本發(fā)明涉及蛋白靶向領(lǐng)域，特別是涉及一種引導(dǎo)所連接的部分（例如目的蛋白）靶向葉綠體的多肽。

背景技術(shù)：

1、葉綠體是植物細胞中具有代表性的質(zhì)體，其最本質(zhì)的功能是進行光合作用，但還進行許多對植物細胞重要的其他生物合成過程。另外，葉綠體是農(nóng)藥行業(yè)的重要目標(biāo)之一，如已知許多除草劑通過阻斷葉綠體內(nèi)執(zhí)行的功能來發(fā)揮作用。

2、大多數(shù)葉綠體蛋白質(zhì)在植物細胞核中編碼，在細胞質(zhì)中合成前體蛋白質(zhì)，隨后被運輸至葉綠體。用于葉綠體定位的前體蛋白質(zhì)包括被稱為葉綠體轉(zhuǎn)運肽（ctp）的n-末端延伸物，所述n-末端延伸物可將目的蛋白靶向葉綠體。

3、雖然已開發(fā)出許多可以在作物中產(chǎn)生有益性狀的蛋白質(zhì)以及用于在細胞內(nèi)定位蛋白質(zhì)的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，但任何ctp和目的蛋白組合的有效亞細胞定位和加工的程度均難以預(yù)測，而定位和加工決定了目的蛋白的表達水平和功能，并且影響包含目的蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞、植物或種子的相應(yīng)表型。因此需要更多能夠?qū)⒛康牡鞍子行Фㄎ缓图庸さ男路fctp。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種新的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，所述葉綠體轉(zhuǎn)運肽具有葉綠體轉(zhuǎn)運活性，其可以將所連接的部分（例如目的蛋白）靶向葉綠體。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，具有seq?id?no:1所示的氨基酸序列。

3、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種核酸分子，包括：（1）具有編碼所述分離的多肽的核苷酸序列或其互補序列；或（2）具有seq?id?no:2所示的核苷酸序列或其互補序列。

4、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種融合蛋白，包含融合至目的蛋白的所述分離的多肽。

5、優(yōu)選的，所述分離的多肽在所述融合蛋白中處于所述目的蛋白的n-末端。

6、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述融合蛋白的編碼序列的表達盒。

7、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種dna構(gòu)建體或重組載體，包含所述表達盒。

8、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種將目的蛋白靶向植物葉綠體的方法，包括將所述融合蛋白的編碼序列導(dǎo)入植物中，使得所述目的蛋白定位于植物葉綠體。

9、優(yōu)選的，所述目的蛋白為修飾葉綠體中存在的生理過程的蛋白質(zhì)、非生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)或生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)。

10、進一步的，所述生理過程為光合作用、脂肪酸合成、氨基酸合成、油合成、類胡蘿卜素合成、類萜合成或淀粉合成。

11、進一步的，所述非生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)為除草劑耐受性蛋白質(zhì)；所述生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)為昆蟲抗性蛋白質(zhì)。

12、提供以下描述和定義是為了更好地限定本發(fā)明以及指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實踐本發(fā)明。除非另有說明，術(shù)語應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。

13、本發(fā)明中使用的冠詞“一個”和“一種”是指一個（種）或多于一個（種）（即至少一個）。例如，“一種要素”表示一種或多種要素（元件）。

14、本發(fā)明中術(shù)語“包含”或其變體，例如“包含了”、“包含著”或“包括”、“包括了”，是指包括所述的要素、整數(shù)或步驟，或成組的要素、整數(shù)或步驟，但是不排除任何其他要素、整數(shù)或步驟，或者成組的要素、整數(shù)或步驟。

15、本發(fā)明中術(shù)語“葉綠體”是指綠色植物和藻類等真核自養(yǎng)生物細胞中專業(yè)化亞單元的細胞器。其主要作用是進行光合作用，其中含有的光合色素葉綠素從太陽光捕獲能量，并將其存儲在能量儲存分子atp和nadph中，同時從水中釋放氧氣。然后，它們使用atp和nadph，在被稱為卡爾文循環(huán)的過程中從二氧化碳制造有機分子。葉綠體實施許多其它功能，包括植物的脂肪酸合成、很多氨基酸的合成和免疫反應(yīng)。

