本發(fā)明屬于植物基因工程，涉及ghlog8蛋白及其編碼基因在調(diào)控陸地棉抗黃萎病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、陸地棉（ gossypium?hirsutum?l.）屬于錦葵科（ malvaceae）棉屬（ gossypium），棉花纖維是紡織工業(yè)的主要原材料，同時(shí)棉籽還提供了大量的棉籽油和棉籽蛋白，在國家經(jīng)濟(jì)中占據(jù)極其重要的地位（wei?f,?zhao?l,?xu?x,?et?al.?cultivar-dependentvariation?of?the?cotton?rhizosphere?and?endosphere?microbiome?under?fieldconditions[j].?front?plant?sci,?2019,?10:?1659）。黃萎病作為棉花生長中最重要的病害，被稱為“棉花癌癥”，不僅會(huì)造成植株葉片脫落，還可造成棉花嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重威脅棉花安全生產(chǎn)（朱荷琴;李志芳;馮自力;馮鴻杰;魏鋒;趙麗紅;師勇強(qiáng);劉世超;周京龍;.我國棉花黃萎病研究十年回顧及展望[j].棉花學(xué)報(bào),2017(s1):45-58）。黃萎病是土傳性維管束病害，寄主范圍很廣，可侵染600多種植物，主要作用于雙子葉植物（chen?j?y,liu?c,?gui?y?j,?et?al.?comparative?genomics?reveals?cotton-specific?virulencefactors?in?flexible?genomic?regions?in?verticillium?dahliae?and?evidence?ofhorizontal?gene?transfer?from?fusarium[j].?new?phytol,?2018,?217(2):?756-770）。其病原菌為大麗輪枝菌，其破壞性最強(qiáng)，分布廣（r.?gams?zare.gibellulopsis,?asuitable?genus?for?verticillium?nigrescens,?and?musicillium,?a?new?genus?forv.?theobromae[j].nova?hedwigia,2007(3-4):463-489）。該病原菌以微菌核形式在土壤中存活時(shí)間長達(dá)數(shù)十年之久（zhang?d?d,?wang?j,?wang?d,?et?al.?populationgenomics?demystifies?the?defoliation?phenotype?in?the?plant?pathogen ? verticillium?dahliae[j].?new?phytol,?2019,?222(2):?1012-1029）。在適宜的溫度和土壤條件下，迅速侵染棉花的根部，并沿著維管束擴(kuò)散，導(dǎo)致植物的營養(yǎng)運(yùn)輸受阻，最終引發(fā)葉片脫落和嚴(yán)重減產(chǎn)（康立茹,?劉燕,?楊永峰,?等.?大麗輪枝菌及其致病機(jī)制的研究進(jìn)展?[j].?現(xiàn)代農(nóng)業(yè),?2022,?(03):49-51）。 2、黃萎病的侵染機(jī)制復(fù)雜，通過篩選抗病基因增強(qiáng)棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性（congl,?ran?fa,?cox?d,?lin?s,?barretto?r,?habib?n,?hsu?pd,?wu?x,?jiang?w,marraffini?la,?zhang?f.?multiplex?genome?engineering?using?crispr/cassystems.?science,?2013,?339(6121):?819-23），不僅能夠減少病原菌的侵染和擴(kuò)散，還可以提升棉花的抗逆性和產(chǎn)量。而crispr-cas9基因編輯技術(shù)為這一研究提供了新的切入點(diǎn)（wei?g?,?lu?l?,?xinquan?t?,et?al.genome?editing?in?cotton?with?the?crispr/cas9?system[j].frontiers?in?plant?science,?2017,?8:1364）。crispr/cas9系統(tǒng)可精準(zhǔn)編輯棉花相關(guān)抗病基因，為培育高抗棉花品種提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持（liu?d,?hu?r,palla?kj,?tuskan?ga,?yang?x.?advances?and?perspectives?on?the?use?of?crispr/cas9?systems?in?plant?genomics?research.?curr?opin?plant?biol,?2016,?30:?70-77）。此外，該系統(tǒng)通過產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳突變，實(shí)現(xiàn)無cas9和篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株，大大簡化棉花育種流程和期限（zhang?y,?liang?z,?zong?y,?wang?y,?liu?j,?chen?k,?qiu?jl,gao?c.?efficient?and?transgene-free?genome?editing?in?wheat?through?transientexpression?of?crispr/cas9?dna?or?rna.?nat?commun,?2016,?7:?12617）。