本發(fā)明涉及生物中通過(guò)提高楊樹(shù)中 pagbeh3b基因的表達(dá)促進(jìn)楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育的方法。

背景技術(shù)：

1、隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，木材消耗量持續(xù)增長(zhǎng)，隨之木材需求量急劇增加，木材安全問(wèn)題日益突出，迫切需要通過(guò)現(xiàn)代生物育種技術(shù)創(chuàng)制速生高產(chǎn)人工林新種質(zhì)，緩解木材供需矛盾，保障國(guó)家木材安全。分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)發(fā)展迅速，但其對(duì)靶標(biāo)基因的選擇要求非常高，選擇在木材形成調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用且作用機(jī)制研究透徹的基因有助于提高速生高產(chǎn)人工林分子設(shè)計(jì)育種的成功幾率。

2、木材的形成主要來(lái)源于次生木質(zhì)部的逐年積累，而次生木質(zhì)部的發(fā)育受到多種外界環(huán)境因子及內(nèi)源激素的協(xié)同作用，其中油菜素內(nèi)酯對(duì)次生木質(zhì)部發(fā)育具有重要影響。已有研究表明，油菜素甾醇可以促進(jìn)了次生木質(zhì)部的增厚。beh是油菜素甾醇信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，調(diào)控眾多下游基因。利用模式木本植物楊樹(shù)，研究beh調(diào)控次生木質(zhì)部的分子機(jī)制，鎖定調(diào)控木材產(chǎn)量的靶標(biāo)基因，對(duì)楊樹(shù)速生高產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何促進(jìn)楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育進(jìn)而提高楊樹(shù)產(chǎn)量。

2、為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了通過(guò)提高楊樹(shù)中 pagbeh3b基因的表達(dá)促進(jìn)楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育和/或提高楊樹(shù)株高和/或提高楊樹(shù)產(chǎn)量的方法，所述 pagbeh3b基因?yàn)榫幋apagbeh3b蛋白的基因，所述pagbeh3b蛋白是如下a1、a2或a3的蛋白質(zhì)：

3、a1、氨基酸序列是序列表中seq?id?no.2的蛋白質(zhì)；

4、a2、將序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與a1所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且功能類似的蛋白質(zhì)；

5、a3、在a1或a2的n末端或/和c末端連接蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

6、上述方法中，序列表中的seq?id?no.2由333個(gè)氨基酸殘基組成。

7、上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性?？墒褂脟?guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁(yè)網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁(yè)。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過(guò)使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85（缺省值）并進(jìn)行檢索一對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值（%）。

8、上述方法中，所述80％以上的同一性可為至少81％、85%、90%、91%、92%、95%、96%、98%、99%或100%的同一性。

9、上述方法中，所述pagbeh3b蛋白可來(lái)源于楊樹(shù)。

10、上述方法中，所述 pagbeh3b基因具體可為編碼鏈的編碼序列是序列表中seq?idno.1的核酸分子。

11、上述方法中，包括將所述的 pagbeh3b基因?qū)胧荏w楊樹(shù)中，得到木質(zhì)部發(fā)育加速的楊樹(shù)和/或株高提高的楊樹(shù)和/或產(chǎn)量提高的楊樹(shù)的步驟；所述木質(zhì)部發(fā)育加速的楊樹(shù)的木質(zhì)部發(fā)育速度高于所述受體楊樹(shù)的木質(zhì)部發(fā)育速度；所述株高提高的楊樹(shù)的株高高于所述受體楊樹(shù)的株高；產(chǎn)量提高的楊樹(shù)的產(chǎn)量高于所述受體楊樹(shù)的產(chǎn)量。

12、上述方法中，其中所述的 pagbeh3b基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體楊樹(shù)中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：

13、1）修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；

14、2）與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中采用啟動(dòng)子35s驅(qū)動(dòng) pagbeh3b基因；

15、3）與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于camv的tml，來(lái)源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；

16、4）引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列（例如來(lái)源于adhl和bronzel）和病毒前導(dǎo)序列（例如來(lái)源于tmv,mcmv和amv）。

17、所述 pagbeh3b基因可通過(guò)使用?ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接?dna轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞（?weissbach,?1998，?method?for?plantmolecular?biology?viii,?academy?press,?new?york,?pp.411-463;?geiserson?andcorey?,?1998?,?plant?molecular?biology(2nd?edition)。

