本發(fā)明涉及一種基于磺化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的DNA熒光檢測(cè)方法及其試劑盒，屬于分析化學(xué)及納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氧化石墨烯可視為一種非傳統(tǒng)形態(tài)的單一的原子層軟性材料，可在橫向尺寸上擴(kuò)展到數(shù)十微米，具有聚合物、膠體、薄膜以及兩性分子的特性。研究結(jié)果表明氧化石墨烯整個(gè)基面主體由兩個(gè)不同區(qū)域構(gòu)成，分別為未被氧化的芳香苯環(huán)和封閉的脂肪族六元環(huán)，羥基、環(huán)氧基團(tuán)以及大量sp2 C-C結(jié)構(gòu)單元存在于氧化石墨烯表面，羧基、羰基存在于氧化石墨烯邊緣。氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)決定其能夠通過(guò)鍵堆疊作用對(duì)帶有裸露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物（核酸堿基、芳香族化合物）產(chǎn)生強(qiáng)烈的非共價(jià)吸附。ss-DNA中的堿基包含六元環(huán)結(jié)構(gòu)，石墨烯會(huì)與裸露的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的π-π*相互作用、疏水作用等，從而吸附ss-DNA。但是，石墨烯結(jié)合不同分子結(jié)構(gòu)的DNA的能力明顯不同。研究表明，熒光標(biāo)記的單鏈DNA探針能夠快速、有效地吸附在氧化石墨烯的表面，由于氧化石墨烯熒光猝滅性質(zhì)，只顯示出弱的熒光信號(hào)；體系中存在靶序列DNA時(shí)，靶序列DNA與探針DNA雜交形成螺旋狀雙鏈DNA分子，由于DNA雜交后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，磷酸鹽骨架將堿基有效屏蔽在其中，使石墨烯無(wú)法與堿基接觸，從而造成結(jié)合能力的減弱，使得熒光標(biāo)記的DNA探針從氧化石墨烯表面釋放，而顯示出強(qiáng)的熒光信號(hào)。通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱變化可以高效測(cè)定特定序列的DNA的含量。

由以上可知，氧化石墨烯還原程度越高sp2雜化的晶域恢復(fù)越完全其對(duì)單鏈DNA的熒光猝滅效果就越高。但是，單純的還原氧化石墨烯雖然可使其sp2雜化的晶域恢復(fù)卻因含氧基團(tuán)的離去降低了其在水中的溶解性。這大大限制了氧化石墨烯的還原程度及還原氧化石墨烯在生物領(lǐng)域、環(huán)境監(jiān)測(cè)及臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種基于磺化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的DNA熒光檢測(cè)方法及其試劑盒。磺化石墨烯在具有高還原程度的同時(shí)具有良好的水溶性。本發(fā)明所構(gòu)建的方法具有特異性好、靈敏度高、背景信號(hào)低等突出優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于磺化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的DNA檢測(cè)方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒。試劑盒中包括磺化石墨烯溶液（a液），探針鏈DNA溶液（b液）。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)方法，其特征是將6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA與目標(biāo)鏈DNA加入到Tris-HCl緩沖液中，雜交反應(yīng)后加入磺化石墨烯，室溫反應(yīng)，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm；所使用的磺化石墨烯由以下方法制備而得：將氧化石墨烯固體分散于去離子水中，超聲處理3小時(shí)得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯的分散體系加入5 wt %碳酸鈉溶液，以使得氧化石墨烯的分散體系的pH值為9~10，再加入30 mL濃度為0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌1小時(shí)，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心水洗，得到中性的部分還原氧化石墨烯；將部分還原氧化石墨烯分散于去離子水中，得到部分還原氧化石墨烯懸浮液，然后加入對(duì)氨基苯磺酸重氮鹽，混勻后在冰浴條件下攪拌2小時(shí)，離心雙蒸水洗滌沉淀至其pH為7，得到呈中性的耦合物；將上述所得的耦合物分散于150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，100 ℃下攪拌24小時(shí)進(jìn)行還原反應(yīng)，然后滴加5 wt %碳酸鈉溶液沉淀磺化石墨烯，將上述制得的磺化石墨烯用雙蒸水進(jìn)行徹底洗滌，然后將磺化石墨烯進(jìn)行真空干燥，得到磺化石墨烯固體。