3、病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced?gene?silencing,?vigs）是植物體內(nèi)普遍存在的一種遺傳免疫機(jī)制，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默。當(dāng)攜帶含有內(nèi)源基因片段的病毒載體侵染寄主植物后，能夠激活植物自身的免疫系統(tǒng)；在識(shí)別并降解病毒rna的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生含內(nèi)源目的基因的microrna，這些microrna與靶基因的mrna結(jié)合，之后被dicer酶降解，從而使目的基因表達(dá)水平下降或功能喪失。其中由煙草脆裂病毒（tobacco?rattle?virus,?trv）誘導(dǎo)的基因沉默（trv-?vigs），以其沉默效率高、持續(xù)時(shí)間長，寄主植物病毒癥狀輕，不會(huì)掩蓋沉默表型，且在各種組織均可產(chǎn)生基因沉默等優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最為廣泛的一類基因沉默體系。trv-vigs已在茄屬的番茄、煙草、辣椒、擬南芥、麻風(fēng)樹、矮牽牛等植物上成功應(yīng)用。植物 cla1基因編碼1-deoxyxylulose?5-phosphate?synthase，參與葉綠體發(fā)育過程，進(jìn)化中高度保守，cla1基因突變體 cla1-1有明顯的白化表型，是易于識(shí)別的標(biāo)記性狀。棉花是世界性重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年來，已有trv-vigs體系構(gòu)建與應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。以雷蒙德氏棉 cla1基因序列設(shè)計(jì)目標(biāo)沉默片段，gao等建立了基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花trv-vigs體系，并在不同遺傳背景的6個(gè)棉花品種材料中成功應(yīng)用，為棉花重要基因功能的鑒定奠定了基礎(chǔ)（gao?x?,?britt?r?c?,?shan?l?,he?p.?agrobacterium-mediated?virus-induced?genesilencing?assay?in?cotton[j].j?vis?exp,?2011(54):e2938-e2938）。進(jìn)一步通過trv病毒抑制棉花抗黃萎病相關(guān)基因 ghndr1和 ghmkk2表達(dá)，使棉花受體更易感病，快速鑒定了基因功能（gao?x,?wheeler?t,?li?z,?kenerley?cm,?he?p,?shan?l.?silencing?ghndr1and?ghmkk2?compromises?cotton?resistance?to?verticillium?wilt[j].plantjournal,?2011,?66(2):293-305）。然而，trv-vigs能否廣泛應(yīng)用于棉花各品種，即該體系是否受寄主基因型的影響還不清楚，未見相關(guān)研究報(bào)道。隨著棉花基因組研究取得快速進(jìn)展，大量的棉花表達(dá)序列信息已在公共數(shù)據(jù)庫釋放，大量棉花重要基因的功能需進(jìn)一步鑒定。 4、近年來，對(duì)負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性關(guān)鍵基因的挖掘和功能解析取得了重要的進(jìn)展。在病原菌侵染過程中，油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白激酶bin2可抑制茉莉酸（ja）途徑相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性（song?y,?zhai?y,?li?l,?et?al.bin2?negatively?regulates?plant?defence?against?verticillium?dahliae?inarabidopsis?and?cotton[j].?plant?biotechnology?journal,?2021,?19(10):?2097-2112）。 ghcpk33編碼的鈣依賴性蛋白激酶在鈣信號(hào)通路中發(fā)揮作用，病原菌侵染激活該基因后，干擾絲裂原活化蛋白激酶（mapk）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制抗病基因表達(dá)，降低棉花對(duì)黃萎病菌的抗性（hu?q,?zhu?l,?zhang?x,?et?al.?ghcpk33?negatively?regulates?defenseagainst?verticillium?dahliae?by?phosphorylating?ghopr3[j].?plant?physiology,2018,?178(2):?876-889）。 ghabc是編碼atp結(jié)合盒（abc）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。沉默 ghabc后，相關(guān)代謝物的積累增強(qiáng)，棉花表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性（malik?w?a,?afzal?m,?chen?x,?et?al.systematic?analysis?and?comparison?of?abc?proteins?superfamily?conferstructural,?functional?and?evolutionary?insights?into?four?cotton?species[j].industrial?crops?and?products,?2022,?177:?114433）。 