本發(fā)明涉及細(xì)胞分離，具體涉及一種瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞的分離用組合試劑及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、瘢痕疙瘩是一種由于過度的膠原生成而形成的異常瘢痕，常見于皮膚損傷后，其特征為突起、堅硬且可能引起瘙癢或疼痛。瘢痕疙瘩的形成與巨噬細(xì)胞的功能密切相關(guān)，這些細(xì)胞在皮膚損傷愈合過程中發(fā)揮重要作用，參與炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)。然而，現(xiàn)有研究主要集中于瘢痕疙瘩內(nèi)巨噬細(xì)胞的分布和功能的免疫組化分析，缺乏有效的巨噬細(xì)胞分離方法。

2、目前，瘢痕疙瘩中巨噬細(xì)胞的研究主要依賴于免疫組化技術(shù)進(jìn)行原位驗證，尚未實現(xiàn)有效的細(xì)胞分離[1-2]。其中，

3、[1].abd?elaleem?sa,abdelwahab?s,amsherief?h,sayed?a.cellular?andphysiological?upregulation?of?inducible?nitric?oxide?synthase,arginase,andinducible?cyclooxygenase?in?wound?healing.j?cell?physiol.dec2019；234(12):2361823632.doi:10.1002/jcp.28930

4、[2].dirand?z,maraux?m,tissot?m,et?al.macrophage?phenotype?isdeterminant?for?fibrosis?development?in?keloid?disease.matrix?biol.apr2024；128:7992.doi:10.1016/j.matbio.2024.03.001

5、上述方法雖然能夠提供巨噬細(xì)胞在瘢痕疙瘩中的分布和相對豐度的信息，但由于無法分離出活細(xì)胞，限制了對其功能和特性的深入研究。

6、現(xiàn)有的巨噬細(xì)胞分離技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠法；上述針對瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞的分離方法尚未成熟，存在明顯的技術(shù)缺陷，主要體現(xiàn)在工藝復(fù)雜性和細(xì)胞活性保持等方面。流式細(xì)胞術(shù)雖然是一種常見的細(xì)胞分離技術(shù)，能夠基于細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行分離，但在瘢痕疙瘩組織的研究中，這一方法面臨著諸多挑戰(zhàn)。由于瘢痕疙瘩組織的復(fù)雜性和致密的膠原結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的細(xì)胞解離過程通常使用的單一酶解無法徹底消化瘢痕疙瘩。許多巨噬細(xì)胞在這一過程中容易因機(jī)械性損傷或酶解而失去活性，導(dǎo)致最終獲得的細(xì)胞在后續(xù)功能性分析中表現(xiàn)不穩(wěn)定和不可靠。因此，研究者無法有效地獲取活性巨噬細(xì)胞，從而限制了對其在瘢痕形成過程中的具體作用的深入理解。免疫組化技術(shù)雖然能夠提供巨噬細(xì)胞在瘢痕疙瘩中的定位信息，但該技術(shù)的局限性在于無法進(jìn)行活細(xì)胞分離；免疫組化主要用于定性分析，缺乏對活細(xì)胞的采集，無法進(jìn)行后續(xù)的功能性研究。研究者不能評估巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)、膠原合成等生理過程中的動態(tài)變化和作用機(jī)制，這進(jìn)一步限制了對其生物學(xué)特性的全面了解。

7、現(xiàn)有的巨噬細(xì)胞分離方法尚未成熟，缺乏有效的技術(shù)手段來實現(xiàn)瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞的有效分離和活性保持，這阻礙了對巨噬細(xì)胞在瘢痕形成中的具體作用的研究。因此，開發(fā)一種新的巨噬細(xì)胞分離方法，將有助于更好地理解巨噬細(xì)胞在瘢痕形成過程中的具體作用，以提高對瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞的研究深度和廣度。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有分離方法往往無法有效保持巨噬細(xì)胞的活性，且難以獲取足夠的細(xì)胞樣本，從而限制了對其生物學(xué)特性及在瘢痕形成中的作用的深入研究，本發(fā)明提供一種瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞的分離用組合試劑及應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)在細(xì)胞分離過程中存在的上述缺陷。

2、本發(fā)明公開了一種瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞的分離用組合試劑，包括：第一緩沖液和第二緩沖液；其中，

3、第一緩沖液包括酶a，酶a為分散酶；第一緩沖液為在dmem培養(yǎng)基中加入分散酶和添加劑，添加劑為胎牛血清和青霉素鏈霉素；其中，分散酶的濃度為1.5～2.5mg/ml，胎牛血清的濃度為0.08～0.12ml/ml，青霉素鏈霉素的濃度為0.008～0.012ml/ml；