磺化石墨烯對(duì)6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA的熒光猝滅率為98.0%。

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA與40 μL目標(biāo)鏈DNA加入到405 μL 濃度為10 mmol/L的pH為8.0且含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液中，37 ℃條件下雜交30分鐘，加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應(yīng)30秒，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm。

目標(biāo)鏈DNA檢測(cè)線性范圍為0.2~40 nmol/L，檢測(cè)限為12.36 pmol/L。

具體地說(shuō)，本發(fā)明本發(fā)明所述的基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)方法，包括如下步驟：

（一）氧化石墨烯的制備

稱(chēng)取325目鱗片石墨，加入到體積比為9:1的濃硫酸和磷酸混合溶液中。充分?jǐn)嚢韬?，置于? ℃冰浴中。將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力攪拌3小時(shí)后，將所得墨綠混懸液轉(zhuǎn)移至35 ℃溫水浴中，控溫1小時(shí)，然后再將混懸液轉(zhuǎn)移至50 ℃溫水浴中，控溫12小時(shí)。將一定量的冰水混合物緩慢加入到得到的紫黑色混懸液中，劇烈攪拌1小時(shí)。繼而往溶液中逐滴滴加30% 過(guò)氧化氫溶液，至溶液顏色突變?yōu)榱咙S色。所得溶液經(jīng)G1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過(guò)濾，繼而4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，分別經(jīng)過(guò)水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚沖洗后經(jīng)G5砂芯漏斗（孔徑1.5-2.5微米）過(guò)濾。濾餅在室溫下過(guò)夜晾干，得到氧化石墨烯固體。

（二）磺化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的制備

將步驟（一）制得的氧化石墨烯固體分散于去離子水中，超聲處理3小時(shí)得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯的分散體系加入5%碳酸鈉溶液，以使得氧化石墨烯的分散體系的pH值為9~10，再加入30 mL濃度為0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌1小時(shí)，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心水洗，得到中性的部分還原氧化石墨烯。將部分還原氧化石墨烯分散于去離子水中，得到部分還原氧化石墨烯懸浮液，然后加入對(duì)氨基苯磺酸重氮鹽，混勻后在冰浴條件下攪拌2小時(shí)，離心雙蒸水洗滌沉淀至其pH為7，得到呈中性的耦合物。將上述所得的耦合物分散于150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，100 ℃下攪拌24小時(shí)進(jìn)行還原反應(yīng)，然后滴加5%碳酸鈉溶液沉淀磺化石墨烯，將上述制得的磺化石墨烯用雙蒸水進(jìn)行徹底洗滌，然后將磺化石墨烯在一定溫度下進(jìn)行真空干燥，得到磺化石墨烯固體。

（三）DNA檢測(cè)

將40 μL濃度為500 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA（FAM-ssDNA）與40 μL不同濃度目標(biāo)鏈DNA加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液中（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA），混合均勻，在37 ℃條件下雜交30分鐘。然后加入15 μL濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯，反應(yīng) 30秒，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。

為了實(shí)現(xiàn)上述試劑盒的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒，其特征是包括a液和b液；a液為磺化石墨烯溶液，b液為含探針鏈FAM-ssDNA的Tris-HCl緩沖液。

a液為濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液。

b液為含44.94 nmol/L探針鏈FAM-ssDNA的10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，所述的Tris-HCl緩沖液其pH為8.0，且含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA。

具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒，具有如下特征：

（四）試劑盒組成

a液包括上述技術(shù)方案（二）制備的磺化石墨烯加入超純水超聲分散所形成的溶液，其濃度為50 μg/mL。b液為含44.94 nmol/L探針鏈DNA的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA）。

本發(fā)明所述的一種基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒的使用方法為：40 μL目標(biāo)鏈DNA加入到445 μL b液中，混合后在37 ℃條件下雜交反應(yīng)30分鐘，在混合溶液中加入15 μL a液，混合后室溫反應(yīng)30秒，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度F，激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm。

目標(biāo)鏈DNA檢測(cè)線性范圍為0.2~40 nmol/L，檢測(cè)限為12.36 pmol/L。

所述的一種基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒的使用方法，能區(qū)分單堿基錯(cuò)配DNA和目標(biāo)鏈DNA。

