本發(fā)明屬于蘿卜硫素的核酸適配體篩選，具體涉及一種捕獲-指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（capture-selex）技術(shù)體外篩選的蘿卜硫素核酸適配體及其性能分析。

背景技術(shù)：

1、

2、西蘭花作為十字花科蔬菜，因其富含多種功能物質(zhì)而備受關(guān)注。其中，蘿卜硫素（sulforaphane，sfn）是西蘭花中最重要的活性成分之一，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒以及治療代謝類疾病等多種功效。然而，蘿卜硫素雖然生物利用率高，但其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，易降解和揮發(fā)，這極大地限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種能夠高效識(shí)別和穩(wěn)定遞送蘿卜硫素的技術(shù)具有重要意義。

3、適配體是一類通過體外篩選技術(shù)（如selex）獲得的單鏈dna或rna分子，能夠以親和力對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識(shí)別。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體具有保存期長(zhǎng)、批次間差異小、免疫原性低或無、易于化學(xué)修飾以提高穩(wěn)定性和親和力等顯著優(yōu)勢(shì)。目前，適配體已在疾病治療、藥物開發(fā)、靶標(biāo)遞送和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力。然而，盡管適配體技術(shù)發(fā)展迅速，但針對(duì)蘿卜硫素的適配體研究仍處于空白。

4、因此，為了避免蔬菜尾葉的浪費(fèi)，亟需一種利用尾菜資源制備蘿卜硫素核酸適配體的方法，以提供高穩(wěn)定性的蘿卜硫素產(chǎn)品，高效率地將蘿卜硫素遞送到靶組織。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的蘿卜硫素靶向遞送不穩(wěn)定的技術(shù)問題，而提供一種capture-selex技術(shù)體外篩選的蘿卜硫素核酸適配體，并給出了其性能分析方法。

2、本發(fā)明的目的之一在于，提供了capture-selex技術(shù)體外篩選的蘿卜硫素核酸適配體，所述蘿卜硫素核酸適配體的核苷酸序列如seq?id?no.1或/和seq?id?no.2所示。

3、本發(fā)明提供了capture-selex技術(shù)對(duì)小分子靶標(biāo)的篩選及測(cè)定蘿卜硫素候選序列親和力。根據(jù)蘿卜硫素本身特性，本發(fā)明利用捕獲-selex（capture-selex）篩選蘿卜硫素的核酸適配體，以篩選出高性能的核酸適配體，并通過熒光法測(cè)定候選序列，得到核酸適配體序列為sfn-seq1000和sfn-seq1474。

4、本發(fā)明的目的之二在于，提供了蘿卜硫素核酸適配體的體外篩選方法，包括以下步驟：

5、步驟1，利用capture-selex方法對(duì)蘿卜硫素核酸適配體初始文庫(kù)進(jìn)行12輪篩選，篩選過程中通過降低蘿卜硫素濃度而提高核酸適配體親和力，模擬序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，挑選出6條候選核酸適配體；

6、步驟2，在6條候選核酸適配體的5′端分別修飾fam熒光標(biāo)記，在6條候選核酸適配體互補(bǔ)鏈cdna的3′端分別修飾dabcyl淬滅基團(tuán)，然后使用熒光淬滅-恢復(fù)法對(duì)候選核酸適配體進(jìn)行親和力測(cè)定，獲得兩條親和力高的核酸適配體sfn-seq1000和sfn-seq1474。

7、本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)方案如下：

8、進(jìn)一步的，所述蘿卜硫素核酸適配體初始文庫(kù)的核苷酸序列為ggaggctctcgggacgac-n30-gtcgtcccgatgctgcaatcgtaa。

9、所述步驟1中，蘿卜硫素濃度降低依次為：1?mm、0.5?mm、0.2?mm、0.16?mm，挑選出的6條候選序列為sfn-seq1，sfn-seq101、sfn-seq144、sfn-seq986、sfn-seq1000、sfn-seq1474。

10、所述步驟2中，5′-fam熒光標(biāo)記的核酸適配體的激發(fā)波長(zhǎng)為490?nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520?nm，發(fā)射光顏色為綠色。

11、所述步驟1的具體操作如下：

12、步驟1.1，靶標(biāo)與文庫(kù)孵育—將蘿卜硫素核酸適配體初始文庫(kù)與捕獲鏈cdna按照濃度比1：5混合，并充分偶聯(lián)到瓊脂糖微球上；使用1×緩沖溶液（5ml?2×pbs；4.5?ml超純水；500?μl?dmso）清洗瓊脂糖柱，清洗10次，標(biāo)記最后一次為wash；之后使用250?μl的蘿卜硫素溶液進(jìn)行洗脫，共三次，收集三次洗脫液，即為正篩洗脫液；

13、步驟1.2，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr（qpcr）監(jiān)控每輪篩選出單鏈dna的物質(zhì)的量—通過不同濃度的文庫(kù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表從高到低的濃度點(diǎn)，縱坐標(biāo)表示為ct值（qpcr循環(huán)數(shù)）的平均值，計(jì)算步驟1.1中所得到洗脫液的文庫(kù)結(jié)合比，利用ftc-3000軟件得到wash100（wash稀釋100倍）、w1000（wash稀釋1000倍）、正篩100（正篩洗脫液稀釋100倍），正篩1000（正篩洗脫液稀釋1000倍）的值，利用公式得到文庫(kù)結(jié)合比=正篩100×100%或正篩1000×100%（選擇正篩100或正篩1000需要根據(jù)每輪qpcr的結(jié)果確定）；

