本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種vzv抗原變體、核酸、藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella?zoster?virus,vzv)是皰疹病毒亞科，即人皰疹病毒3型，病毒顆粒150nm～200nm，是線性雙鏈dna病毒，病毒囊膜上鑲嵌有9種糖蛋白，分別為ge、gi、gc、gh、gl、gb、gk、gm和gn，其中g(shù)e是主要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒復(fù)制和組裝的關(guān)鍵蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)識別的最主要糖蛋白，也是疫苗設(shè)計的主要靶點蛋白。

2、vzv初次感染一般發(fā)生在幼兒期，以水痘為主要的臨床表現(xiàn)。病毒感染后會潛伏于人體神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元內(nèi)，呈隱匿性感染。當機體免疫力下降時，病毒會被再次激活并大量復(fù)制，在周圍感覺神經(jīng)以及該神經(jīng)所支配的單側(cè)皮節(jié)發(fā)生免疫反應(yīng)，引起以紅斑、簇集分布的水痘以及神經(jīng)痛為主要特征的帶狀皰疹。

3、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(postherpetic?neuralgia,phn)為帶狀皰疹的臨床癥狀中最復(fù)雜且最常見的一種不良并發(fā)癥，表現(xiàn)為燒灼樣疼痛或是電擊樣疼痛，部分患者還會出現(xiàn)瘙癢性疼痛，以持續(xù)性疼痛、跳痛為主，甚至還伴有痛覺過敏或是異常性疼痛，在身體、心理、功能和社交等方面嚴重影響患者的生活質(zhì)量。

4、帶狀皰疹的主要防治方式為疫苗主動預(yù)防，抗病毒藥物治療以及抗由并發(fā)癥引起的神經(jīng)痛治療。

5、帶狀皰疹發(fā)病率隨年齡增長而升高，并且逐漸趨于年輕化；神經(jīng)痛等并發(fā)癥，嚴重影響患者生活，但缺乏快速有效的治療方法，接種疫苗可以預(yù)防帶狀皰疹。綜合上述因素，帶狀皰疹疫苗的需求量也逐年增長。

6、目前，全球范圍內(nèi)僅有4款帶狀皰疹疫苗獲批上市，分別是默沙東的zostavax、sk化工株式會社的skyzoster、百克生物的感維和葛蘭素史克的shingrix。skyzoster僅在韓國銷售，市場占比約1.0％；感維2023年上市，僅在中國銷售；zostavax已經(jīng)停產(chǎn)；shingrix于2017年獲得fda批準上市，于2019年獲得國家藥監(jiān)局有條件批準，是國內(nèi)首個上市的帶狀皰疹疫苗，2020年6月在國內(nèi)正式上市銷售。據(jù)統(tǒng)計，shingrix市場占比幾乎為100％。zostavax和感維均為減毒活疫苗，前者適用人群為50歲及以上，保護率約為50％，接種一劑；后者適用人群為40歲及以上，也只需接種一劑。shingrix為重組蛋白苗，ge蛋白結(jié)合使用as01b佐劑，適用人群為60歲及以上，保護率為90％以上，需接種兩劑。

7、目前帶狀皰疹疫苗的研發(fā)技術(shù)路線多為減毒疫苗、蛋白重組疫苗、mrna疫苗以及腺病毒疫苗。減毒疫苗除了上述已上市產(chǎn)品，國內(nèi)也有多家公司進入了臨床階段，如萬泰生物的凍干帶狀皰疹疫苗(vzv-7d)和上海所的帶狀皰疹減毒活疫苗都已經(jīng)進入臨床ii期階段，長春祁健的帶狀皰疹減毒活疫苗已經(jīng)取得批件；重組苗除已上市的shingrix外，國內(nèi)的綠竹生物重組苗采用創(chuàng)新的四聚體分子結(jié)構(gòu)，進展較快，已進入臨床ii期階段；怡道生物的重組帶狀皰疹疫苗也已進入臨床ii期階段；mrna疫苗目前均處于研發(fā)階段，暫無上市產(chǎn)品；英國康希諾公司研制的黑猩猩腺病毒載體帶狀皰疹疫苗已進入臨床前階段。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)帶狀皰疹mrna疫苗產(chǎn)品的種類較少、免疫效果較差等技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種vzv抗原變體、核酸、藥物組合物及其應(yīng)用。所述vzv抗原變體可以誘導(dǎo)較高的免疫反應(yīng)，例如更強的t細胞免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)較強的細胞免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的細胞因子水平(例如tnf-α)，所述核酸可以實現(xiàn)較高的抗原表達量。

