本發(fā)明屬于生物醫(yī)學，具體涉及基于單細胞測序技術的急性后極部多灶性鱗狀色素上皮病變的重要通路及標志物篩選方法與應用。

背景技術：

1、急性后極部多灶性鱗狀色素上皮病變（apmppe）是一種非常罕見的原發(fā)性炎癥性脈絡膜病。該病主要影響年輕成年人，男女均有，估計年發(fā)病率為每10萬人中有0.15例。該病首次由gass于1968年描述，他報告了三名年輕女性在經歷突然無痛的視力喪失時，后極部出現(xiàn)多個離散的奶油色病灶。早期描述表明該病是自限性的，通常在6周內會自發(fā)緩解。然而，后續(xù)報告顯示出現(xiàn)了復發(fā)病例以及較差的視覺預后。apmppe的多模式影像學特征表明，主要的炎癥涉及脈絡膜毛細血管，而次級的光感受器損傷則助長了其獨特的臨床表型。

2、apmppe的臨床特征和診斷標準在幾項研究中已有描述，然而其確切的潛在發(fā)病機制仍然不明。最初認為炎癥發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮（rpe），并且超過三分之二的患者建議使用全身性皮質類固醇治療，可能還需結合非類固醇免疫抑制治療。在過去幾十年中，越來越多的證據(jù)支持該病具有免疫驅動的特性。一系列病例報道強調在apmppe發(fā)作前存在類流感病毒的前驅癥狀，并暗示存在自身免疫或自我炎癥反應。apmppe與多種既往的自身免疫疾病相關，包括銀屑病、肉芽腫病、結節(jié)性紅斑、濕疹和糖尿病。此外，有報道稱一些患者在apmppe診斷后發(fā)展出這些疾病。一項近期的遺傳研究表明，攜帶易感基因（如hla-b7和hla-dr2）的人群更易罹患apmppe。盡管如此，觸發(fā)因素如何引發(fā)先天免疫反應及隨后的脈絡膜和rpe炎癥的機制仍然不清楚。同樣，色素豐富的rpe為何成為主要靶點，以及為何眼底低自發(fā)熒光是該病的主要表型，仍然不明。

3、外周血單個核細胞（pbmcs）由多種細胞亞群組成，包括單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dcs）和b細胞，這些細胞作為免疫系統(tǒng)的基本組成部分發(fā)揮著重要作用。這些細胞在炎癥性疾病的發(fā)展、血管生成和腫瘤生長中起著關鍵作用。近年來，單細胞rna測序（scrna-seq）以一種前所未有的方式實現(xiàn)了對免疫系統(tǒng)的全面譜系分析。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術中存在的上述技術問題，本發(fā)明提供一種基于單細胞測序技術的急性后極部多灶性鱗狀色素上皮病變的重要通路及標志物篩選方法與應用，以解決apmppe免疫發(fā)病機制不明這一問題。本發(fā)明的篩選方法基于單細胞測序技術分析apmppe患者pbmc的單細胞圖譜，以描述apmppe發(fā)病過程中免疫系統(tǒng)的特征。剖析了apmppe患者外周血中單核細胞的復雜性，根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的新細胞亞群的數(shù)量變化以及基因表達差異等分析，使用單細胞測序技術深度測序分析了apmppe病人的免疫系統(tǒng)以及功能變化，并發(fā)現(xiàn)apmppe患者潛在的單核細胞的生物標志物，為研究apmppe致病機制以及精準臨床治療策略的開發(fā)都具有重要意義，為單細胞測序技術應用于后葡萄膜炎潛在致病機制的探討和生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供了參考。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：本發(fā)明的基于單細胞測序技術的急性后極部多灶性鱗狀色素上皮病變的重要通路及標志物篩選方法，包括以下步驟：

3、s1、外周血單個核細胞的分離；

4、s2、10×?genomics?單細胞?rna?測序；

5、s3、單細胞?rna?測序數(shù)據(jù)的比對和定量；

6、s4、apmppe患者pbmc降維聚類分析與細胞鑒定；

7、s5、apmppe患者pbmc差異表達基因的鑒定及富集分析；

8、s6、apmppe患者的單核細胞降維聚類分析與細胞鑒定；

9、s7、gsva分析apmppe單核細胞的潛在功能和重要通路；

10、s8、go和kegg功能富集分析在促炎和cd16單核細胞中的差異表達基因；

11、s9、篩選出ifitm3作為apmppe患者單核細胞的重要生物標志物。

12、進一步的，步驟s1具體過程如下：將一名患有急性多灶性視網(wǎng)膜脈絡膜炎的患者和一名與其年齡和性別匹配的健康個體作為研究樣本；通過ficoll梯度分離法對血樣中的外周血單個核細胞進行了純化；pbmcs以每管1?×?106個細胞的密度進行冷凍保存，以便后續(xù)分析；