16、本發(fā)明中術(shù)語“葉綠體轉(zhuǎn)運肽”（ctp）是指介導(dǎo)與其相連的氨基酸序列（例如作為融合蛋白）靶向或定位于植物葉綠體的氨基酸序列。

17、本發(fā)明包括融合蛋白，即將編碼本發(fā)明葉綠體轉(zhuǎn)運肽的第一個核酸分子重組連接至編碼目的蛋白的笫二個核酸分子，使得核酸分子的翻譯產(chǎn)生融合蛋白。葉綠體轉(zhuǎn)運肽一般融合至目的蛋白的n-末端。融合蛋白可以由葉綠體轉(zhuǎn)運肽和目的蛋白組成，也可以包含葉綠體轉(zhuǎn)運肽和目的蛋白。在某些實施例中，葉綠體轉(zhuǎn)運肽優(yōu)選位于融合蛋白的n-末端，例如葉綠體轉(zhuǎn)運肽位于融合蛋白n-末端的1/2、n-末端的1/3或n-末端的1/4。但是，另外的氨基酸殘基可位于葉綠體轉(zhuǎn)運肽的n-末端，前提是融合蛋白至少部分地被靶向葉綠體。一般來說，大部分或全部葉綠體轉(zhuǎn)運肽在插入到葉綠體中時從融合蛋白上被切割下來。葉綠體轉(zhuǎn)運肽切割可以是均一的，使得融合蛋白群中的切割位點是相同的；葉綠體轉(zhuǎn)運肽切割也可以是非均一的，使得融合蛋白群中的切割位點變化1-10個氨基酸。葉綠體轉(zhuǎn)運肽能以多種方式重組融合至第二種蛋白。例如，可將限制性核酸內(nèi)切酶識別位點導(dǎo)入到葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列中對應(yīng)于其c-末端的位置，并可將相同或相容的位點導(dǎo)入目的蛋白核苷酸序列的n-末端。這些位點的設(shè)計需確保葉綠體轉(zhuǎn)運肽的編碼序列和笫二種蛋白按照“讀框”保持，以允許所述融合蛋白的合成。在某些情況下，優(yōu)選可在導(dǎo)入新限制位點時，去除第二種蛋白的起始子甲硫氨酸密碼子。通過重組dna技術(shù)在兩個親代分子上導(dǎo)入限制性內(nèi)切核酸酶識別位點及隨后將其連接，可導(dǎo)致在葉綠體轉(zhuǎn)運肽和第二種蛋白之間加入一個或多個額外的氨基酸。這一般不影響靶向活性，只要葉綠體轉(zhuǎn)運肽切割位點仍可及，并且在笫二種蛋白的n-末端加入這些額外的氨基酸并不改變其功能?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用基因合成或相似的方法，在葉綠體轉(zhuǎn)運肽和第二種蛋白（有或沒有其起始子甲硫氨酸）之間建立精確的融合。另外，融合蛋白可以包括切割位點下游的氨基酸。成熟蛋白n-末端的氨基酸可影響轉(zhuǎn)運肽將目的蛋白靶向葉綠體的能力和/或目的蛋白進入后的切割效力。目的蛋白可為需要定位葉綠體的任何多肽。目的蛋白可為全長蛋白（例如以其天然存在的形式），或者可為該蛋白的修飾形式（例如其部分或片段、變體或其它非天然形式的蛋白）。目的蛋白可來自任何生物，包括但不限于細菌、藻類、酵母、植物、動物以及合成蛋白。例如，可包含在融合蛋白中的目的蛋白包括但不限于修飾葉綠體中存在的生理過程的蛋白質(zhì)、非生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)和生物應(yīng)激抗性蛋白質(zhì)。所述修飾葉綠體中存在的生理過程（例如光合作用或脂肪酸、氨基酸、油、類胡蘿卜素、類萜、淀粉組成/合成）的蛋白質(zhì)，包括但不限于核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶、核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶活化酶、脂肪酸合酶、脂肪酸去飽和酶、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素去飽和酶、淀粉合酶和adp-葡萄糖焦磷酸化酶；所述非生物應(yīng)激（例如干旱、溫度、鹽度、臭氧和除草劑）抗性蛋白質(zhì)包括但不限于除草劑耐受性蛋白質(zhì)，如5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶（epsp合酶）、草甘膦n-乙酰轉(zhuǎn)移酶（gat）、乙酰乳酸合酶（als）、原卟啉原氧化酶（ppo）和羥基苯丙酮酸雙加氧酶（hppd）；所述生物應(yīng)激（例如病原體侵襲，包括昆蟲、病毒、細菌、真菌和線蟲類）抗性蛋白質(zhì)，包括但不限于昆蟲抗性蛋白質(zhì)，如bt毒素蛋白質(zhì)。當(dāng)不同的葉綠體轉(zhuǎn)運肽與不同的目的蛋白組合使用時，具有不同程度的效力（例如較高的靶向目的蛋白對非靶向目的蛋白比率）。

