本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，具體涉及尿路感染常見念珠菌快速檢測的核酸質(zhì)譜技術(shù)。

背景技術(shù)：

1、尿路感染(urinary?tract?infection，uti)是指病原微生物侵犯尿路上皮導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

2、住院患者uit發(fā)病率高，嚴(yán)重影響其預(yù)后，且住院時間延長，住院費(fèi)用增加，甚至?xí)媾R病情加重和死亡率增加的風(fēng)險。明確導(dǎo)致uti的致病菌是控制感染和改善預(yù)后的關(guān)鍵。

3、在過去的十幾年中，隨著抗生素、免疫抑制劑和激素應(yīng)用廣度和強(qiáng)度增加，各種侵入性操作也更頻繁，uti致病菌的構(gòu)成比發(fā)生了較大的改變，真菌所占的比例逐年上升。其中念珠菌是導(dǎo)致uti的主要真菌種屬，包括白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌為主5種念珠菌，占真菌性uti總數(shù)的95％。

4、因此，建立從尿液標(biāo)本中快速檢出念珠菌的方法，覆蓋上述常見的5個菌種，是臨床實(shí)驗室亟待解決的重要問題。

5、目前，診斷念珠菌性uit的金標(biāo)準(zhǔn)仍是基于尿培養(yǎng)的分離鑒定，但是該方法的檢測周轉(zhuǎn)時間(turn?around?time,tat)長，不利于早期診斷和干預(yù)。盡管g試驗等血清學(xué)方法能夠較為快速的完成檢測，但其準(zhǔn)確率低，易出現(xiàn)假陽性，且不能確定感染菌種。

6、現(xiàn)有公開了一種核酸質(zhì)譜技術(shù)檢測常見念珠菌血癥的方法(《中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志》，2023，46(4)：402-409)，其檢測樣本為血液樣本，但血液樣本成分極為復(fù)雜，易出現(xiàn)假陽性或假陰性，同時取樣過程患者依從性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測常見念珠菌的方法，避免血液樣本采樣過程的不便以及血液樣本對于檢測結(jié)果的影響，以尿液為待測樣本，以便快速、準(zhǔn)確地檢出uit中常見的5種念珠菌，包括白色念珠菌(candidaalbicans)、光滑念珠菌(candida?glabrata)、近平滑念珠菌(candidaparapsilosis)、熱帶念珠菌(candida?tropicalis)和克柔念珠菌(candida?krusei)。

2、本發(fā)明是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的，一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法，包括以下步驟：

3、-從患者尿液樣本中提取出總核酸；

4、-采用pcr技術(shù)對提取的總核酸進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有目標(biāo)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；

5、-利用單堿基延伸引物和基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行質(zhì)譜(maldi-tof?ms)技術(shù)分析含有目標(biāo)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的特征性峰圖；

6、-根據(jù)特征性峰圖確定樣本中是否存在特定的念珠菌。

7、上述具體檢測方法操作步驟如下：

8、(1)設(shè)計念珠菌種擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物：

9、a)原始序列來源：在pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)的“nucleotide”數(shù)據(jù)庫中下載念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的its序列。

10、b)比對操作：使用pubmed中的blast軟件，在“enter?query?sequence”中鍵入目的序列；在“choose?search?set”的“database”中選擇“nucleotide?collection”數(shù)據(jù)庫，“organism”中選擇比對數(shù)據(jù)庫；在“program?selection”中選擇“highlysimilarsequences(megablast)”；點(diǎn)擊“blast”按鈕進(jìn)行比對。

11、c)比對步驟：

12、a)念珠菌種內(nèi)自身its序列比對，篩選堿基無變異或變異率小的序列；

13、b)所研究的5種念珠菌its的種間序列比對，篩選種高度保守序列；

14、c)所篩選的種間高度保守序列與人基因組庫(homo)、細(xì)菌庫(bacter)、真菌庫(fungi)、病毒庫(virus)、衣原體庫(chlamydia)、支原體庫(mycoplasma)和立克次氏體庫(rickettsia)進(jìn)行比對，確定是否有交叉反應(yīng)；

15、d)設(shè)計擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物：在比對后所篩選的高度保守序列上采用primer?premier?5.0軟件進(jìn)行擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物的設(shè)計；

