驟使用的各種培養(yǎng)基的配方如下:搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，起始 pH 值為 6.5。種子罐培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2PO43，MgS042，消泡劑0.1，起始pH值為6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖50，玉米粉25，麩皮20，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，CaCO31，消泡齊[J 0.1，起始 pH 值為 6.5。經(jīng)上述步驟后得到粗毛韌革菌發(fā)酵液，經(jīng)過離心、水洗和80°C烘干，得到12Kg粗毛韌革菌菌絲體。4、粗毛韌革菌菌絲體加入25倍2.5% NaOH溶液，80°C水解4小時(shí)，3000rpm離心10分鐘，菌絲體用水洗滌3次，洗滌液并入水解液中并用鹽酸中和至pH7.0，3000rpm離心，取濾液；濾液用0.1微米的膜微濾，再用分子量15000的膜超濾；超濾液濃縮，濃縮液用酒精沉淀，次日濾出濃縮沉淀物，用濃酒精洗滌后烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體多糖。菌絲體多糖的得率為15g/100g菌絲體。實(shí)施例3: 粗毛韌革菌發(fā)酵液和菌絲體多糖的制備1、用新配置的PDA培養(yǎng)基斜面(諸葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，1994:P367)轉(zhuǎn)接粗毛韌革菌菌種，培養(yǎng)溫度30°C，待菌絲體長(zhǎng)滿斜面后，將斜面菌種接入裝有150mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶(共10瓶)，30°C、150轉(zhuǎn)每分鐘搖床培養(yǎng)46小時(shí)。2、將此液體搖瓶培養(yǎng)的菌種3000mL接入裝有50L —級(jí)種子培養(yǎng)基的30L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體為31.5L ;維持罐溫30°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: lv/v/m,發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。3、將15L —級(jí)種子菌種接入裝有320L發(fā)酵液培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的總體為335L ;維持罐溫30°C，罐壓0.05MPa，攪拌速度150轉(zhuǎn)每分鐘，通風(fēng)量I: Olv/v/m，發(fā)酵時(shí)間180小時(shí)，得到粗毛韌革菌發(fā)酵液。上述步驟使用的各種培養(yǎng)基的配方如下:搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046，MgS044，起始 pH 值為 8.0。種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2PO46，MgS044，消泡劑0.8，起始pH值為8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖80，玉米粉40，麩皮30，蛋白胨10，KH2P046, MgS044, CaCO3IO,消泡劑 0.8，起始 pH 值為 8.0。經(jīng)上述步驟后得到粗毛韌革菌發(fā)酵液，經(jīng)過離心、水洗和80°C烘干，得到24Kg粗毛韌革菌菌絲體。4、粗毛韌革菌菌絲體加入50倍1% NaOH溶液，80°C水解6小時(shí)，3000rpm離心10分鐘，菌絲體用水洗滌2次，洗滌液并入水解液中并用鹽酸中和至pH8.5，3000rpm離心，取濾液；濾液用0.1微米的膜微濾，再用分子量5000的膜超濾；超濾液濃縮，濃縮液用酒精沉淀，次H濾出濃縮沉淀物，用濃酒精洗滌后烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體多糖。菌絲體多糖的得率為10g/100g菌絲體。實(shí)施例4:多糖含量的測(cè)定本發(fā)明所述的粗皮韌革菌菌絲體多糖測(cè)定方法硫酸蒽酮法，具體操作參見李合生主編的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》195 197頁。本發(fā)明所述的粗皮韌革菌菌絲體多糖組分分析方法為:稱取20mg多糖，加入4mol/L的硫酸于100°C水解8小時(shí)，加碳酸鋇中和水解物，離心取上清液，采用薄層層析技術(shù)，以葡萄糖、半乳糖，甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、鼠李唐和巖藻糖作為對(duì)照，展開劑為正丁醇:丙酮:水=4: 3: 1，硫酸蒽酮噴霧110°C烘烤顯色，結(jié)果證明粗皮韌革菌菌絲體多糖的單糖組成為葡萄糖、半乳糖，甘露糖、鼠李唐和巖藻糖。實(shí)施例5將實(shí)施例1、2和3所得的粗皮韌革菌菌絲體多糖，按公知的制片技術(shù)和裝備制成片劑。實(shí)施例6粗毛韌革菌菌絲體多糖降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖試驗(yàn)粗毛韌革菌菌絲體多糖按實(shí)施例1，2和3方法制取。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明小白鼠，雄性，體重為21 26g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供糖尿病小鼠模型制備；雄性小鼠禁食24小時(shí)后，腹腔注射160ug/kg四氧嘧啶造模型，5天后禁食3-5小時(shí),測(cè)血糖,血糖值> 13mmol/L為實(shí)驗(yàn)性糖尿病型鼠。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪蟀囱撬诫S機(jī)分組，分為一個(gè)模型對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)二甲雙胍組(作為對(duì)照)，每組12只小鼠，試驗(yàn)組分別給予按實(shí)施例2、3和4制得的菌絲體多糖(給藥劑量100mg/kg)和二甲雙胍組(給藥劑量100mg/kg)，各組按照要求劑量分別灌胃，對(duì)照組灌以自來水。連續(xù)給予受試物30天，每隔10天測(cè)空腹血糖，第30天測(cè)定血糖值的同時(shí)測(cè)定血脂值(測(cè)定均采用南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的血糖和血脂試劑盒)。