18、本發(fā)明術(shù)語“除草劑”是指用來殺死、控制或不利地調(diào)節(jié)植物生長的活性成分。該除草劑的優(yōu)選量或濃度是“有效劑量”或“有效濃度”，所述“有效劑量”或“有效濃度”足夠殺死相似的野生型植物、植物組織、植物細胞或宿主細胞，或者抑制其生長，但是所述“有效劑量”或“有效濃度”不殺死本發(fā)明具有除草劑耐受性/抗性的植物、植物組織、植物細胞或宿主細胞，或者不嚴重抑制其生長。一般地，除草劑的“有效劑量”或“有效濃度”是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中例行用來殺死目的雜草的量，這種量是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

19、本發(fā)明術(shù)語“除草劑耐受性”或“除草劑抗性”是可遺傳的，并允許植物在除草劑對給定植物進行一般除草劑有效處理的情況下生長和繁殖。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認可的，即使給定植物受到除草劑處理的一定程度損傷，如很少的壞死、溶解、萎黃或其它損傷，但至少沒有在產(chǎn)量上有顯著影響，仍可認為給定植物具有抵抗除草劑誘導(dǎo)的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物損傷。本發(fā)明中“賦予或增強植物的除草劑耐受性/抗性”是指向不具有除草劑耐受性/抗性的植物提供耐受性/抗性，和/或增強具有除草劑耐受性/抗性的植物的耐受性/抗性。除草劑耐受性可以是對特定除草劑的完全或部分不敏感性，并且可以表示為對特定除草劑的耐受性或不敏感性百分比（％）。

20、本發(fā)明術(shù)語“控制”和/或“防治”是指至少將有效劑量的除草劑直接施用(例如通過噴霧)到植物生長環(huán)境中，使雜草發(fā)育最小化和/或停止生長。同時，耕種的轉(zhuǎn)基因植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培育以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成；優(yōu)選地，與野生型植株相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產(chǎn)量。所述具有減弱的植物損傷，具體表現(xiàn)包括但不限于改善的莖稈抗性、和/或提高的籽粒重量等。其中，“雜草”是指在植物生長環(huán)境中與耕種的轉(zhuǎn)基因植物競爭的植物。

21、本發(fā)明中術(shù)語“昆蟲抗性蛋白質(zhì)”可以抑制（抑制生長、攝食、繁殖力或存活力）、遏制（遏制生長、攝食、繁殖力或存活力）、控制（控制害蟲侵擾、控制含有有效劑量的殺蟲蛋白質(zhì)在特定作物上的害蟲攝食活動）或殺死（引起發(fā)病、死亡或降低繁殖力）害蟲。對害蟲提供有效劑量的殺蟲蛋白質(zhì)，使所述害蟲暴露于所述殺蟲蛋白質(zhì)以導(dǎo)致發(fā)病、死亡、繁殖力降低或發(fā)育遲緩。“昆蟲抗性蛋白質(zhì)”還包括由于在植物中或在植物上提供有效劑量的殺蟲蛋白質(zhì)而將害蟲從植物、植物組織、植物部分、種子、植物細胞或從植物可能生長的特定地理位置中驅(qū)離。殺蟲蛋白質(zhì)可由植物產(chǎn)生，或可被施加于植物或植物所位于的位置內(nèi)的環(huán)境。

