本發(fā)明屬于生物傳感器，具體涉及到一種基于底物延遲釋放自動信號放大的側(cè)流層析分析方法及加工工藝。

背景技術(shù)：

1、側(cè)向?qū)游鰴z測(lfa)是最常用的poct檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測和疾病篩查等領(lǐng)域?；诮鸺{米粒子的側(cè)向?qū)游鰴z測(aunp-lfa)因其分析速度快、操作簡單、成本低，已成為食品安全、臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測中最常用的快速檢測方法之一。與實(shí)驗(yàn)室測試技術(shù)相比，aunp-lfa具有一定的局限性：靈敏度低，這種局限性極大地阻礙了aunp-lfa在痕量目標(biāo)快速檢測中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)lfa的高靈敏度，一些信號放大策略，如納米酶催化(nc)、納米粒子聚集(na)、金屬原位生長(misg)、分支dna技術(shù)(bdna)，被引入到lfa中。通過納米酶催化底物顯色，lfa的靈敏度可以提高數(shù)十甚至數(shù)百倍。然而，這些方法需要額外的操作步驟，如制備底物和手動添加底物進(jìn)行催化等，這增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性。

3、在misg策略中，通過羥胺(ha)、抗壞血酸和對本二酚等還原劑將au3+、cu2+或ag+等金屬離子還原為金屬晶體，并沉積在aunps的表面上，從而擴(kuò)大了aunps的尺寸,這導(dǎo)致檢測區(qū)域中的比色信號顯著增強(qiáng)，但同時存在不必要的自成核和金屬離子生長，通常會導(dǎo)致較高的背景信號，并可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。分支dna是一種人工合成的分支dna，可以與多種酶結(jié)合，從而放大捕獲的目標(biāo)信號進(jìn)行檢測，然而，它通常在微孔板中進(jìn)行。

4、近年來，一些傳統(tǒng)的lfa特性與一步法催化相結(jié)合的比色檢測方法引起了研究人員的興趣。在硝化纖維膜上使用順序蠟染技術(shù)設(shè)計(jì)了延遲和非延遲通道，用于在免疫測定中輸送金增強(qiáng)溶液，將金增強(qiáng)的多步操作簡化為一步；只需一次注入，就可以實(shí)現(xiàn)信號放大。還有使用兩根化學(xué)釋放纖維分別嵌入顯色底物和過氧化氫，在樣品溶液的滲透下，它緩慢滲出并流向檢測線，這需要一定的時間，這會在免疫檢測和底物催化之間產(chǎn)生延遲時間，從而實(shí)現(xiàn)自動催化過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本技術(shù)的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

2、鑒于上述和/或現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出了本發(fā)明。

3、因此，本發(fā)明的目的是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于底物延遲釋放自動信號放大的側(cè)流層析分析方法。

4、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種基于底物延遲釋放自動信號放大的側(cè)流層析分析方法，包括，

5、將待測樣品與運(yùn)行緩沖液混合，制得混合溶液；

6、取70～150μl混合溶液滴入sgf-lfa試紙樣品墊上，5～10分鐘后判讀檢測結(jié)果；

7、其中，所述運(yùn)行緩沖液包括4×ssc，0.5％tween-20，ph?7.4；

8、所述sgf-lfa試紙包括pvc底板、樣品墊、金標(biāo)墊、nc膜和吸收墊和底物緩釋裝置sgf；

9、nc膜上包括sa-bio-dnat、sa-bio-dnac以及信號探針au@pt@polya-sdna。

10、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述sgf-lfa試紙中sa-bio-dnat、sa-bio-dnac固定通過非共價相互作用固定在硝酸纖維素膜上。

11、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述pvc底板上依次黏貼樣品墊、金標(biāo)墊、nc膜和吸收墊，然后將sgf固定在樣品墊上；

12、其中，所述nc膜的測試線上噴灑sa-bio-dnat，對照線上噴灑sa-bio-dnac，并在37～40℃下干燥，測試線和對照線之間的距離是4～8mm。

13、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述sgf-lfa試紙的制備方法，包括，

14、制備底物緩釋裝置sgf：將0-10％pva的溶液與dab溶液混合均勻得到顯色液，將玻璃纖維膜gf裁剪成2-5mm寬的長條，并浸入到顯色溶液中5min，然后在37℃干燥箱中干燥1h；

15、制備信號探針au@pt@polya-sdna：通過種子介導(dǎo)方法合成直徑為23nm的au@ptnps，使用傳統(tǒng)的鹽老化方法來構(gòu)建au@pt@polya-sdna納米探針；

