本發(fā)明涉及一種采用平衡轉(zhuǎn)移烷基化試劑(equilibrium?transfer?alkylationregeant，etac)的單域抗體片段(single?domain?antibody?fragments,sdab，例如vhh(variable?domain?of?heavy?chain?of?heavy-chain?antibody))的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。

背景技術(shù)：

1、抗體及其抗體片段，例如vhh，是免疫療法中的一類重要的生物分子。由于其獨(dú)特的分子特性，例如小尺寸、簡(jiǎn)單折疊和改善的組織滲透性，vhh對(duì)新的治療方法變得更加重要。vhh的一個(gè)潛在的新應(yīng)用是它們作為銜接分子與adcartm?t細(xì)胞結(jié)合的用途。

2、因此，為了這樣的目的，需要對(duì)vhh進(jìn)行修飾或標(biāo)記。一種方法是化學(xué)偶聯(lián)到化學(xué)標(biāo)簽(例如生物素、硫胺素、肽、dbco、寡核苷酸、肽核酸(pna)等)以被adcartm?t細(xì)胞識(shí)別，從而交聯(lián)腫瘤細(xì)胞和car?t細(xì)胞用于殺死腫瘤細(xì)胞。銜接分子與adcartm?t細(xì)胞的偶聯(lián)的用途在于其控制劑量的能力，以及隨之帶來的安全性，因?yàn)槿绻枰獣r(shí)，可以輕松地將其移除，其特征是帶給患者的風(fēng)險(xiǎn)最小。為了適用于藥物，銜接分子的化學(xué)偶聯(lián)必須是位點(diǎn)特異的，并且注射后在生理?xiàng)l件下產(chǎn)生一種均質(zhì)、穩(wěn)定且定義明確的產(chǎn)物。

3、能夠?qū)崿F(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的一個(gè)機(jī)會(huì)是摻入改造的半胱氨酸。然而，游離半胱氨酸可以形成二硫鍵，導(dǎo)致在生產(chǎn)或純化過程中蛋白質(zhì)聚集。目前使用的另一種策略是基于馬來酰亞胺的游離半胱氨酸的偶聯(lián)。這種方法的局限性在于馬來酰亞胺硫醇加合物在生理還原條件下會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化學(xué)偶聯(lián)。發(fā)生的逆邁克爾加成將導(dǎo)致無功能的銜接分子和對(duì)偶聯(lián)的銜接分子潛在的阻斷性表位[1,2]。

4、存在許多用于單域抗體片段的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的已知方法，例如馬來酰亞胺加成到改造的半胱氨酸或sortase反應(yīng)[3]。

5、例如，us11021544b2公開了etac系統(tǒng)(硫橋接)在二聚化vhh中的用途，其中通過etac系統(tǒng)(硫橋接)，以包含半胱氨酸部分的c末端延伸為特征的vhh連接，以產(chǎn)生引入診斷試劑、治療劑或標(biāo)記試劑劑的化學(xué)連接的納米抗體二聚體。

6、此外，出版物[5]公開了采用試劑進(jìn)行雙烷基化反應(yīng)的偶聯(lián)可以通過依賴于邁克爾反應(yīng)(michael?reaction)的加成-消除反應(yīng)來平衡性控制。共價(jià)偶聯(lián)發(fā)生在空間上靠近的2個(gè)氨基酸之間(例如，來自二硫化物的兩個(gè)半胱氨酸硫醇、或c-末端或n-末端組氨酸標(biāo)簽中的兩個(gè)組氨酸)。

7、在出版物[6]中，已經(jīng)記錄了通過etac試劑對(duì)組氨酸標(biāo)簽的修飾產(chǎn)生試劑多次加成的可能性。組氨酸標(biāo)簽的修飾對(duì)強(qiáng)邁克爾供體(machael?donors)如dtt不穩(wěn)定。為了穩(wěn)定偶聯(lián)物，使用可能與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不相容的三乙酰氧基硼氫化物，實(shí)現(xiàn)了引入到etac接頭中的酮的還原。

8、因此，需要一種位點(diǎn)特異的、在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的、且不易發(fā)生如二硫鍵那樣可見的蛋白質(zhì)聚集的偶聯(lián)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文可以證明，通過將一個(gè)末端半胱氨酸與直接靠近所述末端半胱氨酸的組氨酸殘基的連接，etac-生物素接頭可以特異性地單標(biāo)記單個(gè)vhh單元，從而靶向半胱氨酸-組氨酸基序。通過提供過量的etac-生物素接頭，etac接頭與vhh內(nèi)的多個(gè)邁克爾受體發(fā)生反應(yīng)。在添加競(jìng)爭(zhēng)性親核試劑(例如tcep)的情況下，我們能夠除去與單個(gè)組氨酸殘基交聯(lián)的etac-生物素標(biāo)簽，從而導(dǎo)致單一位點(diǎn)、單特異的偶聯(lián)vhh的富集。無需進(jìn)一步處理即可除去非偶聯(lián)的產(chǎn)物(通過lc-ms實(shí)驗(yàn)證實(shí))。據(jù)我們所知，靶向同一序列中的一個(gè)半胱氨酸和一個(gè)相鄰的組氨酸進(jìn)行雙邁克爾加成反應(yīng)，隨后通過使用親核試劑，如tcep，消除多標(biāo)簽靶標(biāo)，以選擇性富集位點(diǎn)特異性的單標(biāo)簽vhh是一種獨(dú)特的方法，且尚未被報(bào)道。