22、本發(fā)明中術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”或“核酸序列”在本發(fā)明中可互換地使用，包括涉及的單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物（例如肽核酸），因為它們以一種類似于天然存在的核苷酸的方式與單鏈核酸雜交。

23、本發(fā)明中術(shù)語“多肽”、“肽”、“蛋白”或“蛋白質(zhì)”在本發(fā)明中可互換地使用，是指氨基酸殘基的聚合物。所述氨基酸殘基的聚合物中的一個或多個氨基酸殘基是一個相應(yīng)的天然存在的氨基酸的一種人工化學(xué)類似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本發(fā)明的多肽可以重組產(chǎn)生，也可以通過化學(xué)合成。

24、本發(fā)明中術(shù)語“氨基酸”是指天然氨基酸、合成氨基酸以及以類似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸。氨基酸類似物包括但不限于經(jīng)過后來修飾的天然氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。在本發(fā)明中可以公知的3字母符號或iupac-iub生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號指代氨基酸。

25、本發(fā)明中術(shù)語“序列”是指核苷酸或氨基酸的順序排布。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因表達”、“蛋白質(zhì)表達”是指通過將dna分子轉(zhuǎn)錄為信使rna（mrna）并且將mrna翻譯為多肽鏈（其最終折疊為蛋白質(zhì)）以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

26、本發(fā)明中術(shù)語“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。本發(fā)明中所述“有效連接”包括葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼區(qū)和目的蛋白編碼區(qū)之間的功能性連接，其中ctp序列指導(dǎo)目的蛋白定位于植物葉綠體。通常，“有效連接”連接的兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)是連續(xù)的并且在相同的閱讀框中。本發(fā)明中所述“有效連接”還包括調(diào)控元件與目的蛋白的編碼序列相連，使得該目的蛋白的編碼序列的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)控元件控制和調(diào)控?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達功能的序列（即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子）、提供dna轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列（即t-dna邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點）、提供選擇性功能的序列（即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因）、提供可計分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列（即多接頭序列、位點特異性重組序列）和提供復(fù)制功能的序列（即細菌的復(fù)制起點、自主復(fù)制序列、著絲粒序列）。

27、本發(fā)明中術(shù)語“啟動子”是指位于轉(zhuǎn)錄起點上游和/或下游的區(qū)域或序列，其參與識別和結(jié)合rna聚合酶和其它蛋白，以啟動轉(zhuǎn)錄。啟動子包含轉(zhuǎn)錄起點附近的必需核酸序列，例如就聚合酶ii型啟動子來說包含tata元件。啟動子可選地還包含遠端增強子或阻抑子元件，其可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點多達數(shù)千個堿基對的位置?！敖M成型”啟動子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動子?！罢T導(dǎo)型”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動子。

28、本發(fā)明中術(shù)語“dna構(gòu)建體”是包含兩個或更多個異源的dna序列的重組dna分子。dna構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)基因表達并且可包含在載體和質(zhì)粒中。dna構(gòu)建體可用于載體中以用于轉(zhuǎn)化的目的，即將異源dna引入到宿主細胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞和植物，并且還可包含在轉(zhuǎn)基因細胞、植物或其部分、種子的質(zhì)粒dna或基因組dna中。“植物轉(zhuǎn)化載體”典型地含有包含t-dna轉(zhuǎn)移（如左邊界和右邊界）所需的順式作用序列的質(zhì)粒載體、經(jīng)工程改造成能夠在植物細胞中表達的選擇性標(biāo)記、和目的基因，此質(zhì)粒載體上也存在細菌復(fù)制所需的序列，將順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移到植物細胞中并在其中表達的方式進行排列。例如，所述選擇性標(biāo)記基因和殺有害生物基因位于左邊界和右邊界之間。如本領(lǐng)域所理解的，所述“植物轉(zhuǎn)化載體”含有允許通過農(nóng)桿菌感染植物細胞、以及通過在邊界序列切割進行dna的轉(zhuǎn)移和vir介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)移的毒力功能（vir基因）（hellens和mullineaux,?trends?in?plantscience,（2000）5：446-451）。

