表征漿細(xì)胞相關(guān)疾病的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種表征患者的漿細(xì)胞相關(guān)疾病的方法，所述方法包括：(i)提供來自所述患者的至少一個(gè)樣品；(ii)在所述樣品中確定以下參數(shù)的兩個(gè)或更多個(gè)：(a)κ:λ游離輕鏈(FLC)比例，(b)結(jié)合至一類重鏈的κ輕鏈:結(jié)合至相同類別的重鏈的λ輕鏈的比例(HLCκ:HLCλ比例)，(c)所述樣品中FLC的總量，和(d)結(jié)合至所述重鏈類別的κ輕鏈加上結(jié)合至相同重鏈類別的λ輕鏈的總量(總HLC)；(iii)將來自(a)、(b)、(c)和/或(d)的每個(gè)比例或量與預(yù)定值進(jìn)行比較，并且對每個(gè)量或比例指定評分；以及(iv)利用所述評分表征所述漿細(xì)胞相關(guān)疾病。本發(fā)明還提供配置為進(jìn)行本發(fā)明的方法的裝置。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含以下的組合：(i)抗κFLC特異性抗體或其片段和抗λFLC特異性抗體或其片段，以及(ii)抗κ重鏈類別特異性抗體或其片段和抗λ重鏈類別特異性抗體或其片段，任選地混合在一起。
【專利說明】表征漿細(xì)胞相關(guān)疾病的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種改良的表征患者的漿細(xì)胞疾病的方法以及進(jìn)行所述方法的裝置 和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 申請人:已研究游離輕鏈作為測定患者廣泛的單克隆丙種球蛋白病的一種方式許 多年。這類游離輕鏈在診斷中的用途在書"Serum Free Light Chain Analysis, Sixth Edition(2008)A. R.Bradwell, ISBN 9780704427969"中詳細(xì)綜述。多克隆異常也是已知的， 其中患者有減少或增加的多克隆抗體生成。
[0003] 抗體包含重鏈和輕鏈。它們通常具有雙重對稱性，并且由兩條相同的重鏈和兩條 相同的輕鏈組成，每條包含可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。每個(gè)輕鏈/重鏈對的可變結(jié)構(gòu)域組合 形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而兩條鏈均促成抗體分子的抗原結(jié)合特異性。輕鏈有兩種類型，κ 和λ，并且任何給定抗體分子均具有任一種輕鏈，但不會(huì)具有兩種。在人中產(chǎn)生的K分子 是λ分子的大約兩倍，但是這在一些哺乳動(dòng)物中不同。通常輕鏈附著至重鏈。但是，在個(gè) 體的血清或尿中可檢測到一些未附著的"游離輕鏈"（FLC)。游離輕鏈可以通過產(chǎn)生針對 游離輕鏈表面的抗體來特異性地鑒定，游離輕鏈表面通常通過輕鏈與重鏈的結(jié)合而隱藏。 在游離輕鏈中，這種表面被暴露，從而允許其免疫檢測?？缮藤彽挠糜跈z測κ或λ游離 輕鏈的試劑盒包括例如 The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdom 制造的 "Freelite?"。 申請人:以前已鑒定測量游離κ、游離λ和/或游離κ/游離λ比例，允許 檢測患者的單克隆丙種球蛋白病。例如，其已在完整免疫球蛋白多發(fā)性骨髓瘤（ΜΜ)、輕鏈 麗、非分泌型麗、AL淀粉樣變、輕鏈沉積病、郁結(jié)性麗、漿細(xì)胞瘤和MGUS(意義未明的單克 隆丙種球蛋白?。┑脑\斷中用作輔助。例如，F(xiàn)LC的檢測還已用作其他Β-細(xì)胞體液不調(diào)診 斷的輔助，并且實(shí)際上一般用作單克隆丙種球蛋白病診斷的尿本周蛋白分析的替代。