16、e)使用pubmed中的primer-blast軟件，對所設(shè)計的擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物的檢出率進(jìn)行理論評價。檢出率按照如下公式進(jìn)行計算：檢出率＝數(shù)據(jù)庫中某種念珠菌的總株數(shù)-擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物不能正確匹配的株數(shù))/數(shù)據(jù)庫中某種念珠菌的總株數(shù)×100％。

17、(2)樣本制備與dna提?。?/p>

18、a)將各念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分區(qū)劃線接種至沙保羅瓊脂平板培養(yǎng)基，放置co2孵育箱中培養(yǎng)48小時；

19、b)在平板上挑取若干分離的菌落，溶解入無菌磷酸緩沖鹽溶液中，吹打混勻，制成念珠菌懸液；

20、c)菌懸液100℃加熱15分鐘，-80℃冷凍10分鐘；

21、d)上述步驟重復(fù)3次后，12000r/min離心15min；上清液即為念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株dna粗提液，吸取后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

22、(3)質(zhì)譜前pcr

23、pcr反應(yīng)體系為核酸擴(kuò)增反應(yīng)液7μl、核酸擴(kuò)增酶液2μl、樣品dna?5μl、上游和下游擴(kuò)增引物各1.5μl(0.5μmol/l)，水補(bǔ)足20μl，pcr反應(yīng)程序條件如下表pcr擴(kuò)增產(chǎn)物可用于后續(xù)核酸質(zhì)譜分析。

24、pcr擴(kuò)增條件可以為：

25、

26、(4)核酸質(zhì)譜分析

27、1)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的蝦堿性磷酸酶(shrimp?alkaline?phosphatase，sap)消化sap消化體系包括：sap反應(yīng)液1μl、sap酶液2μl。

28、sap消化條件為：

29、 步驟 反應(yīng)溫度 反應(yīng)時間 循環(huán)數(shù) 1 37℃ 30min 1 2 80℃ 5min 1 3 4℃ / /

30、2)單堿基延伸反應(yīng)

31、單堿基延伸反應(yīng)體系包括：延伸反應(yīng)液2μl、延伸酶液2μl、延伸引物各1.5μl(0.5μmol/l)，水1.5μl。

32、單堿基延伸反應(yīng)條件為：

33、

34、3)質(zhì)譜鑒定

35、單堿基延伸反應(yīng)完成后在每個pcr管中加入超純水40u1和一次性樹脂25mg，瞬時離心后手動翻轉(zhuǎn)混勻5-10min，混勻結(jié)束后離心，轉(zhuǎn)移20μl脫鹽產(chǎn)物上清液、校準(zhǔn)品覆蓋在核酸質(zhì)譜芯片對應(yīng)檢測區(qū)，干燥后上機(jī)進(jìn)行檢測；識別病原菌的質(zhì)譜特征峰，建立5種臨床常見尿路感染念珠菌的特異性質(zhì)譜峰圖。

36、上述檢測方法學(xué)評價如下：

37、(1)分析靈敏度實(shí)驗

38、1)梯度稀釋菌液

39、a)吸取上述制備的念珠菌懸液，作10倍稀釋；

40、b)沖入改良牛鮑式血球計數(shù)板進(jìn)行念珠菌計數(shù)；

41、c)根據(jù)念珠菌計數(shù)結(jié)果，將原菌液調(diào)配成濃度為10^7cfu/ml的菌液；連續(xù)10倍梯度稀釋，獲得濃度為10^6cfu/ml、10^5cfu/ml、10^4cfu/ml、10^3cfu/ml、10^2cfu/ml和10^1cfu/ml的梯度稀釋菌液。

42、2)將稀釋后的菌液與健康人新鮮尿液按比例混合，配制成濃度梯度分別為10^6、10^5cfu/ml、10^4cfu/ml、10^3cfu/ml、10^2cfu/ml、10^1cfu/ml和10^0cfu/ml的尿液模擬樣本。

43、3)各濃度設(shè)置3個平行實(shí)驗，以無菌水和健康人基因組dna為空白和陰性對照；核酸質(zhì)譜各步驟反應(yīng)條件與前文所述相同，以確定5種念珠菌在尿液樣本中的檢測限。

44、(2)分析特異度實(shí)驗

45、1)：將5種念珠菌的基因組dna等濃度等體積混勻后作為陽性對照，觀察各單堿基延伸引物的產(chǎn)物峰生成情況；分別檢測5種目標(biāo)菌的基因組dna，觀察各單堿基延伸引物系統(tǒng)內(nèi)特異度；

