本發(fā)明屬于分子生物學檢測，尤其涉及一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的引物組、引物探針組合、試劑盒及其應用。

背景技術：

1、家蠶濃核病是蠶業(yè)生產中常見的病毒性傳染病之一，其病原體為家蠶二分濃核病毒(bombyx?moribidensovirus，bmbdv)。bmbdv是一種直徑為20～24nm的無囊膜球形病毒，由于其體積較小，無法通過光學顯微鏡觀察，這為蠶業(yè)養(yǎng)殖中的診斷帶來了困難。

2、pcr作為一種新的分子生物學實驗技術，具有靈敏度高、快速特異、操作簡單等優(yōu)點，對于檢測臨床標本中病原體的核酸序列具有常規(guī)檢測方法無可比擬的優(yōu)勢，在應用于細菌、病毒的檢測方面已有較多的報道并展示出良好的應用前景。近年來，在運用pcr技術檢測和研究家蠶濃核病毒基因方面，已經取得了可喜的進展(韓序，姚勤，高路等，家蠶濃核病毒(中國鎮(zhèn)江株)在不同感受性宿主體內的復制.生物工程學報，2007，23(1):145-151；付艷紅，唐順明，覃光星等，家蠶濃核病毒中國(鎮(zhèn)江)株基因組的克隆及重組質粒轉染家蠶對濃核病毒的拯救.蠶業(yè)科學，2008，34(3):453-458)。依據已經報道的家蠶濃核病毒bmdnv(現稱bmbdv)的基因片段序列設計引物，建立了pcr診斷方法，但其檢測的敏感性還有待提升。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的引物組、引物探針組合、試劑盒及其應用，本發(fā)明的引物探針組合和試劑盒能夠用于建立bmbdv的快速檢測方法，實現對bmbdv的高靈敏、高通量、早期檢測。

2、本發(fā)明提供了一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的引物組，包括核苷酸序列如seqid?no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq?id?no.2所示的下游引物。

3、本發(fā)明還提供了一種用于家蠶二分濃核病毒熒光定量pcr檢測的引物探針組合，包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物、核苷酸序列如seq?id?no.2所示的下游引物和核苷酸序列如seq?id?no.3所示的探針；所述探針的5'端標記有熒光基團，3'端標記有淬滅基團。

4、本發(fā)明還提供了一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的試劑盒，包括上述的引物組或者上述的引物探針組合。

5、本發(fā)明一種優(yōu)選方式中，還包括pcr擴增用的反應液或者熒光定量pcr的反應液。

6、本發(fā)明還提供了上述的引物組、上述的引物探針組合或者上述的試劑盒在非診斷目的的家蠶二分濃核病毒檢測中的應用。

7、本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的家蠶二分濃核病毒pcr檢測的方法，包括以下步驟：

8、提取待測樣本的基因組；

9、以所述基因組為模板，采用上述的引物組進行pcr擴增，得到pcr擴增產物；

10、對所述pcr擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，當出現一條大小為279bp的條帶時判定為陽性；當沒有條帶時判定為陰性。

11、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述pcr擴增的反應體系以25μl計，包括以下組分：12.5μlprime?star?max?premix(2×)、上下游引物各1μl、1μl模板和余量的ddh2o，所述引物終濃度均為400nm；

12、所述pcr擴增的反應程序為：預變性98℃、3min；循環(huán)段98℃、10s，55℃、15s，72℃、10s，總計30個循環(huán)；終延伸72℃、7min。

13、本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的家蠶二分濃核病毒熒光定量pcr檢測的方法，包括以下步驟：

14、提取待測樣本的基因組；

15、以所述基因組為模板，采用上述的引物探針組合進行熒光定量pcr。

16、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述熒光定量pcr的反應體系以10μl計，包括以下組分：探針0.1μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、反應液7.5μl和模板2μl；所述探針終濃度為100nm，上游引物和下游引物終濃度為200nm；

17、所述熒光定量pcr的反應程序包括：37℃、2min；95℃、30s；95℃、10s，60℃、30s，40個循環(huán)。

18、本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，在所述熒光定量pcr后，判定檢測結果；所述判定檢測結果的標準包括：

19、當樣品的擴增結果有特異性擴增曲線，且ct值≤38時，可判定為陽性；

20、當樣品的擴增結果無特異性擴增曲線或無ct值時，可判定為陰性；

21、當樣品的擴增結果有特異性擴增曲線且38＜ct值≤40時，可判定為陽性可疑樣本；

22、對所述陽性可疑樣本進行復檢，若復檢的ct值≤40，且出現特異性擴增曲線，可判定為陽性；若復檢的擴增結果無ct值或無特異性擴增曲線時，可判定為陰性；

23、或者結合ct值和標準曲線，得到待測樣本中家蠶二分濃核病毒的定量結果；

24、所述標準曲線以標準質粒的濃度log10為橫坐標，以ct值為縱坐標構建得到。

25、有益效果：本發(fā)明提供了一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的引物組，包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物、核苷酸序列如seq?id?no.2所示的下游引物和核苷酸序列如seq?id?no.3所示的探針。本發(fā)明的引物探針組合特異性強，僅能擴增bmbdv，不能擴增家蠶其他病原，可用于bmbdv特異性檢測，為家蠶養(yǎng)殖過程中bmbdv的早期檢測提供了可靠方法。

技術特征：

1.一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的引物組，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?idno.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq?id?no.2所示的下游引物。

2.一種用于家蠶二分濃核病毒熒光定量pcr檢測的引物探針組合，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物、核苷酸序列如seq?id?no.2所示的下游引物和核苷酸序列如seq?id?no.3所示的探針；所述探針的5'端標記有熒光基團，3'端標記有淬滅基團。

3.一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物組或者權利要求2所述的引物探針組合。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括pcr擴增用的反應液或者熒光定量pcr的反應液。

5.權利要求1所述的引物組、權利要求2所述的引物探針組合或者權利要求3或4所述的試劑盒在非診斷目的的家蠶二分濃核病毒檢測中的應用。

6.一種非診斷目的的家蠶二分濃核病毒pcr檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr擴增的反應體系以25μl計，包括以下組分：12.5μlprime?starmax?premix、上下游引物各1μl、1μl模板和余量的ddh2o，所述引物終濃度均為400nm；

8.一種非診斷目的的家蠶二分濃核病毒熒光定量pcr檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述熒光定量pcr的反應體系以10μl計，包括以下組分：探針0.1μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、反應液7.5μl和模板2μl；所述探針終濃度為100nm，上游引物和下游引物終濃度為200nm；

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，在所述熒光定量pcr后，判定檢測結果；所述判定檢測結果的標準包括：

技術總結
本發(fā)明提供了一種用于家蠶二分濃核病毒檢測的引物組、引物探針組合、試劑盒及其應用，屬于分子生物學檢測技術領域。本發(fā)明提供了一種用于家蠶二分濃核病毒(BmBDV)熒光定量PCR檢測的引物組及引物探針組合，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的探針。本發(fā)明的引物組特異性強、僅能擴增BmBDV，不能擴增家蠶其他病原；引物探針組合靈敏度高，將感染BmBDV病蛹基因組稀釋至100fg仍能成功檢出BmBDV信號。本發(fā)明的引物組以及引物探針組合能夠用于家蠶養(yǎng)殖過程中BmBDV的早期檢測。

技術研發(fā)人員：潘國慶,何章帥,解芳麗,孟憲志,陳潔,周澤揚
受保護的技術使用者：西南大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/15