2、本發(fā)明提供的一個技術(shù)方案為：所述vzv抗原變體為與如seq?id?no:1所示的氨基酸序列相比具有y582g的差異；

3、和/或，所述vzv抗原變體為與如seq?id?no:1所示的氨基酸序列相比具有561-623位、569-623位或574-623位的缺失；

4、和/或，所述vzv抗原變體為與如seq?id?no:1所示的氨基酸序列相比具有蛋白跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的改造，所述蛋白跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的改造為將vzv抗原(例如野生型vzv抗原)的跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)替換為sars-cov-2spike蛋白的跨膜區(qū)或流感h蛋白的跨膜區(qū)。

5、本發(fā)明中，所述vzv抗原變體又表述為vzv抗原，除氨基酸序列限定為如seq?idno:1所示的野生型vzv抗原外。

6、本發(fā)明提供的一個技術(shù)方案為：一種vzv抗原，所述vzv抗原為在seq?id?no:1的基礎(chǔ)上將第582位的氨基酸殘基替換為g；

7、和/或，所述vzv抗原為在seq?id?no:1的基礎(chǔ)上缺失561-623位、569-623位或574-623位；

8、和/或，所述vzv抗原為在seq?id?no:1的基礎(chǔ)上進行了蛋白跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的改造，所述蛋白跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的改造為將野生型vzv抗原的跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)替換為sars-cov-2spike蛋白的跨膜區(qū)或流感h蛋白的跨膜區(qū)。

9、在一些較佳的實施例中，所述vzv抗原變體為與如seq?id?no:1所示的氨基酸序列相比還具有y569?a、s593a、s595a、t596a和t598a的差異中的一種或多種；優(yōu)選地，所述vzv抗原變體為與如seq?id?no:1所示的氨基酸序列相比還具有y569?a、s593?a、s595?a、t596a和t598a的差異；

10、和/或，所述蛋白跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的改造為將vzv抗原(例如野生型vzv抗原)的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)替換為sars-cov-2spike蛋白的跨膜區(qū)；所述vzv抗原的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為seq?id?no:1的第538-647位。

11、優(yōu)選地，所述vzv抗原為在seq?id?no:1的基礎(chǔ)上將第569位氨基酸殘基替換為a、將第593位氨基酸殘基替換為a、將第595位氨基酸殘基替換為a、將第596位氨基酸殘基替換為a和將第598位氨基酸殘基替換為a中的一種或多種；優(yōu)選地，所述vzv抗原為在seq?idno:1的基礎(chǔ)上還將第569位氨基酸殘基替換為a、將第593位氨基酸殘基替換為a、將第595位氨基酸殘基替換為a、將第596位氨基酸殘基替換為a和將第598位氨基酸殘基替換為a；

12、和/或，所述蛋白跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的改造為將野生型vzv抗原的跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)替換為sars-cov-2spike蛋白的跨膜區(qū)。

13、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述vzv抗原包含hibit-ha-tag，其序列例如seq?idno:37。

14、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述vzv抗原的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為seq?id?no:1的第538-647位。

15、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述sars-cov-2spike蛋白的跨膜區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:10所示。

16、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述流感h蛋白的跨膜區(qū)的氨基酸序列如seq?idno:11所示。

17、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述vzv抗原的氨基酸序列包含如seq?id?no:2-9中任一所示的氨基酸序列。