2、本發(fā)明的目的是根據(jù)權(quán)利要求1的一種用于提供具有可檢測(cè)標(biāo)簽的多肽的方法，其中所述多肽包含至少5個(gè)氨基酸，其中第一氨基酸為c(半胱氨酸)，并且至少一個(gè)第二氨基酸選自s(絲氨酸)、t(蘇氨酸)、y(酪氨酸)、k(賴氨酸)、h(組氨酸)和r(精氨酸)，其特征在于以下步驟：

3、a)通過提供根據(jù)式(i)的試劑，在第一氨基酸和第二氨基酸之間引發(fā)邁克爾加成反應(yīng)，

4、

5、其中：

6、r1獨(dú)立地表示-生物素、硫胺素、具有2-30個(gè)氨基酸的肽、具有6-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸、-dbco、dbco、-n3、n3和-熒光團(tuán)(例如fitc、cy染料、vio染料)、-熒光蛋白(例如gfp、rfp)，

7、r2獨(dú)立地表示取代或未取代的芳香族殘基(例如甲苯或苯基)，

8、r3獨(dú)立地表示h、f、no2、具有1-5個(gè)碳原子的烷基，

9、r4獨(dú)立地表示直接鍵、取代或未取代的烷基、胺或酰胺殘基(例如(-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-)(lc)或聚乙二醇(peg))，其具有1-20個(gè)碳原子；

10、b)添加親核試劑，以通過逆邁克爾加成反應(yīng)除去兩個(gè)第二氨基酸之間的邁克爾加成產(chǎn)物。

11、術(shù)語“多肽”是指由至少5個(gè)氨基酸的鏈組成的任何分子。這包括范圍從小肽(其為分子量在300da-7kda的多肽)到較大形式的分子(諸如分子量在8-15kda之間的單域抗體(vhh)、通常在20-50kda范圍內(nèi)的抗體片段、以及分子量為約140-160kda的全尺寸抗體如igg種類)。

12、etac-生物素連接的vhh(etac-biotin-linked?vhh)顯示出與其各自腫瘤抗原的特異性結(jié)合，這表明正確的折疊和功能。此外，etac-生物素偶聯(lián)的vhh(etac-biotinconjugated?vhh)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解和生物素特異性的銜接子car的細(xì)胞因子分泌。

13、與例如經(jīng)由馬來酰亞胺的單個(gè)附著位點(diǎn)相比，vhh的橋接修飾(bridgedmodification)可以提供更好的抗去偶聯(lián)的穩(wěn)定性以及被引入標(biāo)記劑的更高剛性，從而可能地增強(qiáng)與第二試劑(例如car?t細(xì)胞)的結(jié)合。

技術(shù)特征：

1.一種用于提供具有可檢測(cè)標(biāo)簽的多肽的方法，其中所述多肽包含至少5個(gè)氨基酸，其中第一氨基酸為半胱氨酸c，并且至少一個(gè)第二氨基酸選自絲氨酸s、蘇氨酸t(yī)、酪氨酸y、賴氨酸k、組氨酸h和精氨酸r，其特征在于以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述多肽的c末端提供至少一個(gè)第二氨基酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述親核試劑選自二硫蘇糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、三苯基膦(pph3)、肼(n2h4)、四(二甲氨基)乙烯(tdae)、巰基乙醇、甲酸、三氯硅烷(hsicl3)、膦(ph3)、二甲基硫化硼烷(me2s·bh3)、硫代乙酸、三(三甲基甲硅烷基)膦、三正己基膦、氨(nh3)、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苯硫酚、谷胱甘肽(gsh)、碘化物、甲胺、硫化氫。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述試劑具有式(ii)，

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述試劑具有式(iii)，

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多肽在c末端提供有2-10個(gè)組氨酸單元(h)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多肽為單域抗體(例如vhh)、抗體片段或全尺寸抗體。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述方法的用途，在car-銜接分子、細(xì)胞染色試劑、細(xì)胞分離/標(biāo)記/富集/耗竭過程、蛋白質(zhì)純化中以及為細(xì)胞活化提供具有可檢測(cè)標(biāo)簽的多肽。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種提供具有可檢測(cè)標(biāo)簽的多肽的方法，該多肽包含至少5個(gè)氨基酸，其中第一氨基酸為C，并且至少一個(gè)第二氨基酸選自S、T、Y、K、H和R，包括步驟：a)通過提供根據(jù)式(I)的試劑，在第一氨基酸和第二氨基酸之間引發(fā)邁克爾加成反應(yīng)，其中：R1獨(dú)立地表示?生物素、硫胺素、具有2?30個(gè)氨基酸的肽、具有6?100個(gè)核苷酸的寡核苷酸、?DBCO、DBCO、?N3、N3、?熒光團(tuán)或?熒光蛋白，R2獨(dú)立地表示取代或未取代的芳香族殘基，R3獨(dú)立地表示H、F、NO2或具有1?5個(gè)碳原子的烷基，R4獨(dú)立地表示直接鍵、取代或未取代的烷基、胺或酰胺殘基，其具有1?20個(gè)碳原子；b)添加親核試劑，以通過逆邁克爾加成反應(yīng)除去兩個(gè)第二氨基酸之間的邁克爾加成產(chǎn)物。

技術(shù)研發(fā)人員：N·韋爾肖,M·瓦格納,J·米特施泰特,J·福爾巴赫
受保護(hù)的技術(shù)使用者：美天施生物科技有限兩合公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19