本發(fā)明涉及種子鑒定，尤其涉及西瓜種子純度鑒定方法。

背景技術(shù)：

1、2021104653524公開了一種厚皮甜瓜雜交種子純度鑒定方法，解決傳統(tǒng)種子純度鑒定周期長、人為因素影響大、難以滿足市場快速、準確鑒別需要的技術(shù)問題。本發(fā)明綜合考量ssr位點等多重因素，篩選獲得est-ssr引物ssr8，以其擴增待驗樣品dna，經(jīng)凝膠電泳獲取條帶圖譜，并與父本、母本圖譜條帶進行對比，同時具有父、母本特異帶型的為真正的雜交種，缺少兩親本中任意一條特征帶或者為非親本特異條帶的均為假雜種。本發(fā)明方法能夠有效的區(qū)分雪彤8號的雙親及其雜交種，能夠快速、準確地鑒定其種子純度；

2、2021104653524公開了一種厚皮甜瓜雜交種子純度鑒定方法，解決傳統(tǒng)種子純度鑒定周期長、人為因素影響大、難以滿足市場快速、準確鑒別需要的技術(shù)問題。本發(fā)明綜合考量ssr位點等多重因素，篩選獲得est-ssr引物ssr8，以其擴增待驗樣品dna，經(jīng)凝膠電泳獲取條帶圖譜，并與父本、母本圖譜條帶進行對比，同時具有父、母本特異帶型的為真正的雜交種，缺少兩親本中任意一條特征帶或者為非親本特異條帶的均為假雜種。本發(fā)明方法能夠有效的區(qū)分雪彤8號的雙親及其雜交種，能夠快速、準確地鑒定其種子純度。

3、西瓜種子的純度鑒定目前沒有標準性文件，一直依賴于田間表型鑒定。而田間種植鑒定受天氣、病蟲害、主觀判斷失誤等原因影響，且種植鑒定需要花費至少1—2個月時間，才能完成表型純度鑒定，為此我們提供一種西瓜種子純度鑒定方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供西瓜種子純度鑒定方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

3、樣品準備，確保樣品符合規(guī)定要求；

4、取適量樣品，置于pcr板中，加入40μl?0.2mol/l?naoh溶液，于99℃水浴中處理，隨后加入60μl?0.17mol/l?tris-hcl溶液，再次于99℃水浴中加熱2分30秒；之后將樣品冷卻至4℃，持續(xù)30分鐘，以檢測dna的濃度和質(zhì)量；

5、配制pcr擴增反應(yīng)體系，確定總體積和各組分的最終濃度；

6、根據(jù)pcr擴增儀型號、taq酶、引物的不同，反應(yīng)程序可能有所變化，具體包括：

7、預(yù)變性：94℃?5分鐘；

8、擴增：94℃變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，進行32個循環(huán)；

9、終延伸：72℃?10分鐘；

10、將形成的擴增產(chǎn)物保存于4℃；

11、選擇zag毛細管電泳、熒光毛細管電泳、變性page垂直板電泳方法分離擴增產(chǎn)物；對于檢測樣品量較大的情況，可將多引物的擴增產(chǎn)物進行組合電泳，以提高檢測的綜合效率，page適用于小規(guī)模實驗，需銀染顯色，注意條帶分辨率的校準；

12、數(shù)據(jù)分析與記錄，在數(shù)據(jù)分析前，先剔除遺傳不穩(wěn)定的位點，剔除多態(tài)性過高或非孟德爾分離的ssr位點，優(yōu)先選擇穩(wěn)定、雙等位的標記，然后進行下一步數(shù)據(jù)分析；

13、雜交種正常個體的ssr峰值或片段大小有2種；當某個體的峰值或片段大小在2個以上ssr位點上與其他個體存在差異時，該個體被視為非典型個體；

14、對于鑒定自交個體，識別特征為該等位基因僅有母本條帶，而父本條帶缺失；

15、對于鑒定異交個體，識別特征為該等位基因具有母本條帶，而父本條帶錯誤；

16、于鑒定混雜個體，識別特征為該等位基因具有父本條帶，而母本條帶錯誤；或不具有父母本條帶；

17、結(jié)果計算與表示，檢測結(jié)果以正常個體數(shù)目（檢測試樣總數(shù)減去異常個體數(shù)目）占檢測試樣總數(shù)的百分率表示；

18、純度合格判定標準，在任一標記位點上，若中蜜1號西瓜種子純度高于96.0%，則判定為純度合格。

19、優(yōu)選的，zag毛細管電泳具體步驟為將96孔pcr產(chǎn)物加buffer定容至25ul，打開zag軟件操作，更改電泳參數(shù)，一般設(shè)置電壓4-5kv，室溫高于25℃時，每板電泳時間在50分鐘，溫度越低電泳時間越長，更改參數(shù)后即可電泳。

20、優(yōu)選的，熒光毛細管電泳具體步驟為：

21、根據(jù)ssr分子標記擴增片段大小的不同，選用多個引物組合進行電泳，按照預(yù)先確定的組合引物，分別取3μl同一組合引物的擴增產(chǎn)物，加30μl去離子水充分混勻，從混合液中吸取1μl，加入遺傳分析儀專用96孔板孔中，各孔再分別加入至少0.1μl分子量內(nèi)標和8.9μl去離子甲酰胺，離心10s后供備用；