[0004] 通常，尋找λ或Κ輕鏈之一的增加。例如，多發(fā)性骨髓瘤（ΜΜ)由惡性漿細(xì)胞的 單克隆增殖所致，導(dǎo)致產(chǎn)生單一類型免疫球蛋白的單一類型細(xì)胞增加。這導(dǎo)致在個(gè)體內(nèi)觀 察到游離輕鏈λ或κ的量增加?？梢源_定這種濃度增加，并且通常確定游離κ比游離λ 的比例并與正常范圍進(jìn)行比較。這有助于單克隆疾病的診斷。此外，游離輕鏈測定還可以 用于跟蹤患者疾病的治療。例如，可以進(jìn)行AL淀粉樣變治療后患者的預(yù)后。
[0005] Katzmann et al (Clin. Chem. (2002) ;48 (9) : 1437-1944)討論了單克隆丙種球蛋 白病的診斷中游離κ和游離λ免疫球蛋白的血清參考間隔和診斷范圍。通過免疫測定研 究了 21-90歲的個(gè)體，并且與通過免疫固定獲得的結(jié)果進(jìn)行比較以優(yōu)化檢測患有Β-細(xì)胞體 液不調(diào)的個(gè)體中單克隆游離輕鏈的免疫測定。
[0006] 記錄κ和λ FLC量以及κ / λ比例，允許確定參考間隔用于檢測Β-細(xì)胞體液不 調(diào)。
[0007] 申請人:以前還已鑒定FLC的測定可以用來預(yù)測個(gè)體的長期存活，甚至當(dāng)個(gè)體是表 面上健康的對象時(shí)也是如此（W0 2011/021041)。他們發(fā)現(xiàn)總FLC濃度與長期存活統(tǒng)計(jì)上顯 著相關(guān)。此外，這種關(guān)聯(lián)看來與現(xiàn)有的長期存活預(yù)后標(biāo)記如膽固醇、肌酸酐、半胱氨酸蛋白 酶抑制劑c和C-反應(yīng)蛋白的關(guān)聯(lián)相似或更好?？侳LC測量的測定在文件中公開。測量總FLC 的測定可獲得自 The Binding Site, Birmingham, United Kingdom，商標(biāo)為 "Combylite"。
[0008] 還已發(fā)現(xiàn)測量重鏈類別至輕鏈類型結(jié)合特異性（HLC)免疫球蛋白如IgAA、 IgAK、IgGK、IgGA、IgMK或IgMA有助于表征單克隆丙種球蛋白病。重鏈類別-輕鏈類 型特異性抗體以及它們的用途在W0 2006/079816中公開。這類抗體可商購自The Binding Site, Birmingham, United Kingdom,商標(biāo)為 "Hevylite"。
[0009] 與多克隆異常相關(guān)的疾病一般是已知的，其中一種以上特異性抗體的生成增加或 減少。例如，這可以通過抗體生成的普遍增加或者通過存在來自兩種不同腫瘤來源的兩種 或更多種單克隆抗體來表征。慢性感染、自身免疫性疾病和許多腫瘤引起多克隆免疫球蛋 白的增加。皮膚、肺和腸疾病更可能引起IgA濃度的增加，而全身性感染會(huì)增加所有免疫球 蛋白，但特別是IgG。
[0010] 血清蛋白電泳（SPE)包括在已將血清蛋白分離且已將凝膠染色之后掃描瓊脂糖 電泳凝膠。免疫固定電泳（IFE)檢測血清蛋白的存在，利用抗體結(jié)合至電泳凝膠內(nèi)的蛋白 以產(chǎn)生可見的沉淀?xiàng)l帶。這類方法有許多限制。從2001年開始，血清FLC測定已可用于鑒 定血清中的游離λ或游離κ輕鏈（FLC)。在國際指導(dǎo)方針中推薦FLC、SPE和/或IFE測 定的聯(lián)合使用。每個(gè)測試的不同結(jié)果分開解釋，雖然組合的結(jié)果一起可能或可能不互相支 持，參見例如 Dispenzieri A.et.al, Leukaemia 23-2 (2009) ,215-24。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 最近 申請人:已開發(fā)使用Hevylite?抗體的HLC測定。這類HLC測定允許測量來自 腫瘤的累及的單克隆蛋白（此外其可以通過SPE測量）與相同重鏈類別（但是結(jié)合至相反 輕鏈）的未累及的多克隆水平之間的可定量比例。這個(gè)比例可以用于代替SPE和IFE來確 定血清中單克隆蛋白的類型和濃度。