14、步驟1.3，小規(guī)模pcr擴(kuò)增—將步驟1.1中的洗脫液放入濾管中，14000?rpm，5?min，濃縮至100?μl，將濃縮液進(jìn)行小規(guī)模的擴(kuò)增，跑電泳，并確定最佳循環(huán)數(shù)；

15、樣品配置：10?μl?2×premix?taq?hot?start，2?μl?正向引物fp(5?μm)，2?μl?反向引物rp(5?μm)，4?μl?rnase-free-water，2?μl?樣品；擴(kuò)增階段：?95?℃預(yù)處理59?s；92℃?30?s；61?℃?30?s；72?℃?30?s；選取三個(gè)不同循環(huán)數(shù)擴(kuò)增；

16、步驟1.4，大規(guī)模pcr擴(kuò)增—根據(jù)小規(guī)模pcr的跑膠情況選取最佳擴(kuò)增輪數(shù)進(jìn)行大規(guī)模pcr；

17、步驟1.5，制備dna單鏈—用鏈霉親和素修飾的磁珠捕獲pcr擴(kuò)增結(jié)果中的雙鏈dna，500?μl?1×?pb緩沖液清洗磁珠3次，用100?μl?200?mm?naoh浸泡捕獲雙鏈dna的磁珠，在混均儀上孵育30?min，收集上清液，再將磁珠中加入100?μl?200?mm?naoh進(jìn)行二次洗脫，最后加入?1?m?hcl中和至ph=7.2。

18、所述步驟2的具體操作如下：

19、步驟2.1，模擬高通量測(cè)序結(jié)果的二級(jí)結(jié)構(gòu)，挑選出6條候選序列，其具體操作如下：

20、將12輪的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物（雙鏈）濃縮（即r12），將濃縮物送生工生物工程有限公司高通量測(cè)序。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，取r12（篩選12輪后獲得的文庫(kù)）前100條序列進(jìn)行kmer（長(zhǎng)度為k的dna片段）拼接分析；模擬核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。挑選出6條候選序列，分別是：sfn-seq-1，sfn-seq-101，sfn-seq-144，sfn-seq-986，sfn-seq-1000，sfn-seq-1474；

21、步驟2.2，基于fam熒光法對(duì)6條候選序列進(jìn)行親和力測(cè)定，得到兩條有較高親和力的核酸適配體sfn-seq1000和sfn-seq1474，其核酸序列為：

22、5′-ggaggctctcgggacgacggcagtcgtacttcgtttcggatgaccgacgtcgtcccgatgctgcaatcgtaa-3′和

23、5′-ggaggctctcgggacgaccgtagtgtgttctcagcgtttacacgtcgagtcgtcccgatgctgcaatcgtaa-3′。

24、進(jìn)一步的，所述核酸適配體sfn-seq1000、sfn-seq1474的熒光恢復(fù)率分別為6.68%?和3.31?%。

25、本發(fā)明的目的之三在于，提供了上述方法構(gòu)建的高親和力蘿卜硫素核酸適配體作為綠色添加劑在高效識(shí)別和/或穩(wěn)定靶向遞送蘿卜硫素中的應(yīng)用。

26、綜上可知，本發(fā)明利用capture-selex方法篩選蘿卜硫素的核酸適配體，并利用熒光法對(duì)候選序列進(jìn)行親和力測(cè)定，獲得兩種高親和力的蘿卜硫素核酸適配體，本發(fā)明篩選出的蘿卜硫素核酸適配體作為綠色添加劑，用于高效識(shí)別和穩(wěn)定靶向遞送蘿卜硫素。

27、本發(fā)明首次利用capture-selex方法篩選蘿卜硫素的核酸適配體，不僅填補(bǔ)了關(guān)于蘿卜硫素核酸適配體研究的空白，還提供了與蘿卜硫素具有親和力的核酸適配體，應(yīng)用于蘿卜硫素傳感器研發(fā)，通過該核酸適配體穩(wěn)定地將蘿卜硫素靶向遞送到靶組織。

28、本發(fā)明利用capture-selex技術(shù)篩選蘿卜硫素核酸適配體，并利用熒光法對(duì)候選序列親和力測(cè)定。其篩選及測(cè)定過程包括：使用3’端biotin-teg修飾的核酸適配體的互補(bǔ)序列（cdna）與文庫(kù)（pool）熱處理，形成pool-cdna復(fù)合物；利用蘿卜硫素溶液對(duì)復(fù)合物進(jìn)行正向篩選，靶標(biāo)蘿卜硫素與核酸適配體結(jié)合，核酸適配體空間構(gòu)象變化導(dǎo)致文庫(kù)與cdna分離；利用qpcr監(jiān)測(cè)篩選過程；引入含有biotin修飾的下游引物對(duì)文庫(kù)pcr擴(kuò)增；利用鏈霉親和素磁珠制備單鏈；單鏈重新投入下一輪篩選；將12輪富集的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序利用；利用dnafold分析核酸適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)并挑選6條候選序列；3’端dabcyl修飾的cdna、5’端fam熒光修飾的適配體（apt）和蘿卜硫素孵育，根據(jù)熒光淬滅和恢復(fù)情況測(cè)定核酸適配體親和力。得到2條具有較高親和力的核酸適配體序列sfn-seq1000和sfn-seq1474，其熒光恢復(fù)率分別是：6.68?%?和3.31?%。