22、打開dna分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)和試劑狀態(tài)；

23、將裝有樣品的微孔板放置于樣品架基座上，打開數(shù)據(jù)采集軟件，按照dna分析儀使用手冊進行操作，遺傳分析儀將自動運行參數(shù)，并保存電泳原始數(shù)據(jù)。

24、優(yōu)選的，變性page垂直板電泳具體步驟為：

25、將玻璃板洗凈，用雙蒸水沖洗后晾干，用無水乙醇擦洗兩遍，吸水紙擦干，在長板上涂上0.5ml親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5ml剝離硅烷工作液，操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染，在一對玻璃板兩側(cè)對齊放置1.0mm寬的封邊條，將玻璃板對齊夾緊，在100ml4.0%聚丙烯酰胺凝膠中加入新配制的10%過硫酸銨溶液500μl，temed50μl，迅速混勻在封口處注入，待膠室灌滿后，將鯊魚齒梳子平齊端向里輕輕插入膠液約0.4cm，讓其聚合1h以上。

26、優(yōu)選的，將膠板安裝于電泳槽上，向上下槽分別加入800ml的0.5×tbe緩沖液，使其超過凹槽玻璃板頂部約4mm，用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，將鯊魚齒梳子梳齒端插入凝膠1mm～2mm，每一個加樣孔點入2μl～3μl樣品，除檢測樣品外，還應(yīng)同時加入?yún)⒄諛悠?，電泳兩道，即第一道樣品電泳條件2000v?100w，電泳10min后，斷開電源，繼續(xù)點樣第二道，2000v?100w電泳30min后關(guān)閉電源，取下玻璃板。

27、優(yōu)選的，將附著凝膠的長玻璃板用水快速漂洗，再取出放入染色液中輕搖5min；從染色液中取出后用水快速漂洗，放入顯影液中輕搖至條帶清晰，取出后在雙蒸水中漂洗1min；將膠板瀝干后，進行掃描或拍照。

28、優(yōu)選的，檢測結(jié)果使用正常個體數(shù)目占檢測試樣總數(shù)的百分率表示。

29、優(yōu)選的，在任一標記位點上，中蜜1號西瓜種子純度高于96.0%，方可判定為純度合格。

30、本發(fā)明至少具備以下有益效果：

31、通過特定的分子標記，我們可以快速識別出西瓜種子中的雜種子，避免了傳統(tǒng)田間種植鑒定方法中的諸多不確定性和耗時長的缺點。此外，該方法不受環(huán)境因素的影響，提高了鑒定的準確性和可靠性。同時，本方法操作簡單，易于標準化，有利于在種子生產(chǎn)、質(zhì)量檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，zag毛細管電泳具體步驟為將96孔pcr產(chǎn)物加buffer定容至25ul，打開zag軟件操作，更改電泳參數(shù)，一般設(shè)置電壓4-5kv，室溫高于25℃時，每板電泳時間在50分鐘，溫度越低電泳時間越長，更改參數(shù)后即可電泳。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，熒光毛細管電泳具體步驟為：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，變性page垂直板電泳具體步驟為：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，將膠板安裝于電泳槽上，向上下槽分別加入800ml的0.5×tbe緩沖液，使其超過凹槽玻璃板頂部約4mm，用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，將鯊魚齒梳子梳齒端插入凝膠1mm～2mm，每一個加樣孔點入2μl～3μl樣品，除檢測樣品外，還應(yīng)同時加入?yún)⒄諛悠罚娪緝傻?，即第一道樣品電泳條件2000v?100w，電泳10min后，斷開電源，繼續(xù)點樣第二道，2000v?100w電泳30min后關(guān)閉電源，取下玻璃板。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，將附著凝膠的長玻璃板用水快速漂洗，再取出放入染色液中輕搖5min；從染色液中取出后用水快速漂洗，放入顯影液中輕搖至條帶清晰，取出后在雙蒸水中漂洗1min；將膠板瀝干后，進行掃描或拍照。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，檢測結(jié)果使用正常個體數(shù)目占檢測試樣總數(shù)的百分率表示。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜種子純度鑒定方法，其特征在于，在任一標記位點上，中蜜1號西瓜種子純度高于96.0%，方可判定為純度合格。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及種子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其關(guān)于西瓜種子純度的鑒定技術(shù)，不同品種的西瓜種子基因組中存在穩(wěn)定遺傳的簡單序列重復(fù)（SSR）的差異。這些差異可以通過提取樣品中的DNA，使用SSR引物進行擴增和電泳分析，進而通過檢測擴增產(chǎn)物的片段大小來進行區(qū)分。本標準詳細闡述了利用SSR（簡單重復(fù)序列Simple?sequence?repeats）分子標記技術(shù)進行西瓜雜交品種純度鑒定的檢測原理、檢測方案、檢測程序以及結(jié)果報告的制定。

技術(shù)研發(fā)人員：范家萌,徐四靜,汪文杰,張雨,高守宜,盛玉鳳,洪俠,崔明亮,王兆賢,陳德勝
受保護的技術(shù)使用者：合肥豐樂種業(yè)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15