29、用于轉(zhuǎn)化宿主植物細胞的適合方法包括可將dna引入到細胞中（例如將重組dna構(gòu)建體穩(wěn)定地整合到植物染色體中）的任何方法是本領(lǐng)域熟知的。用于將重組dna構(gòu)建體引入到植物中的示例性的且廣泛利用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。用于將重組dna構(gòu)建體引入到植物中的另一種示例性方法是通過定點整合的方法將重組dna構(gòu)建體插入到預(yù)先確定的位點處的植物基因組中。定點整合可通過本領(lǐng)域已知的的任何方法來實現(xiàn)，例如通過使用鋅指核酸酶、工程化或天然大范圍核酸酶、tale內(nèi)切核酸酶、或rna指導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶（如crispr/cas9系統(tǒng)）來實現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植物可通過植物細胞培養(yǎng)方法從轉(zhuǎn)化的植物細胞再生。用于再生植物的方法在本領(lǐng)域也是熟知的。例如，已經(jīng)利用ti質(zhì)粒載體用于傳送外源dna，以及直接dna攝入、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射以及微彈。

30、本發(fā)明中術(shù)語“重組”是指由基因工程引起并且通常不存在于自然界中的非天然發(fā)生的dna、蛋白質(zhì)、細胞、種子或生物體?！爸亟Mdna分子”是指包含在自然界中非天然地發(fā)生并且由人類干預(yù)產(chǎn)生的dna分子，如由彼此異源的至少兩個dna分子構(gòu)成的dna分子。其中，“基因工程”是指創(chuàng)造通常不存在于自然界中并且需要施加人類干預(yù)的非天然dna、蛋白質(zhì)或生物體?；蚬こ炭捎糜谑褂蒙锛夹g(shù)，如分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、細菌轉(zhuǎn)化、以及植物轉(zhuǎn)化中的一種或多種技術(shù)以構(gòu)思并創(chuàng)造的工程dna、蛋白質(zhì)或生物體。

31、本發(fā)明中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指由于人類干預(yù)（例如植物轉(zhuǎn)化方法）合并入生物體基因組中的dna分子。

32、術(shù)語“天然”指天然出現(xiàn)的（“野生型”）核酸序列。

33、術(shù)語“異源”序列指源自外來來源或物種的序列，或者當(dāng)來自同一來源時指由其原始形式受到修飾的序列。

34、本發(fā)明包括與seq?id?no:1相關(guān)但在某些方面已被改變（例如其任意片段、或取代、缺失/添加一個或多個殘基）的變體多肽。具體的，變體多肽與未改變的多肽相比具有至少50%、60%、70%、75%、85%、90%、95%、97%、98％或99%的至少部分葉綠體轉(zhuǎn)運功能活性（例如將所連接的部分導(dǎo)入葉綠體中的能力）；或者，變體多肽與未改變的多肽相比具有相同或更佳的葉綠體轉(zhuǎn)運功能活性。一般來說，構(gòu)建變體多肽是為了加強葉綠體轉(zhuǎn)運肽或含葉綠體轉(zhuǎn)運肽的多肽的所需特征（例如增加靶向效力、賦予葉綠體特異性、使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯更有效）或降低其不需要的特征（例如降解敏感性）。可通過本領(lǐng)域已知的方法獲得不同的變體多肽。