13、步驟s2具體過程如下：來自每個樣本的單個細胞被獨立處理為單細胞懸液，并在10×?genomics系統(tǒng)上生成文庫；使用gemcode單細胞儀和chromium?next?gem?singlecell?5??gem,?library&gel?bead?kit?v3.1試劑盒生成單細胞文庫；文庫經過質量測試和測序。

14、進一步的，步驟s3具體過程如下：高通量測序中產生的原始數(shù)據(jù)為fastq格式序列，使用10×?genomics提供的cell?ranger軟件對原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)質量統(tǒng)計以及比對于參考基因組，該軟件通過識別序列中區(qū)分細胞的barcode標記和每個細胞內不同mrna分子的umi標記對高通量單細胞轉錄組數(shù)據(jù)進行定量，獲得高質量細胞數(shù)、基因中位值、測序飽和度等質控統(tǒng)計信息；在cell?ranger初步質控的基礎上，數(shù)據(jù)分析使用seurat?r軟件包對數(shù)據(jù)做進一步質控處理；根據(jù)以下閾值參數(shù)進一步過濾細胞：表達基因的總數(shù)為500–9000；umi/基因數(shù)量超出均值±2倍標準差的限制，假設每個細胞的umi/基因數(shù)量呈高斯分布；以及線粒體基因比例大于10%；在應用這些質量控制標準后，apmppe組保留了14537個單細胞，對照組保留了15588個單細胞，并被納入后續(xù)分析；所有樣本的數(shù)據(jù)通過r的合并功能進行合并，并使用seurat的normalizedata功能進行標準化；數(shù)據(jù)采用全局縮放標準化進行歸一化。

15、進一步的，步驟s4具體過程如下：使用seurat中的findvariablegenes函數(shù)識別top?2000個高變基因；利用高變基因的表達譜通過seurat中的runpca功能進行pca降維分析；基于基因表達譜使用seurat中的findclusters功能進行圖形化聚類，通過umap將結果在二維空間上進行可視化；使用seurat中的findallmarkers功能識別每個聚類的標記基因；對于給定的聚類，findallmarkers識別出與所有其他細胞相比的陽性標記；然后，使用r包singler通過參考轉錄組數(shù)據(jù)集“人類初級細胞圖譜”對細胞類型進行注釋；

16、接著使用seurat進行無監(jiān)督聚類分析，并結合經典標記基因使用singler對這些聚類進行注釋；在去除少量未知細胞后，大多數(shù)pbmc被分類為四種細胞類型：b細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和t細胞；繪制每種細胞類型的細胞數(shù)量的統(tǒng)計圖和每個亞群的top10標記基因圖；

17、為了全面了解apmppe疾病中pbmc的變化，對apmppe患者和健康對照者的pbmc細胞亞群進行了比較分析；通過umap圖，觀察到apmppe患者與對照組之間各個細胞群的分布模式顯著不同；值得注意的是，所有亞型中單核細胞亞群的變化最為顯著；量化了每個樣本中細胞的比例，發(fā)現(xiàn)兩組樣本中均存在高密度的t細胞和單核細胞；然而，apmppe患者pbmc中單核細胞的百分比明顯低于正常對照組。

18、進一步的，步驟s5具體過程如下：通過seurat中的findmarkers功能識別差異表達基因；使用r基于超幾何分布檢驗進行差異顯著基因的go和kegg通路富集分析；

19、生成一幅熱圖，以可視化apmppe患者和正常對照組在b細胞、t細胞、單核細胞和nk細胞四個特定細胞中上調和下調的前25個基因表達差異；對每種細胞亞型中差異表達基因進行了kegg的通路分類分析；研究結果顯示，單核細胞、b細胞、t細胞和nk細胞中上調的基因均顯著富集于免疫系統(tǒng)和感染性疾病，其中單核細胞排名第一，nk細胞第二，b細胞第三；基于這些結果，建議apmppe患者的pbmc中免疫系統(tǒng)和感染性疾病相關基因發(fā)生了顯著變化，特別是在單核細胞中。