46、2)按上述提取uti常見細(xì)菌(大腸埃希菌、屎腸球菌等)和其他真菌(黑曲霉菌和毛霉菌等)的dna以及人基因組dna。

47、2)按上述步驟和反應(yīng)條件行核酸質(zhì)譜，觀察細(xì)菌和其他真菌的質(zhì)譜峰圖與念珠菌質(zhì)譜峰圖的差異。

48、2.1.3臨床應(yīng)用評估

49、(1)留取疑似念珠菌性uti患者的尿液標(biāo)本，分別使用尿培養(yǎng)和核酸質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測，通過診斷靈敏度、診斷特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標(biāo)評估檢測平臺的診斷效能；診斷靈敏度根據(jù)下列公式進(jìn)行計算：核酸質(zhì)譜檢測平臺真陽性例數(shù)/尿培養(yǎng)陽性例數(shù)×100％；診斷特異度根據(jù)下列公式進(jìn)行計算：核酸質(zhì)譜檢測平臺真陰性例數(shù)/尿培養(yǎng)陰性例數(shù)×100％；陽性預(yù)測值根據(jù)下列公式進(jìn)行計算：核酸質(zhì)譜檢測平臺真陽性例數(shù)/核酸質(zhì)譜檢測平臺陽性例數(shù)×100％；陰性預(yù)測值根據(jù)下列公式進(jìn)行計算：核酸質(zhì)譜檢測平臺真陰性例數(shù)/核酸質(zhì)譜檢測平臺陰性例數(shù)×100％。

50、(2)通過配對χ2檢驗對2種檢測方法結(jié)果的差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，通kappa檢驗分析2種方法一致性。

51、(3)記錄2種方法報告結(jié)果時的tat。

52、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述含有目標(biāo)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物為采用pcr技術(shù)分別對白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)設(shè)計的擴(kuò)增產(chǎn)物。

53、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述單堿基延伸引物用于在基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行質(zhì)譜(maldi-tof?ms)分析中產(chǎn)生不同質(zhì)量的特征性峰圖，以區(qū)分不同的念珠菌種。

54、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述總核酸的提取應(yīng)用熱休克法提取后應(yīng)用核酸純化試劑盒進(jìn)行純化處理。

55、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系中包含引物、dntps、taq-dna聚合酶和緩沖液。

56、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行質(zhì)譜(maldi-tof?ms)技術(shù)的檢測限為10^1cfu/ml，且相對定量線性范圍為10^1-10^7cfu/ml。

57、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述尿液樣本為新鮮清潔中段尿液。

58、作為本發(fā)明所述的一種基于核酸質(zhì)譜技術(shù)快速檢測尿路感染常見念珠菌的方法的優(yōu)選方案：所述基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行質(zhì)譜(maldi-tof?ms)技術(shù)中使用的基質(zhì)為羥基吡啶甲酸。

59、可以理解，上述念珠菌的檢測方法中，檢測的念珠菌可以來源于機(jī)體內(nèi)或機(jī)體外環(huán)境；優(yōu)選的，機(jī)體外環(huán)境包括各種外部環(huán)境的念珠菌，比如白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌；而機(jī)體內(nèi)可以來源于體內(nèi)各個組織中，優(yōu)選的，來自清潔中段尿液標(biāo)本，比如白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌。

60、本發(fā)明有益技術(shù)效果：相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明至少具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：

61、(1)本發(fā)明提供快速檢測方法，包含基于pcr技術(shù)的質(zhì)譜技術(shù)，首次應(yīng)用于尿液標(biāo)本中念珠菌檢測，6-7小時內(nèi)即可完成檢測，從而縮短tat，助力疾病的早期診斷與及時治療。

62、(2)本發(fā)明通過擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物的序列篩選優(yōu)化，獲得一套適于常見念珠菌的檢測體系，基于該體系檢測五種uti常見的念珠菌，結(jié)合核酸質(zhì)譜技術(shù)，使結(jié)果可清晰辨別，避免了復(fù)雜傳統(tǒng)檢測手段，提高了檢測的效率。(3)本發(fā)明對尿液標(biāo)本中白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠、熱帶念珠菌和克柔念珠菌的檢出限達(dá)到10^1cfu/ml。

63、(4)本發(fā)明中所設(shè)計的pcr引物和單堿基延伸引物不與細(xì)菌等非念珠菌致病菌以及人類的dna發(fā)生交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的特異性。

64、(5)本發(fā)明操作簡單，適于產(chǎn)業(yè)推廣使用。