ghapx1編碼抗壞血酸過氧化物酶，當(dāng)病原菌引起活性氧爆發(fā)時(shí)， ghapx1的高表達(dá)會(huì)過度清除ros，從而削弱棉花抗黃萎病能力（ma?l,?zhang?t,?zhu?q?h,?et?al.?hsp70?and?apx1?play?important?roles?incotton?male?fertility?by?mediating?ros?homeostasis[j].?international?journalof?biological?macromolecules,?2024,?278:?134856）。 ghhda5編碼組蛋白去乙?；?，通過去除基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙?；揎棧淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而抑制關(guān)鍵抗病基因的表達(dá)，并干擾ja信號(hào)通路（wei?c,?wang?c,?zhang?x,?et?al.histone?deacetylase?ghhda5?negatively?regulates?verticillium?wilt?resistancein?cotton[j].?plant?physiology,?2024,?196(4):?2918-2935）。 ghiqm1是鈣信號(hào)途徑中的調(diào)節(jié)因子，其通過負(fù)調(diào)控水楊酸（sa）途徑，降低抗病信號(hào)通路的效率（li?m?j,?lei?j?f,zulipiye?t,?et?al.?cloning?and?functional?verification?of?ghiqm1?gene?ofcotton?in?response?to?verticillium?wilt[j].?2022）。綜上所述，對(duì)這些負(fù)調(diào)控基因的深入研究不僅加深了對(duì)棉花抗黃萎病分子機(jī)制的理解，也為培育高抗性棉花品種提供了潛在的分子靶點(diǎn)，可以從根本上防控棉花黃萎病的危害，加速抗黃萎病棉花品種選育，促進(jìn)商業(yè)化棉花育種進(jìn)程，有效解決生產(chǎn)中抗病品種匱乏的問題。通過遺傳手段改良棉花的黃萎病抗性不但是最經(jīng)濟(jì)有效的解決辦法，而且對(duì)于保證棉花的品質(zhì)和高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要的意義，同時(shí)在棉花分子育種領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。 技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路1、本試驗(yàn)室前期通過對(duì)接種大麗輪枝菌的植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因（degs）。通過生物信息學(xué)分析錨定棉花細(xì)胞分裂素核苷酸水解酶log8（ ghlog8，xm_016827497.2）。該基因是一個(gè)在植物界尚未有功能報(bào)道的基因，其編碼序列長度918?bp，編碼305個(gè)氨基酸。 2、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何利用上述棉花細(xì)胞分裂素核苷酸水解酶log8及其編碼基因調(diào)控陸地棉的抗病性（如提高或降低陸地棉的黃萎病抗性）。3、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：4、本發(fā)明第一方面提供了降低蛋白質(zhì)含量和/或活性的應(yīng)用，所述應(yīng)用為下述任一種：5、a1）在提高陸地棉黃萎病抗病性中的應(yīng)用；6、a2）在制備提高陸地棉黃萎病抗病性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；7、a3）在培育抗黃萎病的陸地棉中的應(yīng)用；8、a4）在制備培育抗黃萎病的陸地棉的產(chǎn)品中的應(yīng)用；9、a5）在陸地棉的抗黃萎病育種或陸地棉抗黃萎病種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用；10、所述蛋白質(zhì)名稱為ghlog8，滿足以下條件：11、b1）氨基酸序列是seq?id?no.1的蛋白質(zhì)；12、b2）在b1）的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。13、上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)ghlog8可來源于棉花。14、進(jìn)一步地，所述蛋白質(zhì)ghlog8可來源于陸地棉。15、進(jìn)一步地，所述蛋白質(zhì)ghlog8可為棉花抗病相關(guān)蛋白ghlog8，具體可為棉花抗黃萎病相關(guān)蛋白ghlog8。16、為了使b1）中的蛋白質(zhì)便于純化或檢測(cè)，可在由序列表中seq?id?no?.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接標(biāo)簽蛋白。