20、進一步的，步驟s6具體過程如下：單核細胞被認為是自身免疫疾病進展的關鍵參與者；最近的一項研究揭示了vogt-koyanagi-harada疾病患者外周血中單核細胞的異常，這是一種影響眼睛的自身免疫疾??；為了深入了解apmppe患者外周血中單核細胞及其亞群的變化，專注于提取單核細胞進行亞群分析；最初，單核細胞根據(jù)cd14和cd16的表達分為兩個亞群,包括經典單核細胞和非經典單核細胞；為了更準確地描繪apmppe患者的單核細胞圖譜，結合已識別的精確標記基因；識別了五種不同的單核細胞亞群，并分析了它們的基因表達譜；點圖顯示了每個單核細胞亞群的標記基因，nk樣單核細胞、cd16單核細胞、s100a12單核細胞和巨核細胞樣單核細胞均可清晰識別；然而，在促炎單核細胞中，大多數(shù)細胞都存在促炎和hla標記；由于促炎標記基因更為特異，包括ifi6、isg15、il1b和ifi44l的獨特表達，將其定義為促炎單核細胞；識別了五種不同的單核細胞亞群，分別為nk樣、cd16、促炎、巨核細胞樣和s100a12單核細胞；此外，每個亞群表現(xiàn)出獨特的基因表達特征，表明其特定功能；

21、umap圖展示了apmppe患者與對照組之間單核細胞亞群分布的差異；顯示每個樣本中單核細胞亞群的比例量化結果；apmppe患者所有單核細胞亞群中最顯著的表達變化是與促炎狀態(tài)相關的轉錄程序的出現(xiàn)；?apmppe疾病導致單核細胞亞群之間的亞型轉移；隨著apmppe疾病的發(fā)生，促炎單核細胞的百分比增加，而s100a12單核細胞和nk樣單核細胞的百分比則減少；值得注意的是，cd16單核細胞的百分比略有下降，但其在umap中的模式發(fā)生了顯著變化；這些發(fā)現(xiàn)表明，促炎單核細胞可能積極參與apmppe疾病的發(fā)病機制；研究結果表明，促炎單核細胞集群是一種與眼部/葡萄膜炎癥相關的更普遍狀態(tài)。

22、進一步的，步驟s7具體過程如下：選擇gseabase包加載基因集文件，該基因集文件從kegg數(shù)據(jù)庫下載并處理，以執(zhí)行gsva；進一步估計信號通路活性評分并分配給單細胞，使用gsva包進行分析；通過limma包進行差異通路分析；

23、為了研究單核細胞簇的潛在功能，利用基因集變異分析包從分子特征數(shù)據(jù)庫中提取kegg通路并進行通路富集分析；gsva數(shù)據(jù)揭示了單核細胞亞群之間信號通路的明顯富集，表明每個亞群發(fā)揮特定功能；促炎單核細胞表現(xiàn)出幾條免疫通路的高度表達，如自然殺傷細胞介導的細胞毒性、1型糖尿病和病毒感染性疾病；cd16單核細胞在黑色素生成、人乳頭狀瘤病毒感染、wnt信號通路、rap1信號通路和ras信號通路中顯示出顯著的富集；

24、與正常對照組相比，apmppe患者的單核細胞中各種免疫通路的表達增加，同時黑色素生成通路顯著抑制，與其他單核細胞亞群相比，所有這些黑色素生成通路的基因在cd16單核細胞中特別高表達，提示黑色素生成通路在apmppe的發(fā)病機制中與cd16具有關鍵和獨特的作用；

25、人眼由多層色素組織組成，主要由黑色素構成；黑色素皮質信號在葡萄膜黑色素細胞黑色素生成中的作用尚不明確；在黑色素生成通路中，ctnnb1、gnai3、鈣調蛋白calm2、calm3和calml4在apmppe患者的單核細胞中發(fā)現(xiàn)上調，而gnai2、prkcb、plcb2、prkaca和crebbp則下調；觀察到的cd16單核細胞中上述基因的調控變化表明，參與cd16單核細胞黑色素生成的大多數(shù)通路與apmppe的發(fā)病機制相關；gsva分析揭示了黑色素生成在apmppe發(fā)病機制中cd16單核細胞的重要性。