4、第二緩沖液包括酶b，酶b包括膠原蛋白酶i、膠原蛋白酶ii、膠原蛋白酶iv、膠原蛋白酶v、透明質(zhì)酸酶和脫氧核酸酶；第二緩沖液為在dmem培養(yǎng)基中加入酶b和添加劑，添加劑為胎牛血清和青霉素鏈霉素；其中，膠原蛋白酶i的濃度為0.8～1.2mg/ml，膠原蛋白酶ii的濃度為0.6～1.0mg/ml，膠原蛋白酶iv的濃度為1.5～2.5mg/ml，膠原蛋白酶v的濃度為1.5～2.5mg/ml，透明質(zhì)酸酶的濃度為0.4～0.6mg/ml，脫氧核酸酶的濃度為0.08～0.12mg/ml，胎牛血清的濃度為0.08～0.12ml/ml，青霉素鏈霉素的濃度為0.008～0.012ml/ml。

5、本發(fā)明還公開了一種分離用組合試劑在制備分離瘢痕疙瘩巨噬細(xì)胞產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，包括：

7、步驟1、制備瘢痕疙瘩單細(xì)胞懸液：

8、a1)將瘢痕疙瘩組織樣本進(jìn)行清洗處理，并剪成預(yù)設(shè)尺寸的小塊；

9、b1)將處理后的瘢痕疙瘩組織加入第一緩沖液中，35～40℃、100～150rpm恒溫水浴震蕩孵育40～80分鐘，收集細(xì)胞懸液

10、c1)將b1)處理后的未消化的瘢痕疙瘩組織加入第二緩沖液中，35～40℃、100～150rpm恒溫水浴震蕩孵育2～4小時，收集細(xì)胞懸液；

11、d1)將b1)和c1)過程中收集的細(xì)胞懸液經(jīng)細(xì)胞篩過濾，離心，棄去上清液，獲取細(xì)胞沉淀；

12、e1)用pbs緩沖液或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，獲得瘢痕疙瘩單細(xì)胞懸液；

13、步驟2、分離出瘢痕疙瘩單細(xì)胞懸液中的巨噬細(xì)胞：

14、a2)將瘢痕疙瘩單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，添加ficoll-paque并混合；

15、b2)將a2)的離心管置于離心機(jī)中，在室溫下進(jìn)行離心；

16、c2)抽取b2)離心后的上層液體，收集在ficoll層與下層細(xì)胞之間的巨噬細(xì)胞；

17、d2)洗滌巨噬細(xì)胞，去除ficoll殘留物后進(jìn)行離心；

18、步驟3、基于流式細(xì)胞術(shù)的cd45和cd68染色：

19、a3)將分離得到的巨噬細(xì)胞重懸在pbs緩沖液中，加入抗cd45和抗cd68的熒光標(biāo)記抗體，分別稀釋至指定濃度，混勻后，避光孵育；

20、b3)用pbs緩沖液洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體，避光固定；

21、c3)使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞樣本，評估cd45和cd68的表達(dá)情況。

22、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟1的d1)中：

23、收集的細(xì)胞懸液依次經(jīng)60～80μm和20～40μm細(xì)胞篩過濾，而后在35～40℃下以500～700g的離心力離心4～8分鐘。

24、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟2的b2)中：

25、以400～500g的離心力離心15～25分鐘。

26、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟2的d2)中：

27、以250～350g的離心力離心5～10分鐘。

28、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟3的a3)中：

29、稀釋至1:(80～120)的濃度，混勻后避光孵育20～40分鐘。

30、作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟3的b3)中：

31、在3～5℃下避光固定20～40分鐘。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

33、1.提高分離效率：通過優(yōu)化細(xì)胞解離和分離過程，提高從瘢痕疙瘩組織中獲取活性巨噬細(xì)胞的效率，確保能夠獲得足夠的細(xì)胞樣本進(jìn)行后續(xù)分析；

34、2.保持細(xì)胞活性：在分離過程中，采用新技術(shù)或改良現(xiàn)有技術(shù)，以最大限度地保持巨噬細(xì)胞的活性和功能，確保分離后的細(xì)胞能夠用于多種生物學(xué)實驗和功能性研究；

35、3.實現(xiàn)活細(xì)胞分析：為后續(xù)的功能性研究提供可行的細(xì)胞樣本，使研究者能夠評估巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)、膠原合成等過程中的動態(tài)變化和作用機(jī)制，進(jìn)而加深對瘢痕形成生物學(xué)的理解。

36、基于此，本發(fā)明將為瘢痕疙瘩的研究提供更為有效的工具，有助于推動瘢痕治療的新策略和新方法的開發(fā)。