35、本發(fā)明中術(shù)語“功能活性”或“活性”是指本發(fā)明葉綠體轉(zhuǎn)運肽將所連接的部分（例如目的蛋白）導(dǎo)入葉綠體的能力。當(dāng)連接至葉綠體轉(zhuǎn)運肽時，所連接的部分在葉綠體中富集（例如與未連接至葉綠體轉(zhuǎn)運肽的部分相比富集達至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%）。通常，將葉綠體轉(zhuǎn)運肽的活性與陽性對照（即已知靶向特定目的蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運肽）和/或陰性對照（即沒有葉綠體轉(zhuǎn)運肽或含無功能葉綠體轉(zhuǎn)運肽的多肽）對比。分析葉綠體轉(zhuǎn)運肽活性的實驗可包括但不限于在候選葉綠體轉(zhuǎn)運肽和目的蛋白之間建立重組融合，并在植物或植物細胞中表達融合蛋白。在一個實施方案中，融合蛋白僅在或基本上僅在葉綠體中起作用；因此，利用目的蛋白的功能性測定目的蛋白的定位，例如測定目的蛋白的酶活性。在另一個實施方案中，融合蛋白發(fā)熒光；因此，使用例如熒光顯微鏡，通過監(jiān)測葉綠體中的熒光累積，測定目的蛋白的定位。在另一個實施方案中，通過測定目的蛋白的大小確定目的蛋白的定位。?當(dāng)融合蛋白插入到葉綠體中時，葉綠體轉(zhuǎn)運肽通常完整或部分地被切下來。如果葉綠體轉(zhuǎn)運肽包含可及的切割位點作為融合蛋白的一部分，則葉綠體轉(zhuǎn)運肽將被切下，融合蛋白的長度將降低，并因此降低融合蛋白的分子量。如果切割位點的序列不容易接近（例如如果周圍的序列阻止切割位點的正確識別或者如果融合蛋白以使基質(zhì)蛋白酶不能接近切割位點的方式折疊），則切割將無效，并可能發(fā)生在一個或多個替代位置。盡管在此情況下經(jīng)加工的融合蛋白長度會稍微變化，但其仍比未經(jīng)加工的融合蛋白降低了長度和分子量。在另一個實施方案中，從植物組織中分離出葉綠體，然后分析目的蛋白的存在情況?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任意多肽檢測方法測試目的蛋白的存在情況，這些方法包括免疫印跡、免疫沉淀、elisa或檢測目的蛋白的性狀（例如熒光或酶活性）。

36、本發(fā)明所述葉綠體轉(zhuǎn)運肽可應(yīng)用于多種植物中，所述雙子葉植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘藍、胡蘿卜、芹菜、棉花、黃瓜、茄子、萵苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西葫蘆、蘿卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、擬南芥、花生或西瓜；優(yōu)選地，所述雙子葉植物是指黃瓜、大豆、擬南芥、煙草、棉花、花生或油菜。所述單子葉植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、黑麥、粟、甘蔗、燕麥或草坪草；優(yōu)選地，所述單子葉植物是指玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、粟、甘蔗或燕麥。

37、本發(fā)明中術(shù)語“植物”包括全株、植物地上部營養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)（例如葉、莖和塊莖）、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)（例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠）、種子（包括胚、胚乳和種皮）和果實（成熟子房）、植物組織（例如維管組織、基本組織等）和細胞（例如保衛(wèi)細胞、卵細胞、毛狀體等）及其子代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物類別一般來說可寬泛至可經(jīng)受遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和低等植物類別，包括被子植物（單子葉植物和雙子葉植物）、裸子植物、蕨類植物和多細胞藻類。其包括各種倍性水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。

38、本發(fā)明提供了一種新型葉綠體轉(zhuǎn)運肽，具有以下有益效果：

39、1、具有葉綠體轉(zhuǎn)運活性。本發(fā)明葉綠體轉(zhuǎn)運肽可以將其所連接的部分（例如目的蛋白）靶向葉綠體。

40、2、促進目的蛋白在葉綠體中富集。本發(fā)明葉綠體轉(zhuǎn)運肽可將一種或多種目的蛋白靶向葉綠體，以將其在葉綠體中富集。

41、下面通過實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。