[0012] 來自可獲得的各種測定的結(jié)果的解釋可能非常困難并需要一些技巧和專業(yè)人員。 申請人:已鑒定FLC和HLC結(jié)果，任選地連同總FLC和/或總HLC可以加權(quán)已產(chǎn)生單克隆丙 種球蛋白病的指征的評分。這可以用來不僅顯示異常的指征，而且還顯示這種指征的置信 度（degree of confidence)。還可以更容易地鑒定一個(gè)或多個(gè)結(jié)果中的分析錯(cuò)誤。預(yù)期這 允許獲得單克隆丙種球蛋白病的區(qū)別和置信度以及以下之間的區(qū)別：
[0013] a)單克隆蛋白生成（為這種完整免疫球蛋白、游離輕鏈或兩者的確實(shí)生成）。有 或無相關(guān)的未累及的免疫球蛋白的多克隆抑制。
[0014] b)沒有單克隆生成的多克隆生成的升高-高丙種球蛋白血癥。
[0015] c)沒有單克隆生成的多克隆生成的抑制-低丙種球蛋白血癥。
[0016] d)沒有單克隆生成的正常多克隆生成。
[0017] e)結(jié)合至一類重鏈的κ輕鏈或λ輕鏈的生成和/或沒有單克隆蛋白生成的κ 輕鏈或λ輕鏈的生成。
[0018] 本發(fā)明提供一種表征患者的漿細(xì)胞相關(guān)疾病的方法，所述方法包括：
[0019] (i)提供來自所述患者的至少一個(gè)樣品；
[0020] (ii)在所述樣品中確定以下參數(shù)的兩個(gè)或更多個(gè)：
[0021] (a) κ : λ游離輕鏈（FLC)比例，
[0022] (b)結(jié)合至一類重鏈的κ輕鏈：結(jié)合至相同類別的重鏈的λ輕鏈的比例 (ΗΙΧκ :ΗΙΧλ 比例），
[0023] (c)所述樣品中FLC的總量，和
[0024] (d)結(jié)合至所述重鏈類別的κ輕鏈加上結(jié)合至相同重鏈類別的λ輕鏈的總量 (總 HLC);
[0025] (iii)將來自（a)、（b)、（c)和/或（d)的每個(gè)比例或量與預(yù)定值進(jìn)行比較，并且 對每個(gè)量或比例指定評分；以及
[0026] (iv)利用所述評分來表征所述漿細(xì)胞相關(guān)疾病。
[0027] 例如，異常FLCk : λ比例或ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例的指征、升高的克隆濃度以及未累 及的免疫球蛋白的抑制給出高水平的存在單克隆漿細(xì)胞相關(guān)疾病的確定性。
[0028] 通常，確定κ : XFLC比例和ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例。
[0029] 確定樣品中的總FLC和總HLC還可以用于提供評分。
[0030] 具有正常范圍內(nèi)的FLC K : λ比例的升高的K FLC或λ FLC水平強(qiáng)調(diào)潛在的異常 并有必要進(jìn)一步研究。相似地，具有正常范圍內(nèi)的ΗΙΧκ:ΗΙΧλ的升高的HLCk或ΗΙΧλ 也強(qiáng)調(diào)潛在的異常并有必要進(jìn)一步研究。
[0031] 樣品可以是尿樣品，但優(yōu)選血清、血液或血漿。
[0032] 評分系統(tǒng)允許表征漿細(xì)胞相關(guān)疾病并有助于簡化表征，允許較不熟練的從業(yè)人員 進(jìn)行測定并允許確定結(jié)果的置信度。
[0033] 漿細(xì)胞相關(guān)疾病可以為單克隆丙種球蛋白病。其可以為Β-細(xì)胞相關(guān)疾病如骨髓 瘤、（如完整免疫球蛋白骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤）、MGUS、AL淀粉樣變、瓦爾登 斯特倫巨球蛋白血癥、霍奇金淋巴瘤、濾泡中心細(xì)胞性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì) 胞淋巴瘤、前B細(xì)胞白血病或急性淋巴細(xì)胞白血病。
[0034] 漿細(xì)胞相關(guān)疾病還可以為多克隆相關(guān)疾病如高丙種球蛋白血癥或低丙種球蛋白 血癥。