具體地說(shuō)，所述的一種基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒的使用方法具有如下特征：

（五）試劑盒使用方法

將目標(biāo)鏈DNA 40 μL 加入到445 μL技術(shù)方案（四）的b液，混合后37 ℃雜交30分鐘。加入15 μL技術(shù)方案（四）的a液，混合后室溫條件下反應(yīng)30秒，立即用494 nm激發(fā)波長(zhǎng)檢測(cè)其520 nm處熒光強(qiáng)度（F）。以F（含有目標(biāo)鏈DNA）與F₀（空白）的差值（F- F₀）對(duì)目標(biāo)鏈DNA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。熒光分光光度法測(cè)定的檢測(cè)限為12.36 pmol/L。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明使用磺化石墨烯為探針，具有吸附單鏈DNA能力強(qiáng)、用量少、反應(yīng)迅速等特點(diǎn)。

（2）本發(fā)明使用的磺化石墨烯納米材料其本身具有良好的水溶性，熒光背景低等性質(zhì)，不需要任何前修飾步驟。

（3）本發(fā)明在檢測(cè)DNA中測(cè)定靈敏度高，DNA檢測(cè)限為12.36 pmol/L。

（4）本發(fā)明檢測(cè)DNA選擇性好，能有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配和非互補(bǔ)DNA序列。

附圖說(shuō)明

圖1為氧化石墨烯、磺化石墨烯與FAM-ssDNA作用的熒光光譜圖。

圖2為磺化石墨烯對(duì)FAM-ssDNA的猝滅動(dòng)力學(xué)曲線。

圖3為檢測(cè)不同濃度目標(biāo)DNA時(shí)的熒光光譜圖。

圖4為目標(biāo)DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5為DNA檢測(cè)特異性圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)方法。以下結(jié)合附圖及若干實(shí)施例對(duì)本發(fā)明檢測(cè)方法的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)例1：

稱(chēng)取325目鱗片石墨2.7 g，加入到316 mL濃度為18.4 mol/L的濃硫酸和36 mL濃度為14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分?jǐn)嚢韬螅糜谠? ℃冰浴中。將16.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力攪拌3小時(shí)后，將所得墨綠混懸液轉(zhuǎn)移至35 ℃溫水浴中，控溫1小時(shí)，然后將所得墨綠混懸液轉(zhuǎn)移至50 ℃溫水浴中，控溫12小時(shí)得到紫黑色混懸液混合物。360 mL冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液混合物中，劇烈攪拌1小時(shí)。繼而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%過(guò)氧化氫溶液，溶液顏色突變?yōu)榱咙S色，攪拌30 分鐘。所得溶液經(jīng)G1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過(guò)濾，繼而4000 轉(zhuǎn)每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入180 mL 超純水充分振蕩洗滌，4000 轉(zhuǎn)每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入180 mL 30wt% 鹽酸充分振蕩洗滌，經(jīng)G1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過(guò)濾去除不溶顆粒，濾液4000 轉(zhuǎn)每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續(xù)加深；接著多次用無(wú)水乙醇將沉淀物洗至pH值為中性，4000 轉(zhuǎn)每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經(jīng)G5砂芯漏斗（孔徑1.5-2.5微米）過(guò)濾。濾餅在室溫下過(guò)夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。

實(shí)例2：

在裝有冷凝管、攪拌器、滴液漏斗和溫度計(jì)的150 mL四頸瓶中放入10 mL 5 wt%碳酸鈉溶液及2.1 g對(duì)氨基苯磺酸晶體，攪拌下溫?zé)崾蛊淙芙?，再加?.8 g亞硝酸鈉與6 mL水配成的溶液，用冰浴冷至0~5 ℃。在不斷攪拌下，將3 mL濃鹽酸與10 mL水配成的溶液滴入上述混合溶液中，在冰浴中繼續(xù)攪拌15 min，得到對(duì)氨基苯磺酸重氮鹽。

