本發(fā)明涉及家畜育種，具體為一種山羊cyp19a1基因indel標(biāo)記的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前養(yǎng)羊業(yè)由于養(yǎng)殖方式落后、生產(chǎn)基礎(chǔ)較差，目前養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展仍不能完全滿足市場(chǎng)需求。特別是在繁殖性能方面，繁殖性狀是一個(gè)極其復(fù)雜的數(shù)量性狀，受到多種生物學(xué)過(guò)程的共同調(diào)控。繁殖性能的高低直接影響?zhàn)B殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，因此，通過(guò)科學(xué)的方法提升肉羊的繁殖能力已成為我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的重要任務(wù)。

2、分子標(biāo)記輔助選擇育種(marker-assisted?selection,mas)是一種利用分子標(biāo)記來(lái)輔助選擇特定性狀的技術(shù)，是現(xiàn)代畜禽分子育種技術(shù)體系的重要組成部分。通過(guò)研究分子標(biāo)記，可以更準(zhǔn)確地選擇具有優(yōu)良性狀的個(gè)體，從而提高選育效率。插入/缺失多態(tài)性(insertion/deletion,indel)是指基因組序列中一段堿基出現(xiàn)小于50bp的插入或缺失的情況。indel標(biāo)記在檢測(cè)時(shí)具有快速性、簡(jiǎn)便性和可操作性的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為目前應(yīng)用較廣泛的分子標(biāo)記之一。

3、cyp19a1基因編碼芳香化酶，該酶催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，在生殖系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。在山羊等家畜中，cyp19a1基因的多態(tài)性與繁殖性能、生長(zhǎng)速度等經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)。研究表明，cyp19a1基因的變異會(huì)影響雌激素的合成，進(jìn)而影響動(dòng)物的繁殖性能和生長(zhǎng)發(fā)育。因此，通過(guò)識(shí)別cyp19a1基因內(nèi)的indel變異，可以為選育提供重要的遺傳信息。

4、盡管已有許多關(guān)于cyp19a1基因的研究，但大多數(shù)集中在snp位點(diǎn)上，而針對(duì)indel位點(diǎn)的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)有的一些方法雖然能夠檢測(cè)cyp19a1基因的多態(tài)性，但在實(shí)際應(yīng)用中存在一些不足，主要有：部分研究中的引物特異性不高，容易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；反應(yīng)條件如退火溫度、引物濃度等未進(jìn)行充分優(yōu)化，影響擴(kuò)增效果；電泳條件和內(nèi)標(biāo)校正未進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，可能導(dǎo)致結(jié)果的不一致性和誤差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種山羊cyp19a1基因indel標(biāo)記的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，通過(guò)高特異性引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化的pcr條件，精確檢測(cè)山羊cyp19a1基因內(nèi)的indel標(biāo)記，解決了現(xiàn)有技術(shù)中引物特異性不高、pcr條件未優(yōu)化、電泳分析不精確等問(wèn)題，該方法提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和一致性，擴(kuò)展了應(yīng)用范圍，為山羊分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了科學(xué)依據(jù)，從而提高繁殖性能和生長(zhǎng)速度，解決了上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種山羊cyp19a1基因indel標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

4、從健康山羊中采集血液樣本并提取出dna；

5、針對(duì)cyp19a1基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物；上游引物(f1)序列：5’-agtccctgacctgctgctg-3’，長(zhǎng)度：18bp，tm值59.6℃，下游引物(r1)序列：5’-gttggtgtgctgaggctga-3’，長(zhǎng)度：18bp，tm值60.1℃；

6、使用上述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

7、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)電泳結(jié)果判斷cyp19a1基因中的indel多態(tài)性位點(diǎn)位于第10005-10015位，插入序列為11個(gè)堿基；在201bp處呈現(xiàn)單一條帶為ii基因型，在201bp和189bp處各存在一條帶為id基因型，在189bp處呈現(xiàn)單一條帶為dd基因型。

8、優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μl，包含2×taq?plus?mastermixⅱ10μl；