[0035] 所述方法可以通過計(jì)算機(jī)實(shí)施，例如可以實(shí)施步驟（iii)。評分可以在輸出如計(jì)算 機(jī)顯示器上顯示?？蛇x地，評分可以用來產(chǎn)生疾病類型的可能診斷的輸出。
[0036] -個(gè)或多個(gè)樣品可以基本上同時(shí)采自患者?？梢栽趩蝹€(gè)樣品或不同樣品上測定 量。
[0037] 評分可以用來指示漿細(xì)胞疾病的類型和/或包括表征漿細(xì)胞疾病的置信度 (confidence level) 〇
[0038] 例如，高或中FLCk : λ比例會(huì)指示κ單克隆丙種球蛋白病。但是，當(dāng)其本身鑒定 較低的異常κ : AFLC比例時(shí)，指示單克隆生成的較低置信度（confidence)。如果重鏈類別 之一的HLC比例（如IgA κ : IgA λ)也顯示異常比例，對于比例和輕鏈類型，這證實(shí)發(fā)現(xiàn)單 克隆生成。
[0039] 特定類別的總FLC和/或總HLC的總和可以用來顯示異常水平的免疫球蛋白生成 或者例如一種或多種類別免疫球蛋白如IgM或IgA的抑制。
[0040] 通常，確定FLCk : λ比例并與FLCk : λ比例的正常范圍進(jìn)行比較。正常范圍可 以是表面上健康的個(gè)體的κ :λ的典型范圍，根據(jù)評價(jià)的群體，其通常為0.26-1. 65。
[0041] 如果FLCK : λ比例高于或低于該普通范圍，其可以給出評分。例如，評分可以為 1?、中或低；1、2、3或4 ;或者+、++、+++或++++用于克隆形成能力的指征。例如，"正常比 例"還可以評分為零。預(yù)定范圍以上如1.65以上的比例指示κ單克隆形成能力，所以κ 值會(huì)給出評分，例如高、中或低；或者4為非常高、3為較高、2為較低、1為剛好在正常范圍 以上。當(dāng)比例低于正常范圍（例如低于0.26)時(shí)，指示λ單克隆形成能力并也可以以相似 的方式評分。
[0042] 例如，以下比例可以用來評分結(jié)果。
[0043] 表 1
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種表征患者的漿細(xì)胞相關(guān)疾病的方法，所述方法包括： (i) 提供來自所述患者的至少一個(gè)樣品； (ii) 在所述樣品中確定以下參數(shù)的兩個(gè)或更多個(gè)： (a) κ : λ游離輕鏈（FLC)比例， (b) 結(jié)合至一類重鏈的κ輕鏈：結(jié)合至相同類別的重鏈的λ輕鏈的比例 (ΗΙΧκ :ΗΙΧλ 比例）， (c) 所述樣品中FLC的總量，和 (d) 結(jié)合至所述重鏈類別的κ輕鏈加上結(jié)合至相同重鏈類別的λ輕鏈的總量（總 HLC)； (iii) 將來自（a)、（b)、（c)和/或（d)的每個(gè)比例或量與預(yù)定值進(jìn)行比較，并且對每 個(gè)量或比例指定評分；以及 (iv) 利用所述評分來表征所述漿細(xì)胞相關(guān)疾病。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中確定FLCk : λ比例和HLCk : λ比例。
3. -種計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法，其包括權(quán)利要求1或2的方法。
4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟（iii)通過計(jì)算機(jī)來實(shí)施。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述評分指示漿細(xì)胞疾病的類型和/或指示表 征漿細(xì)胞疾病的置信度。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中確定κ : λ游離輕鏈比例并與FLCk : λ的正常 范圍進(jìn)行比較。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中如果所述FLCk : λ比例在正常范圍之上或之下，則對所述 FLCk : λ給出評分。