結(jié)果顯示:采用三種實(shí)施例制得菌絲體多糖和二甲雙胍給藥后，三次測(cè)定血糖、磷酸甘油酯總膽固醇值的顯著低于對(duì)照組對(duì)應(yīng)的值(P < 0.05)(表I和2)，這顯示粗毛韌革菌菌絲體多糖具有降低血糖和血脂的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明三種實(shí)施例制得多糖均具有顯著的降低血糖和血脂作用，可以用于制備降血糖和降血脂的藥物與現(xiàn)有降血糖降血脂藥物的藥效比較實(shí)驗(yàn)可以表明，粗毛韌革菌菌絲體多糖藥效快，降血糖降血脂效果明顯。由于本身是一種純中藥制劑，并且原有“調(diào)氣、平時(shí)陽”等作用，因此粗毛韌革菌菌絲體多糖服用后有益無害。本發(fā)明不僅為深度開發(fā)利用粗毛韌革菌打開了一條嶄新的途徑，而且為降低血糖降血脂提供了新的理想中藥，將帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

表1.粗毛韌革菌菌絲體多糖對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖小鼠血糖水平的影響(mmol /I,)
權(quán)利要求
1.一種粗毛韌革菌菌絲體多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:以粗毛韌革菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、一級(jí)或多級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，離心、水洗和烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體，菌絲體通過水解、中和、超濾、濃縮和潔晶步驟獲得菌絲體多糖； 所述的搖瓶培養(yǎng)中，其搖瓶培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40，玉米粉5 25，蛋白胨I 20，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0，培養(yǎng)條件是:裝液量為60 150mL/250mL，培養(yǎng)溫度22 30°C，轉(zhuǎn)速120 160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24 48小時(shí)； 所述的一級(jí)或多級(jí)種子培養(yǎng)中，其種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5 40，玉米粉5 25，蛋白胨I 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，消治率0.2 0.8，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;培養(yǎng)條件是:接種量5 10 % (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3 lv/v/m，培養(yǎng)期間80 90小時(shí)； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20 80，玉米粉10 40，麩皮5 30，蛋白胨3 10，KH2PO4I 6，MgSO4I 4，CaCO3O 10，消泡劑0.2 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0 8.0 ;培養(yǎng)條件是:接種量5 10% (體積百分比)，培養(yǎng)溫度22 30°C，攪拌速率90 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3 lv/v/m培養(yǎng)時(shí)間120 180小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中在進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)之前，首先將粗毛韌革菌的斜面菌種接入新配制的土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 30°C，培養(yǎng)時(shí)間24 248小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 制備方法，其特征在于，所述的菌絲體通過水解、中和、超濾、濃縮和結(jié)晶步驟制備菌絲體多糖的方法包括以下步驟: A.水解:在菌絲體中加入5 50倍I 4%NaOH溶液，80°C水解I 6小時(shí)，2500 4000rpm離心5 20分鐘，菌絲體用水洗滌2 3次，洗滌液并入水解液中； B.中和:合并后的水解液用鹽酸中和至pH6.0 8.5,2500 4000rpm離心,取濾液； C超濾:用0.1微米的膜微濾，再用分子量5000 30000的膜超濾； D.濃縮:用酒精濃縮超濾液，使之沉淀； E.結(jié)晶:濾出濃縮沉淀物，用濃酒精洗滌后烘干，得到粗毛韌革菌菌絲體多糖。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的方法制備的粗皮韌革菌菌絲體多糖在藥物和保健品制備中的應(yīng)用，所述的藥物和保健品具有降低血糖血脂、預(yù)防和/或治療糖尿病的功能。
全文摘要
本發(fā)明公開了粗毛韌革菌菌絲體多糖的制備方法及其應(yīng)用，涉及生物發(fā)酵及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說本發(fā)明涉及通過粗毛韌革菌液體培養(yǎng)獲取菌絲體、提取菌絲體多糖生產(chǎn)工藝流程，以及該多糖的降血糖降血脂功效。本發(fā)明申請(qǐng)人經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的菌絲體多糖，經(jīng)腹腔注射途徑或口服途徑給藥，可顯著降低高血糖小鼠的血糖和血脂水平，因此證實(shí)粗毛韌革菌菌絲體多糖具有作為制備降低血糖和血脂藥物的用途。本發(fā)明不僅為深度開發(fā)利用粗毛韌革菌打開了一條嶄新的途徑，而且可以為降低血糖和降低血脂提供新的理想中藥。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103145865SQ20131006020
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者張志才, 王永生 申請(qǐng)人:北京綠科天成生物科技有限公司