26、進一步的，步驟s8具體過程如下：為了研究每種亞型在單核細胞中的功能，進一步分析了各亞型的差異表達基因；為了研究每種亞型在單核細胞中的功能，進一步分析了各亞型的差異表達基因（degs）；繪制單核細胞亞群中degs的火山圖；顯然，在大多數(shù)單核細胞亞型中，ifi6、ly6e和ifitm3被上調，而eef1a1和folr3在apmppe患者中則被下調；為了闡明apmppe患者中促炎單核細胞的潛在功能變化，對該亞型中的degs進行了go和kegg富集分析；促炎單核細胞中的degs在多種生物過程中富集，包括樹突狀細胞分化的調節(jié)、免疫反應、病毒基因組復制的負調節(jié)、i型干擾素信號傳導、對病毒的反應、免疫系統(tǒng)過程；這些發(fā)現(xiàn)表明，促炎單核細胞中的炎癥和免疫反應的發(fā)生可能在apmppe的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用；

27、基于gsva結果，假設感染類流感病毒病原體可能會引發(fā)先天免疫反應，最終導致apmppe患者的炎癥反應；此外，研究發(fā)現(xiàn)apmppe患者中cd16單核細胞的模式發(fā)生了顯著變化；為了進一步驗證cd16單核細胞在先天免疫反應和炎癥反應中的關鍵作用，對cd16單核細胞中的degs進行了功能富集分析；cd16單核細胞中degs的go富集分析顯示，在apmppe患者的cd16單核細胞中，生物過程如i型干擾素信號傳導、病毒基因組復制的負調節(jié)、對病毒的反應、對干擾素-β的反應以及病毒防御反應等發(fā)生了變化；研究結果表明，促炎單核細胞和cd16單核細胞在促進炎癥和免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用，這支持了主流假設，即病毒感染可能觸發(fā)apmppe疾病的發(fā)生。

28、進一步的，步驟s9具體過程如下：ifitm3被確定為apmppe患者單核細胞中與健康對照組相比差異表達最顯著的基因，并且在pbmc亞群中單核細胞中特別高表達；ifitm3是一種干擾素誘導的跨膜蛋白，先前已被確定為一種阻止病毒感染的內涵蛋白；為了研究ifitm3在apmppe疾病中的作用，在單細胞轉錄組水平上檢查了apmppe患者單核細胞中ifitm3的表達；結果表明，與健康單核細胞相比，ifitm3在促炎和cd16單核細胞亞群中顯著上調；此外，scvelo分析顯示ifitm3未剪接mrna的強烈表達，表現(xiàn)為正的速度，沿促炎和cd16單核細胞方向，表明ifitm3?mrna轉錄的誘導；這些發(fā)現(xiàn)提示ifitm3的激活可能驅動s100a12向促炎和cd16單核細胞亞群的分化；此外，apmppe患者單核細胞中最一致和顯著上調的基因是干擾素誘導的基因產物以及與急性炎癥相關的其他基因；因此，ifitm3在apmppe發(fā)病機制中的免疫反應中發(fā)揮重要作用，成為apmppe患者潛在的生物標志物。

29、基于單細胞測序技術的急性后極部多灶性鱗狀色素上皮病變的重要通路及標志物篩選方法的應用，包括以下內容：根據(jù)組間細胞亞群的數(shù)量變化以及在健康患者以及apmppe患者中各亞群細胞的免疫基因表達差異,?利用標記基因的表達水平檢測，以此來尋找在健康組和apmppe患者中存在較大表達異常的標記基因，以此作為檢測apmppe患者免疫變化的生物標志物，應用于研究apmppe致病機制以及精準臨床治療策略的開發(fā)，為單細胞測序技術應用于后葡萄膜炎潛在致病機制的探討和生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供參考。

30、采用上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下技術效果：本技術通過單細胞測序技術識別apmppe患者pbmc細胞的免疫反應變化，根據(jù)其表達模式的差異對單核細胞進行詳細分類，?實現(xiàn)了對apmppe患者單核細胞特征的全景式刻畫，并發(fā)現(xiàn)apmppe患者潛在的外周血中單核細胞的生物標志物，為研究apmppe致病機制以及精準臨床治療策略的開發(fā)都具有重要意義。