本發(fā)明涉及基因，特別涉及一種細(xì)葉百合lpbhlh94基因的克隆以及所述基因在提高轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫抗性的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、bhlh家族轉(zhuǎn)錄因子是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，具有多種生物學(xué)功能，其通過(guò)與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的適應(yīng)性反應(yīng)，在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫及代謝網(wǎng)絡(luò)的響應(yīng)中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，bhlh轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)影響植物的滲透平衡，來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性，在響應(yīng)鹽脅迫方面發(fā)揮重要功能。

2、細(xì)葉百合(lilium?pumilum)又名山丹，百合科百合屬多年生草本。其花獨(dú)特，花形呈鐘狀反卷，花色紅艷，具有很高的觀賞價(jià)值；同時(shí)是優(yōu)質(zhì)的百合種質(zhì)資源，有較強(qiáng)的抗病性和耐鹽堿、耐干旱等優(yōu)良性狀，在園林應(yīng)用中有很高的應(yīng)用價(jià)值，是培育抗性百合品種的良好親本材料。

3、本實(shí)驗(yàn)以細(xì)葉百合為研究對(duì)象，從細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組中篩選出基因lpbhlh94，利用同源重組技術(shù)將其從細(xì)葉百合cdna中克隆出來(lái)，進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建煙草過(guò)表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法侵染煙草葉片，得到過(guò)表達(dá)煙草植株，進(jìn)一步測(cè)量相關(guān)的生理性指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行耐鹽功能驗(yàn)證，為進(jìn)一步探究其響應(yīng)高鹽脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為揭示細(xì)葉百合抗逆機(jī)理提供參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種來(lái)源于細(xì)葉百合的耐鹽基因，lpbhlh94，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

2、本發(fā)明的目的之二是提供一種重組表達(dá)載體，其由上述耐鹽基因lpbhlh94連入植物表達(dá)載體構(gòu)成。

3、作為一種優(yōu)選方案，所述植物表達(dá)載體為gv1300。

4、本發(fā)明的目的之三是提供一種重組農(nóng)桿菌細(xì)胞，其含有上述耐鹽基因lpbhlh94或者上述重組表達(dá)載體。

5、本發(fā)明的目的之四是提供一種轉(zhuǎn)基因煙草，其含有上述耐鹽基因lpbhlh94，或者上述重組表達(dá)載體，或者上述重組農(nóng)桿菌細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)如下方式獲得：利用rt-pcr克隆獲得細(xì)葉百合lpbhlh94基因含orf開(kāi)放閱讀框的部分核苷酸序列，通過(guò)同源重組獲得lpbhlh94-gv1300重組植物過(guò)表達(dá)載體；利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法侵染煙草，利用潮霉素篩選陽(yáng)性植株，采集陽(yáng)性植株葉片提取dna和rna，進(jìn)行分子水平鑒定；檢測(cè)得到lpbhlh94過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草。

6、本發(fā)明的目的之五是提供上述細(xì)葉百合耐鹽基因lpbhlh94在提高植物耐鹽特性中的應(yīng)用。

7、作為一種優(yōu)選方案，所述植物為煙草。

8、作為一種優(yōu)選方案，通過(guò)過(guò)表達(dá)耐鹽基因lpbhlh94，增強(qiáng)了煙草對(duì)鹽脅迫的耐受性。

9、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：

10、本發(fā)明提供了一種耐鹽基因lpbhlh94，通過(guò)克隆獲得該基因的全長(zhǎng)編碼序列。通過(guò)測(cè)定異源轉(zhuǎn)化煙草與野生煙草經(jīng)鹽脅迫處理前后生理生化指標(biāo)變化，發(fā)現(xiàn)該基因可賦予煙草鹽脅迫耐受性。表明lpbhlh94基因具有提高植物耐鹽特性的功能，對(duì)揭示細(xì)葉百合適應(yīng)高鹽生境的分子機(jī)制和培育耐鹽作物具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)葉百合耐鹽基因lpbhlh94其特征在于其核苷酸序列如seq?id?no.1所示，或者其編碼的氨基酸序列如seq?id?no?.2所示。

2.一種重組過(guò)表達(dá)載體，其特征在于，其包含權(quán)利要求1所述的細(xì)葉百合耐鹽基因lpbhlh94基因。

3.一種重組細(xì)胞，其特征在于，其包含權(quán)利要求2所述的重組過(guò)表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體為gv1300。

4.一種重組農(nóng)桿菌細(xì)胞，其特征在于，其含有權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2或3所述的重組表達(dá)載體。

5.一種轉(zhuǎn)基因煙草，其特征在于，其含有權(quán)利要求1所述基因，或者權(quán)利要求2或3所述的重組表達(dá)載體，或者權(quán)利所述4的重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。

6.細(xì)葉百合耐鹽基因lpbhlh94在提高植物耐鹽特性中的應(yīng)用，其特征在于，所述lpbhlh94基因的核苷酸序列和如seq?id?no.1所示，或者其編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為煙草。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)過(guò)表達(dá)耐鹽基因lpbhlh94，提高了煙草的耐鹽性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細(xì)葉百合（Lilium?pumilum）耐鹽基因LpbHLH94的克隆及其應(yīng)用。包括以下步驟：（1）目的基因的克??；（2）表達(dá)載體的構(gòu)建；（3）轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)的檢測(cè)。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以細(xì)葉百合為研究對(duì)象，應(yīng)用RT?PCR技術(shù)克隆LpbHLH94基因；通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草；通過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草鑒定LpbHLH94的過(guò)表達(dá)提高煙草鹽脅迫的功能，揭示細(xì)葉百合bHLH基因在受到逆境脅迫時(shí)有何功能，為細(xì)葉百合在百合育種的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能和作用提供理論依據(jù)。

技術(shù)研發(fā)人員：李佳,張紅鷹,張彥妮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東北林業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15