8. 權(quán)利要求6或7的方法，其中如果所述FLCk : λ在正常范圍內(nèi)，則確定所述樣品中 FLC的總量并對所述量給出評分。
9. 權(quán)利要求6-8的方法，其中如果所述FLCk : λ比例在正常范圍內(nèi)，則正常范圍之上 的FLCk或FLCA水平表明需要進(jìn)一步的研究。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中確定ΗΙΧκ:ΗΙΧλ比例并與正常范圍該重鏈 類別的HLC κ : HLC λ進(jìn)行比較。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中如果所述HLCk :HLC λ比例在正常范圍之上或之下，則對 所述HLC κ : HLC λ比例給出評分。
12. 權(quán)利要求10或11的方法，其中如果所述HLCk:HLC λ比例在正常范圍內(nèi)，貝IJ確定 總HLC κ +HLC λ量并給出評分。
13. 權(quán)利要求10-12的方法，其中如果所述ΗΙΧκ:ΗΙΧλ比例在正常范圍內(nèi)，則正常范 圍之上的HLCk或ΗΙΧλ水平表明需要進(jìn)一步的研究。
14. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例和/或總HLC是亞類特 異性的。
15. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將所述樣品中AFLC的量與kFLC的量進(jìn)行比 較以產(chǎn)生克隆形成能力評分或者FLC生成或抑制的指征。
16. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將所述樣品中ΗΙΧλ的量與HLCk的量進(jìn)行比 較以產(chǎn)生克隆形成能力評分或者FLC生成或抑制的指征。
17. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過免疫吸附測定確定κ : AFLC比例、 HLC κ : HLC λ比例、總FLC和/或總HLC。
18. 權(quán)利要求17的方法，其包括使用抗kFLC特異性抗體或其特異性片段、抗λ FLC特 異性抗體或其特異性片段、抗κ重鏈類別特異性抗體或其特異性片段和/或抗λ重鏈類 別特異性抗體或其特異性片段。
19. 權(quán)利要求17或18的方法，其中所述測定為夾心測定如ELISA測定，或者利用散射 濁度計(jì)、濁度計(jì)、流式細(xì)胞儀和/或Luminex?珠來確定抗體對FLC或HLC的結(jié)合。
20. 裝置，其包含配置為進(jìn)行前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法的計(jì)算機(jī)處理器和內(nèi)存。
21. 權(quán)利要求20的裝置，其包含用于測量κ : XFLC比例、ΗΙΧκ :ΗΙΧλ比例以及任選 地測量總FLC和/或總HLC的檢測器。
22. -種試劑盒，其包含以下的組合：（i)抗kFLC特異性抗體或其片段和抗AFLC特 異性抗體或其片段，以及（ii)抗κ重鏈類別特異性抗體或其片段和抗λ重鏈類別特異性 抗體或其片段，任選地混合在一起。
23. 權(quán)利要求22的試劑盒，其額外地包含用于確定樣品中的總FLC的其他抗體或其片 段。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104272113SQ201380023667
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月6日
【發(fā)明者】S·哈丁, R·休斯, H·卡爾-史密斯 申請人:結(jié)合點(diǎn)集團(tuán)有限公司