本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、葫蘆素(cucurbitacins)是一類特殊的四環(huán)三萜類化合物，主要存在于葫蘆科植物中，以苦味和毒性著稱。葫蘆素主要存在于葫蘆科(cucurbitaceae)植物約30個(gè)屬的100個(gè)物種中。葫蘆素化合物被報(bào)道具有抗蟲活性，極苦的葫蘆素對植物抵御不良外界環(huán)境具有重要作用，還可增強(qiáng)植物的病蟲害抗性。在哺乳動物系統(tǒng)中，幾種葫蘆素已顯示出降血糖、抗腫瘤等多種藥理活性，特別是抗癌活性最為突出的。一些具有藥用價(jià)值的葫蘆素也與特定的作用機(jī)制有關(guān)，以葫蘆素b為主要成分的葫蘆素制劑在臨床上廣泛用于原發(fā)性肝癌的治療，葫蘆素b通過共價(jià)結(jié)合igf2bp1的kh結(jié)構(gòu)域的253位半胱氨酸殘基，誘導(dǎo)靶點(diǎn)蛋白變構(gòu)，阻斷其對下游m6a靶基因的識別并發(fā)揮抗腫瘤及改善腫瘤免疫微環(huán)境的作用。盡管其具有高效的抗腫瘤活性，低治療指數(shù)和非特異性，但毒性極大地阻礙了葫蘆素的臨床應(yīng)用和生物學(xué)研究，且三萜類成分的結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，在植物中含量較低且常以多種結(jié)構(gòu)相近的成分混合存在，難以通過提取分離或化學(xué)合成方法獲得。更重要的是，通過對其骨架修飾合成葫蘆素三萜的完整生物合成途徑仍然是不清楚的，這種生產(chǎn)途徑的缺乏限制了這一高度氧化化合物的臨床候選藥物的效用和生物學(xué)研究。研究表明葫蘆素制劑中的雜質(zhì)可能是導(dǎo)致毒性的原因。因此，基于闡明生物合成途徑的合成生物學(xué)策略似乎是一種更有前途、可持續(xù)和替代的方法。

2、合成生物學(xué)在生產(chǎn)藥效單體中發(fā)揮著重要的作用。聯(lián)合多組學(xué)分析篩選元件，通過大腸、酵母等驗(yàn)證功能并途徑解析生物合成途徑，利用細(xì)胞工廠生產(chǎn)藥效單體。生物合成途徑與天然化合物緊密相關(guān)，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中間體影響其合成與分布，研究并揭示其機(jī)理，可指導(dǎo)活性化合物改造與代謝生產(chǎn)。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的藥用活性成分通過代謝工程化實(shí)現(xiàn)了異源合成，為藥效單體的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能，如人參皂苷，紫杉醇前體[31，、青蒿素前體青蒿酸，長春堿及秋水仙堿。然而，除葫蘆素前體葫蘆二烯醇(cuo?l)異源高效合成外，至今尚無代謝工程生產(chǎn)葫蘆素的報(bào)道，主要是因?yàn)閷ζ渖锖铣赏緩饺狈α私狻Ｒ虼?，闡明葫蘆素生物合成機(jī)制，對于葫蘆科植物分子育種和葫蘆素類化合物的高效異源合成具有重要意義。

3、細(xì)胞色素p450(cyp450)是一個(gè)古老的超基因家族，同時(shí)也是植物代謝中最大的酶家族。cyp450具有廣泛的催化活性，其在生物化學(xué)反應(yīng)中能夠?qū)⒁粋€(gè)氧原子插入到疏水性分子中從而獲得較高的活性或親水性，又被稱為單加氧酶(mixed-function?oxidase,mfo)。最常見反應(yīng)是單加氧酶反應(yīng)，其催化的三萜碳骨架修飾顯著促進(jìn)三萜類成分的結(jié)構(gòu)多樣性。