實(shí)例3：

將實(shí)施例1制得的氧化石墨烯固體分散于去離子水中，超聲處理3小時(shí)得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯的分散體系加入5 wt %碳酸鈉溶液，以使得氧化石墨烯的分散體系的pH值為9~10，再加入30 mL濃度為0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌1小時(shí)，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心水洗，得到中性的部分還原氧化石墨烯。將部分還原氧化石墨烯分散于75 mL去離子水中，得到部分還原氧化石墨烯懸浮液，然后加入實(shí)例2制得的對(duì)氨基苯磺酸重氮鹽，混勻后在冰浴條件下攪拌2小時(shí)，離心雙蒸水洗滌沉淀至其pH為7，得到呈中性的耦合物。將上述所得的耦合物分散于150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，100 ℃下攪拌24小時(shí)進(jìn)行還原反應(yīng)，然后滴加5 wt %碳酸鈉溶液沉淀磺化石墨烯，將上述制得的磺化石墨烯用雙蒸水進(jìn)行徹底洗滌，然后將磺化石墨烯在60 ℃下進(jìn)行真空干燥，得到磺化石墨烯固體。

實(shí)例4：

在445 μL 濃度為10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中加入40 μL濃度為500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶液和15 μL濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液，室溫反應(yīng)30秒，測(cè)定熒光光譜（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。由圖1可知，磺化石墨烯的熒光猝滅率為98.0%，顯著高于氧化石墨烯的15.6%。

實(shí)例5：

在445 μL 濃度為10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中加入40 μL濃度為500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶液和15 μL濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液，室溫反應(yīng)0~120秒，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。由圖2可知，磺化石墨烯可在30秒內(nèi)猝滅FAM-ssDNA的熒光。

實(shí)例6：

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）與40 μL不同濃度目標(biāo)鏈DNA（0~500 nmol/L）（Takara Bio）加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃條件下雜交30分鐘。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應(yīng)30秒，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光光譜（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。如圖3所示，熒光強(qiáng)度隨著目標(biāo)鏈DNA濃度的增大而增大。

實(shí)例7：

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）與40 μL不同濃度目標(biāo)鏈DNA（0~500 nmol/L）（Takara Bio）加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃條件下雜交30分鐘。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應(yīng)30秒，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。如圖4所示，目標(biāo)鏈檢測(cè)線性范圍為0.2~40 nmol/L，檢測(cè)限為12.36 pmol/L。

實(shí)例8：

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）與40 μL 500 nmol/L目標(biāo)鏈DNA或單堿基錯(cuò)配鏈DNA（Takara Bio）或非互補(bǔ)鏈DNA（Takara Bio），加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃條件下雜交30分鐘。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應(yīng)30秒，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。如圖5所示，該檢測(cè)方法具有良好的特異性，可區(qū)分目標(biāo)鏈與單堿基錯(cuò)配鏈，單堿基錯(cuò)配鏈熒光恢復(fù)僅相當(dāng)于目標(biāo)鏈的27.8%。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種基于磺化石墨烯的DNA熒光檢測(cè)試劑盒。試劑盒中包括提供磺化石墨烯（a液），含探針鏈DNA（FAM-ssDNA）的Tris-HCl緩沖液（b液）。

實(shí)例9：

a液的制備：稱(chēng)取5 mg上述實(shí)例2制備所得磺化石墨烯，加入10 mL超純水，超聲5小時(shí)，得到濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液。

實(shí)例10：

b液的制備：將40 μL 500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶解于405 μL濃度為10 mmol/L 的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA），得到濃度為44.94 nmol/L的FAM-ssDNA。

實(shí)例11：

試劑盒使用方法：40 μL目標(biāo)鏈DNA（Takara Bio）分別加入到445 μL實(shí)施例10制備的b液，混合后在37 ℃條件下雜交反應(yīng)30分鐘。然后，在混合溶液中加入15 μL實(shí)施例9制備的a液，混合后室溫反應(yīng)30秒，測(cè)定520 nm處的熒光強(qiáng)度F（激發(fā)波長(zhǎng)494 nm）。根據(jù)F（含有目標(biāo)鏈DNA）與F₀（空白）的差值（F- F₀）對(duì)目標(biāo)鏈濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.2~40 nmol/L 范圍內(nèi)F-F₀與目標(biāo)鏈DNA濃度呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為12.36 pmol/L。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。