9、上下游引物各0.8μl；

10、模板dna?1μl；

11、去離子水7.4μl。

12、優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序具體為：

13、95℃預(yù)變性3min；

14、95℃變性16s；

15、退火溫度從50℃到60℃，每間隔2.2℃進(jìn)行一次pcr擴(kuò)增；

16、72℃延伸31s，共33個(gè)循環(huán)；

17、72℃延伸5min；

18、pcr結(jié)束后4.2℃保存。

19、優(yōu)選的，所述使用熒光標(biāo)記的dntps參與pcr反應(yīng)，熒光染料至少為fam、hex和tamra中的一種，以便于后續(xù)自動(dòng)化的片段分析。

20、優(yōu)選的，所述pcr產(chǎn)物純化后去除未摻入的熒光標(biāo)記的dntps和其他雜質(zhì)，純化后的pcr產(chǎn)物加入內(nèi)標(biāo)，用于校正電泳過(guò)程中的片段長(zhǎng)度。

21、優(yōu)選的，所述瓊脂糖凝膠電泳分析具體為：

22、制備2.2％瓊脂糖凝膠，使用tae緩沖液；

23、點(diǎn)樣4μl?pcr產(chǎn)物，120v電壓電泳1.0-1.5h；

24、電泳后，在紫外光下觀察并拍照記錄結(jié)果。

25、優(yōu)選的，所述設(shè)置第二對(duì)引物作為備用擴(kuò)增，具體為：

26、上游引物(f2)：5’-tctgctgctgctgctgctg-3’

27、下游引物(r2)：5’-gctgctgctgctgctgctg-3’。

28、優(yōu)選的，所述引物濃度由0.2μm、0.4μm、0.8μm依次遞增，以找到最佳的引物濃度。

29、一種山羊cyp19a1基因indel標(biāo)記檢測(cè)方法的應(yīng)用，基于一種山羊cyp19a1基因indel標(biāo)記的檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)，所述cyp19a1基因indel標(biāo)記通過(guò)大量個(gè)體檢測(cè)以評(píng)估群體的遺傳多樣性，明確不同基因型在群體中的分布情況，為深度遺傳研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

30、優(yōu)選的，通過(guò)檢測(cè)所述cyp19a1基因indel標(biāo)記，篩選出與高繁殖性能相關(guān)的基因型；選擇該基因型的個(gè)體進(jìn)行繁殖，以提高后代的繁殖性能和生長(zhǎng)速度；依據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況中需要改善的繁殖性狀，選擇合適的基因型親本進(jìn)行遺傳選育，加快山羊良種選育速度。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

32、1、本發(fā)明設(shè)計(jì)了一對(duì)高特異性的引物，確保pcr擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，上游引物和下游引物的序列經(jīng)過(guò)精心選擇，能夠精確地?cái)U(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，避免非特異性擴(kuò)增，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；為了應(yīng)對(duì)可能的擴(kuò)增失敗情況，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了備用引物對(duì)，確保實(shí)驗(yàn)的成功率。

33、2、通過(guò)優(yōu)化pcr反應(yīng)條件，提高了擴(kuò)增效率，確保了擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量；通過(guò)梯度退火溫度實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的退火溫度，確保pcr擴(kuò)增的特異性和效率；通過(guò)設(shè)置詳細(xì)的電泳條件和內(nèi)標(biāo)校正步驟，確保了結(jié)果的一致性和可靠性，減少了誤差；該方法不僅適用于特定品種，還可以推廣到其他山羊品種，提高了普適性和應(yīng)用價(jià)值。

34、3、本發(fā)明通過(guò)對(duì)所提出方法的應(yīng)用，使cyp19a1基因indel標(biāo)記通過(guò)大量個(gè)體檢測(cè)實(shí)現(xiàn)評(píng)估群體的遺傳多樣性的效果，明確不同基因型在群體中的分布情況，為深度遺傳研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；篩選出與高繁殖性能相關(guān)的基因型，選擇這些基因型的個(gè)體進(jìn)行繁殖，加快優(yōu)良性狀的傳遞，可顯著提高后代的繁殖性能和生長(zhǎng)速度，縮短育種周期，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

35、4、本發(fā)明具有簡(jiǎn)單快速的操作流程，適合大規(guī)模應(yīng)用。整個(gè)流程從樣本采集到最終結(jié)果分析，操作簡(jiǎn)便，易于實(shí)施，適合大規(guī)模應(yīng)用；使用標(biāo)準(zhǔn)的dna提取試劑盒和常規(guī)pcr試劑，降低了檢測(cè)成本。