16、試紙的組裝：將樣品墊、金標(biāo)墊、nc膜和吸收墊依次貼在pvc膠背上，每個重疊2mm，將sgf浸入濃度為60％-100％蔗糖溶液立即取出，并粘貼在樣品墊上，40℃烘箱干燥1h；

17、用三維噴點(diǎn)平臺在nc膜的t線上噴灑sa-bio-dnat，c線上噴灑sa-bio-dnac，并在30～37℃下干燥1-2h，干燥后使用切割機(jī)器將組裝好的試紙條切成2-4mm寬的長條，放入自封袋中，密封保存。

18、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述au@ptnps，其制備方法包括，

19、將100ml?0.01％的haucl4加入250ml錐形瓶中，加熱攪拌至溶液爆沸，保持1-2min；

20、隨后，迅速加入2ml、1％的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌，溶液的顏色由淺黃色逐漸變?yōu)樯钭仙詈笞兂删萍t色，得到aunps溶液；

21、將得到的aunps溶液作為種子液，將1ml、0.1mol/l的抗壞血酸添加到aunps種子溶液中，然后加入1.5ml、0.01g/ml的h2ptcl6混合，將所得混合溶液在90℃加熱30min以獲得au@ptnps；

22、將制備的au@ptnps溶液冷卻至室溫，4℃冷藏備用。

23、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述au@pt@polya-sdna納米探針，其制備方法包括，

24、將5μl-15μl、100μmol/l的polya-sdna加入1ml、10nmol/l的au@ptnps中混合均勻；

25、然后加入20μl、500mmol/l、ph3的檸檬酸緩沖液，混合均勻后，在室溫下孵育30min-60min；

26、孵育完成后，加入60μl、ph7.6的500mmol/l?hepes緩沖液，調(diào)整au@ptnps溶液的ph為中性，然后在室溫下孵育2h-4h；

27、之后10000r/min離心20min，沉淀物加入重懸液復(fù)溶，10000r/min離心20min，離心三次除去未反應(yīng)的核酸，最終加入400μl重懸液，4℃冷藏備用。

28、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述重懸液配方為20mmol/lna3po4、5％bsa、10％蔗糖、0.25％tween-20。

29、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述sa-bio-dnat，sa-bio-dnac其制備方法包括，

30、分別將sa與dnat、dnac，按照1：1-1：12的摩爾比在孵育器上4℃,400rpm孵育2h；

31、然后將混合物轉(zhuǎn)移至mwco?30kda超濾管中，放入離心機(jī)6000r/min離心20min，為洗去未結(jié)合的bio-dnat、bio-dnac用400μl、0.01m、ph7.2的pbs離心，重復(fù)兩次；

32、將偶聯(lián)物重懸于10mmol/l的pbs中使偶聯(lián)物總體積為300μl，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

33、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述待測樣品包括h1n1樣品。

34、作為本發(fā)明所述方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述h1n1樣品的濃度為0.02～50nm。

35、本發(fā)明有益效果：

36、(1)本發(fā)明應(yīng)用pva溶液將dab固定在玻璃纖維膜中，只需經(jīng)過簡單的混合，制備成顯色底物溶液，并將玻璃纖維膜浸入顯色液中，經(jīng)過干燥處理后就得到了底物自動釋放的裝置sgf，這種裝置簡單、經(jīng)濟(jì)、并且與現(xiàn)有試紙條的加工工藝兼容性好。

37、(2)本發(fā)明中基于上述工作進(jìn)一步開發(fā)了一種基于底物延遲釋放的自動信號放大的側(cè)流層析試紙sgf-lfa，pva與蔗糖形成兩道屏障，隨著陽平溶液的流動不斷溶解，這就在探針捕獲和納米酶催化之間形成了時間間隔；當(dāng)顯色底物流經(jīng)檢測區(qū)域時，在納米酶的催化作用下會產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色響應(yīng)；因此sgf-lfa試紙?bào)w現(xiàn)出高靈敏、快速、以及出色的選擇性和重復(fù)性，因此具有很高的應(yīng)用于h1n1檢測的潛力。

38、(3)本發(fā)明中sgf-lfa對于h1n1的檢測達(dá)到較高的肉眼檢測靈敏度，比傳統(tǒng)的基于au@ptnps的lfa比色檢測的靈敏度分別提高25倍，且與手動滴加顯色底物的基于au@ptnps催化的lfa的比色靈敏度相當(dāng)，可用于對大批量樣品進(jìn)行肉眼檢測。