本發(fā)明屬于光學顯微成像，具體涉及一種基于平面平行微腔的相干拉曼顯微成像方法。

背景技術：

1、相干拉曼散射(crs)成像，是一種常見的非線性光學顯微成像技術，借助非線性相干拉曼效應提高拉曼信號，使能夠提供高分辨率、高靈敏度的分子成像，主要包括受激拉曼散射(srs)成像和相干反斯托克斯拉曼散射(cars)成像，因其具有無標記、非侵入的特點，這兩種技術在生物醫(yī)學、化學分析、材料科學等領域得到了廣泛應用。雖然它們都利用相干拉曼散射的特性，但在信號產(chǎn)生機制、成像特性和應用場景上有所不同。與傳統(tǒng)光學顯微鏡相比，crs成像可以提供樣品中豐富的化學組分信息，從而能夠幫助科學家了解生命活動過程中各種了解生命活動過程中各種物質成分的變化。與染色和熒光標記的方法相比，crs成像避免了外加熒光標記物對生物細胞的影響及光致漂白損傷的問題，是一種更加安全和高效的方式。

2、光學腔是一種用于儲存和增強光波的器件，被廣泛應用于激光器、光纖通信、傳感技術等。它由兩個或多個反射鏡構成，通過在鏡面之間來回反射的光波形成駐波模式。光學腔可以調節(jié)和控制光場的頻率、相位和強度，提供了許多重要的功能，如增加光與物質相互作用、實現(xiàn)高精度測量、產(chǎn)生激光等。光學腔的工作原理基于干涉現(xiàn)象。當光波進入腔內(nèi)時，它在鏡面之間多次反射，形成了一個穩(wěn)定的干涉模式，也稱為共振模式。這些共振模式對應著特定的頻率，取決于腔的幾何尺寸和材料特性。當輸入光的頻率與腔的共振頻率匹配時，光波被儲存并在腔內(nèi)循環(huán)傳播，形成高強度的電磁場。法布里-珀羅諧振腔(fabry-pérotcavity)，是一種經(jīng)典的光學諧振腔，由兩個平行平面反射鏡組成，也稱平行平面腔，其具有結構簡單，易于加工等優(yōu)點，但衍射損耗大，對準精度要求高，因此常用于短間隔距離的腔體，如微芯片、微腔激光器等，并且平面發(fā)射特性使其常用于光學傳感，特別是成像。

3、近年來，將生物材料嵌入增益介質和光學腔中，是一種新興的技術提供了在生物和生物醫(yī)學應用中使用光學腔的新方法。由于光腔提供了強烈的光物質相互作用，生物增益介質的細微變化可以被放大，導致獨特的輸出激光特性，如窄線寬、強強度和高對比度。細胞激光的最新進展引起了細胞跟蹤，細胞類型的廣泛興趣，細胞內(nèi)檢測和表型的開發(fā)。特別是利用平面平行微腔的單細胞激光器具有電磁場與增益介質全身相互作用的優(yōu)點，為研究細胞的物理結構和相互作用提供了一種敏感的方法。

4、傳統(tǒng)的生物激光器都是利用外加熒光標記物作為增益介質，實現(xiàn)與光學腔的相互作用，然而外加熒光標記物會產(chǎn)生對生物樣品的影響，并且成像過程中會出現(xiàn)光漂白問題，其次外加標記物也讓我們的制樣過程變得復雜。

5、傳統(tǒng)的相干拉曼散射顯微成像技術，由于其信號源自特定化學鍵的振動，因此我們可以無標記的快速提取樣本的空間化學信息，在生物學中，化學信息固然重要，但空間結構信息也非常重要，然而該技術并無法有效獲取其結構信息；并且無標記的相干拉曼散射成像存在對比度低，信噪比較低等問題。

6、隨著近年來光學微腔被應用于生物醫(yī)學領域，腔與物質發(fā)生相互作用，產(chǎn)生特定頻率的共振，共振信號得以提升，根據(jù)諧振條件，這與材料的結構特性相關，因此出射光將攜帶材料的空間結構信息。與相干拉曼顯微成像技術結合，使得其無需利用外加熒光標記物作為增益介質，本發(fā)明通過設計腔的結構，實現(xiàn)選擇性建立cars/srs兩通道的腔增強與轉換。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于一種提供基于平面平行微腔的相干拉曼散射顯微成像方法，以解決相干拉曼散射顯微成像信號弱，僅依靠化學信息成像無法獲取結構信息等問題。

2、本發(fā)明提供的基于平行微腔的相干拉曼散射顯微成像方法，將平面平行微腔與相干拉曼散射顯微成像技術結合，并選擇性建立cars/srs兩通道的腔增強和轉換：微腔與相干反斯托克斯拉曼散射過程耦合(fp-cars)，而不影響受激拉曼散射過程；將微腔與受激拉曼散射過程耦合(fp-srs)；具體步驟為：