4、研究表明，葫蘆素生物合成起始于2,3-氧化鯊烯環(huán)化形成的葫蘆二烯醇(cuol)，是由氧化鯊烯環(huán)化酶(oscs)家族的葫蘆二烯醇合酶(cbs)催化。葫蘆二烯醇在細(xì)胞色素p450和sdr34的催化下，通過引入羥基、羧基或環(huán)氧基進(jìn)行特定部位的氧化修飾，從而產(chǎn)生多種多樣的四環(huán)三萜類化合物。hccyp81q58和hccyp87d19這兩個(gè)基因功能已被驗(yàn)證且已申請專利(cn?116334106a)，該專利構(gòu)建的菌株cuol-05-1將hccyp81?q58和hccyp87d19這兩個(gè)基因?qū)肭捌跇?gòu)建的高水平生產(chǎn)11-羰基-20β-羥基-cuol的酵母工程菌dnhc87-03，發(fā)現(xiàn)hccyp87d19基因能夠催化11-carbonyl-cucurbita-5,23-diene-3β,22,25-triol(5)和11-carbonyl-cucurbita-5,24-diene-3β,22,23-triol(5b)的c16位羥化，分別形成11-carbonyl-cucurbita-5,23-diene-3β,16α,20,25-tetrol(6)、11-carbonyl-cucurbi?ta-5,24-diene-3β,16α,20,23-tetrol(6b)，然后經(jīng)hcsdr34這個(gè)基因?qū)3位的酮基化分別形成11-carbonyl-cucurbita-5,23-diene-16α,20,25-triol-3-one(6a)、11-carb?onyl-cucurbita-5,24-diene-16α,20,23-triol-3-one(6c)，其中，相關(guān)結(jié)構(gòu)式與圖2中列出的結(jié)構(gòu)式相同。

5、葫蘆素一類化合物高度被氧化，在植物中的含量較低，利用受到限制，提取純化工藝復(fù)雜且耗時(shí)，需投入大量的人力物力等資源且對環(huán)境有危害。目前，相關(guān)藥物的開發(fā)中，主要通過從植物中化學(xué)提取的方式來制備?，F(xiàn)今要實(shí)現(xiàn)對葫蘆素的化學(xué)合成仍存在諸多挑戰(zhàn)。特別是葫蘆素重要中間體化合物。

6、因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前生物技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因及其應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面提供一種雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因，雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明第二方面提供上述雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因編碼蛋白，該編碼蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、本發(fā)明第三方面提供含有上述雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因的重組質(zhì)粒。

6、進(jìn)一步，將雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因與ycplac33載體同源重組，得到y(tǒng)33-hccyp89a140重組質(zhì)粒。

7、本發(fā)明第四方面提供一種轉(zhuǎn)基因工程菌，含有上述重組質(zhì)粒，或，所述基因工程菌的基因組中整合有外源的上述雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因。

8、進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)基因工程菌為能產(chǎn)16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one的釀酒酵母工程菌。

9、進(jìn)一步，所述的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將外源基因hccyp89a140、啟動子tef1、終止子adh進(jìn)行基因克隆并進(jìn)行片段融合構(gòu)建基因表達(dá)盒，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將基因表達(dá)盒整合至酵母底盤coul-05-1中。

10、本發(fā)明第五方面提供上述雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140基因在制備16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one中的應(yīng)用。

11、進(jìn)一步，以11-carbonyl-cucurbita-5,24-diene-3β,16α,20,23-tetrol為底物，在hccyp89a140催化下進(jìn)行c20位羥基和c24位羥基縮合脫水呋喃化，然后再在sdr34的催化下進(jìn)行c3位酮基化，生成16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one。

12、本發(fā)明通過將hccyp89a140這個(gè)基因?qū)虢湍腹こ叹鷆uol-05-1，發(fā)現(xiàn)hccyp89a140基因能夠催化11-carbonyl-cucurbita-5,24-diene-3β,16α,20,23-tetrol(6b)的c20位羥基和c24位的羥基縮合脫水呋喃化，然后經(jīng)sdr34這個(gè)基因?qū)3位的酮基化形成16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one(8a)。

13、合成路徑如下：

14、

15、11-carbonyl-cucurbita-5.23-diene-3β,16α,203,25-tetrol的結(jié)構(gòu)式如下：

16、

17、16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one的中文命名為16，23雙羥基化葛蘭素，分子式：c30h46o6，分子量：502.31；結(jié)構(gòu)式如下：

18、

19、表1hccyp89a140產(chǎn)物13c&1h?nmr(800mhz，溶劑：cdcl3)數(shù)據(jù)(jin?hz，δin?ppm)

20、

21、

22、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

23、本發(fā)明提供了含有雪膽細(xì)胞色素氧化酶hccyp89a140轉(zhuǎn)基因釀酒酵母工程菌coul-07，通過生物工程方法合成16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one(8a)，進(jìn)一步為雪膽素生物合成調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為未來葫蘆素生物工廠化生產(chǎn)提供前期基礎(chǔ)。16α,23-dihydroxy-gratiogenin-3-one(8a)是葫蘆素類化合物形成途徑中的衍生化合物，葛蘭素的一種。葛蘭素，從放線菌金色鏈叢菌(streptomyces?aureofa-ciens)的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質(zhì)，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素，對結(jié)核菌、變形菌等則無效。因此，16α,23-dihydrox?y-gratiogenin-3-one(8a)的異源合成，對葫蘆素類化合物生物合成機(jī)制以及其衍生化合物和高效異源合成具有重要意義。