18、本發(fā)明中，大寫字母為單字母表示的氨基酸，其含義為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明中，數(shù)字代表氨基酸缺失或替換前在氨基酸序列中的位置，數(shù)字前的單個大寫字母通常代表該位置缺失或替換前的氨基酸，數(shù)字后的單個大寫字母通常代表該位置替換后的氨基酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)vzvge抗原氨基酸序列容易地推知該數(shù)字在如vzvge抗原氨基酸序列中代表的位置。

19、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案為：一種分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼如本發(fā)明所述的vzv抗原的核苷酸序列。

20、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述分離的核酸為mrna。優(yōu)選地，所述mrna包含cap1、5’utr和3’utr-polya中的一個或多個。

21、在本發(fā)明一具體實施方案中，所述編碼所述vzv抗原的核苷酸序列包括如seq?idno:15-25、27-36中任一所示的核苷酸序列。

22、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案為：一種表達元件，所述表達元件包含出發(fā)質(zhì)粒和如本發(fā)明所述的分離的核酸。

23、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述出發(fā)質(zhì)粒為pcdna3.1。

24、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案為：一種制備如本發(fā)明所述的分離的核酸的方法，所述方法為將如本發(fā)明所述的表達元件進行體外轉(zhuǎn)錄。所述體外轉(zhuǎn)錄為本領(lǐng)域常規(guī)的體外轉(zhuǎn)錄。

25、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案為：一種藥物組合物，所述藥物組合物包括如本發(fā)明所述的vzv抗原、如本發(fā)明所述的分離的核酸或表達元件，以及脂質(zhì)。

26、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述脂質(zhì)為由可電離脂質(zhì)化合物、dspc(二硬脂酰基磷脂酰膽堿)、膽固醇和dmg-peg2000(二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000)構(gòu)成的組合物。優(yōu)選地，可電離脂質(zhì)化合物、dspc、膽固醇和dmg-peg2000的比例為50:10:38.5:1.5。

27、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述組合物按照如下步驟制備：

28、將螢火蟲熒光素酶(fluc)mrna在50mm檸檬酸鹽緩沖液(ph?4.0)中稀釋得到mrna溶液。通過使用微流控裝置(例如nanoassemblr(廠家：precision?nanosystems)微流體混合系統(tǒng))以流速12ml/min、體積比1：3混合脂質(zhì)的乙醇溶液和mrna溶液，以可電離脂質(zhì)與mrna的氮磷比為3～15：1制備脂質(zhì)納米顆粒。經(jīng)0.01m的磷酸鹽緩沖液(pbs)透析12-24h除去乙醇。最后，脂質(zhì)納米顆粒溶液通過0.22μm無菌過濾器過濾，并經(jīng)超濾濃縮(amicon-ultra，mwco?10kda)得到使用可電離脂質(zhì)/dspc/膽固醇/dmg?peg2000包封fluc?mrna的lnp制劑。

29、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述藥物組合物包括如seq?id?no:5或seq?id?no:8所示的氨基酸序列和脂質(zhì)包括lq104或e16b2。

30、在本發(fā)明一較佳實施方案中，所述藥物組合物為疫苗制劑。優(yōu)選地，所述疫苗制劑還包括佐劑。

31、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案為：如本發(fā)明所述的vzv抗原、如本發(fā)明所述的分離的核酸或如本發(fā)明所述的藥物組合物在制備預(yù)防vzv感染的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選所述vzv感染為水痘或帶狀孢疹例如帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛。

32、在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

33、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

34、本發(fā)明的積極進步效果在于：

35、本發(fā)明提供的vzv抗原具有比現(xiàn)有技術(shù)vzv更強的免疫原性，可以取得較高的結(jié)合抗體滴度，具有更高的保護效力。由本發(fā)明所述vzv抗原核苷酸序列制成的疫苗，其體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答非劣于shingrix的vzv疫苗(部分效果甚至更好)，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。