17、所述標(biāo)簽蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白、his6標(biāo)簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、egfp(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)、ecfp(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)、eyfp(增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標(biāo)簽蛋白。18、本發(fā)明第二方面提供了與所述蛋白質(zhì)ghlog8相關(guān)的生物材料的應(yīng)用，所述應(yīng)用為下述任一種：19、d1）在提高陸地棉黃萎病抗病性中的應(yīng)用；20、d2）在制備提高陸地棉黃萎病抗病性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；21、d3）在培育抗黃萎病的陸地棉中的應(yīng)用；22、d4）在制備培育抗黃萎病的陸地棉的產(chǎn)品中的應(yīng)用；23、d5）在陸地棉的抗黃萎病育種或陸地棉抗黃萎病種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用；24、所述生物材料為下述e1）至e7）中的任一種：25、e1）抑制或降低所述蛋白質(zhì)ghlog8的編碼基因表達(dá)的核酸分子；26、e2）含有e1）所述核酸分子的表達(dá)盒；27、e3）含有e1）所述核酸分子的重組載體、或含有e2）所述表達(dá)盒的重組載體；28、e4）含有e1）所述核酸分子的重組微生物、或含有e2）所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有29、e3）所述重組載體的重組微生物；30、e5）含有e1）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有e2）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有e3）所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；31、e6）含有e1）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有e2）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；32、e7）含有e1）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有e2）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官。33、上述應(yīng)用中，蛋白質(zhì)ghlog8編碼基因（cds）的核苷酸序列是seq?id?no?.2所示的核苷酸序列。34、本發(fā)明第三方面提供了一種培育抗黃萎病植物的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白質(zhì)ghlog8的含量和/或活性，得到黃萎病抗病性高于所述目的植物的抗病植物，所述植物為陸地棉。35、上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)ghlog8的含量和/或活性通過降低目的植物中所述蛋白質(zhì)ghlog8的編碼基因的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)。36、上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)ghlog8的編碼基因的表達(dá)量為利用基因敲減技術(shù)或基因敲除技術(shù)使目的植物基因組中所述蛋白質(zhì)ghlog8的編碼基因的表達(dá)量下降。37、上述方法中，所述利用基因沉默技術(shù)使目的植物基因組中所述蛋白質(zhì)ghlog8的編碼基因的表達(dá)量下降是利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體進(jìn)行，所述病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體是通過將seq?id?no?.2所示的核酸分子正向整合到基于煙草脆裂病毒的質(zhì)粒載體構(gòu)建得到的重組載體。38、上述方法中，所述利用基因沉默技術(shù)使目的植物基因組中所述蛋白質(zhì)ghlog8的編碼基因的表達(dá)量下降是利用crispr/cas9載體進(jìn)行，所述crispr/cas9載體是基于所述編碼基因的雙靶位點(diǎn)sgrna1：tccaagacagtatatgatggagg和sgrna2：gcatgagcgcaaagctgcaatgg構(gòu)建得到的重組載體。39、本發(fā)明的有益效果：40、本發(fā)明的ghlog8蛋白及其編碼基因可以調(diào)控陸地棉的抗病性（如黃萎病抗性），通過降低目的植物中g(shù)hlog8蛋白質(zhì)的含量和/或活性（如抑制、沉默或干擾ghlog8基因的表達(dá)）可以顯著提高目的植物的抗病性。因此，棉花抗黃萎病相關(guān)蛋白ghlog8及其編碼基因在調(diào)控陸地棉抗病性中具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值，本發(fā)明對(duì)培育抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花具有重要意義。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12