18、上述方法中，所述楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育加強(qiáng)和/或提高楊樹(shù)株高和/或提高楊樹(shù)產(chǎn)量的楊樹(shù)可為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，也可為通過(guò)雜交等常規(guī)育種技術(shù)獲得的楊樹(shù)。

19、本發(fā)明還提供蛋白質(zhì)，為所述pagbeh3b蛋白。

20、本發(fā)明還提供與所述pagbeh3b蛋白相關(guān)的生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

21、本發(fā)明所提供的與所述pagbeh3b蛋白相關(guān)的生物材料，為下述b1至b5中的任一種：

22、b1、編碼pagbeh3b蛋白的核酸分子；

23、b2、含有b1所述核酸分子的表達(dá)盒；

24、b3、含有b1所述核酸分子的重組載體、或含有b2所述表達(dá)盒的重組載體；

25、b4、含有b1所述核酸分子的重組微生物、或含有b2所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有b3所述重組載體的重組微生物；

26、b5、含有b1所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有b2所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有b3所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

27、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

28、上述生物材料中，b1所述核酸分子為所述 pagbeh3b基因，具體可為編碼鏈的編碼序列是序列表中seq?id?no.1的核酸分子。

29、上述生物材料中，b2所述的表達(dá)盒（ pagbeh3b基因表達(dá)盒），是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述 pagbeh3b基因的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)所述 pagbeh3b基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述 pagbeh3b基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子?35s;?來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶?("lap",?chao?等人（1999)?plantphysiology?120:979-992)；來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)?1?(pr1)?(由水楊酸和?bth?(苯并噻二唑?-7-硫代羥酸?s-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑?ii啟動(dòng)子(pin2)或?lap啟動(dòng)子?(均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo))；?熱休克啟動(dòng)子?(美國(guó)專利?5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?(美國(guó)專利?5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pf128（cn101063139b(中國(guó)專利2007?1?0099169.7)），種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子?(例如，菜豆球蛋白、napin,?oleosin和?大豆?beta?conglycin?的啟動(dòng)子（beachy?等人?(1985)?embo?j.?4:3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子（nos終止子）、花椰菜花葉病毒camv?35s終止子、tml終止子、?豌豆rbcs?e9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子（參見(jiàn)，?例如：?odell?等人?（i985)?nature?313:810；rosenberg等人（1987)?gene,?56:125；?guerineau等人?(1991)?mol.?gen.?genet?,?262:141?;?proudfoot?(1991)?cell,?64:671;?sanfacon等人?genes?dev.?,?5:141;?mogen等人?(1990)?plant?cell,?2:1261；?munroe等人?（1990)?gene,?91:151；?ballad等人(1989)?nucleic?acids?res.?17:7891；?joshi等人?(1987)?nucleic?acid?res.,?15:9627)。

30、可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述 pagbeh3b基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pmdc32、pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb（cambia公司）等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因 nos)、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（ gus基因、螢光素酶基因等）、抗生素的標(biāo)記基因（如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的 nptii基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的 bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hpt基因、 hph基因，和賦予對(duì)methatrexate抗性的 dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的epsps基因）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等（如抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

31、上述生物材料中，所述重組微生物具體可為酵母，細(xì)菌，藻和真菌。

32、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了促進(jìn)楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育和/或提高楊樹(shù)產(chǎn)量和/或提高楊樹(shù)株高的植物試劑，所述植物試劑的活性成分為促進(jìn)或提高所述 pagbeh3b基因、提高所述pagbeh3b蛋白的豐度的物質(zhì)。所述物質(zhì)可包含所述pagbeh3b蛋白和/或所述生物材料。

33、上述植物試劑的活性成分還可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物試劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)促進(jìn)楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育和/或提高楊樹(shù)產(chǎn)量和/或提高楊樹(shù)株高的效果確定。

34、本發(fā)明還保護(hù)所述方法，或所述pagbeh3b蛋白，或所述生物材料在楊樹(shù)育種或楊樹(shù)木材生產(chǎn)中的應(yīng)用。

35、本發(fā)明還保護(hù)所述的植物試劑在楊樹(shù)木材生產(chǎn)中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明以銀腺楊品種84k為材料，篩選鑒定出了 pagbeh3b基因，基于其過(guò)表達(dá)植株的表型鑒定表明，其能夠調(diào)控楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育，說(shuō)明 pagbeh3b基因是調(diào)控楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為木質(zhì)部發(fā)育的調(diào)控手段提供了新的選擇，在林木基因工程領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。