3、s1、針對不同實驗要求，選擇不同反射率設計的平面平行微腔(簡稱微腔)，用于耦合相干反斯托克斯拉曼散射過程或受激拉曼散射過程；

4、s2、根據(jù)步驟s1所選用的微腔，設置圖像采集方式，如圖1a所示：若微腔與相干反斯托克斯拉曼散射過程耦合，則采用背向探測相干反斯托克斯拉曼散射信號，正向探測受激拉曼散射信號；若微腔與受激拉曼散射過程耦合，則采用正向探測受激拉曼散射信號；

5、s3、將待測樣品放入微腔中，使用聚苯乙烯微球固定腔長；

6、s4、將微腔放入載物臺，針對待測物的化學組分，選擇相應頻率差的泵浦光和斯托克斯光，使其產(chǎn)生對應不同拉曼頻率的相干拉曼信號，探測器獲取信號從而成像。

7、本發(fā)明中所述的平面平行微腔，又稱法布里-珀羅腔[1]，如圖1b所示，微腔由兩面經(jīng)鍍膜制作的平面鏡組成，該鍍膜對不同光波段具有特定反射率；并分別針對兩個不同的過程進行調控：即可選擇性的與相干反斯托克斯拉曼散射或受激拉曼散射過程耦合。若對相干反斯托克斯拉曼散射耦合，則設計其在相干反斯托克斯拉曼散射光波段具有高反射率(例如99％以上)，泵浦光波段和斯托克斯光波段具有高透射率(例如大于95％)，將相干反斯托克斯光限制在腔內(nèi)使其諧振，從而產(chǎn)生fp-cars信號，對泵浦光和斯托克斯光不影響，因而不影響受激拉曼散射過程；若對受激拉曼散射耦合，則對泵浦光和斯托克斯光設計高反射率(例如，現(xiàn)常使用對泵浦光70％，對斯托克斯光反射率90％)，使泵浦光和斯托克斯光在腔內(nèi)振蕩，產(chǎn)生fp-srs信號，由于既充當泵浦光，又要作為信號光被探測，因此不能將反射率設計的過高，并且本發(fā)明采用對泵浦光解調的方式獲得信號，因此泵浦光的反射率相比于斯托克斯光設計的更低一些；

8、使用聚苯乙烯微球放置在微腔的四周用于固定腔長，具體可通過使用不同直徑的聚苯乙烯微球改變腔長(即兩平面鏡的間距)。一般常用直徑為10um，15um小球固定腔長，由于一般細胞樣品或者組織樣品是5-10um范圍，所以腔長略大于樣品尺寸，并予固定，以提高腔的平行度和穩(wěn)定性。將待測樣品放入腔內(nèi)，將微腔放置于載物臺即可成像；所述載物臺在物鏡和聚光鏡的中間位置，放樣品用的。

9、本發(fā)明將平面平行微腔與相干拉曼散射顯微成像技術結合，并選擇性建立cars/srs兩通道的腔增強和轉換；1.將微腔與相干反斯托克斯拉曼散射過程耦合(fp-cars)，而不影響受激拉曼散射過程；2.將微腔與受激拉曼散射過程耦合(fp-srs)。

10、本發(fā)明具備以下優(yōu)點：

11、(1)圖像化數(shù)據(jù)中，顯示出聚苯乙烯微球的各種相干拉曼散射光的橫向諧振模式，相比于背向cars，實現(xiàn)了出射fp-cars信號14倍的提升。

12、(2)由于微腔的調控，拉曼譜線耦合了細胞空間結構信息，可對細胞樣品進行多模態(tài)檢測，同時進行cars信號反射式接收和srs信號透射式接收，由于亞細胞結構差異，光學腔提高了不同結構間的光學對比度，如細胞核與細胞質，可同時獲取生物樣品的亞細胞三維空間結構信息和多維化學信息，解決了原本相干拉曼散射成像只能獲取生物樣品化學分布，而無法直觀展現(xiàn)樣品結構信息的問題。

13、(3)首次實現(xiàn)對fp-srs成像的觀測，空間結構信息與化學信息耦合產(chǎn)生新的光譜和圖像，更嚴苛的諧振條件使結構信息帶來的對比度變化更為明顯。

14、與現(xiàn)有相干拉曼散射顯微成像技術相比，本發(fā)明結合平面平行微腔，提高了信號強度，并使樣品的空間結構信息和化學信息被同時獲取，從而提供樣品更多維度的信息，與傳統(tǒng)生物微腔傳感成像相比，將腔與相干拉曼散射過程結合，使其無需外加標記物，可以快速無標記成像。信號的提升以及更多維度信息的獲取，使基于平面平行微腔的相干拉曼散射顯微成像在生物醫(yī)學檢測等領域具有廣乏應用前景。