本申請(qǐng)涉及微流控，特別是涉及一種基于多重標(biāo)記構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的微流控芯片及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、惡性腫瘤是全球范圍內(nèi)最主要的健康問(wèn)題之一，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。而腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)進(jìn)化的生態(tài)過(guò)程，腫瘤微環(huán)境(tme)之間不斷的相互作用在腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療的反應(yīng)中起著決定性作用，因此，為了深入了解腫瘤疾病的機(jī)制，發(fā)展相應(yīng)的治療方案，系統(tǒng)性地解析腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞的表型是認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生發(fā)展、提高免疫療效的關(guān)鍵。常規(guī)的研究手段如流式細(xì)胞術(shù)、基因檢測(cè)等技術(shù)可以對(duì)腫瘤區(qū)域內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞群進(jìn)行定性、定量，但無(wú)法獲取腫瘤區(qū)域形態(tài)學(xué)上的信息以及不同標(biāo)志物之間的相對(duì)空間分布特征。常規(guī)的組織切片化學(xué)染色技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)目前已經(jīng)發(fā)展到可以進(jìn)行量化分析，這些研究大多可用于估計(jì)腫瘤微環(huán)境中的免疫頻率和細(xì)胞狀態(tài)，但它們?nèi)狈εc實(shí)際細(xì)胞比例、細(xì)胞異質(zhì)性和更深層次的空間分布相關(guān)的信息。

2、目前，多采用多重免疫熒光技術(shù)來(lái)量化腫瘤中的細(xì)胞亞群、其功能狀態(tài)及其在微環(huán)境中的空間排列等，該方法能獲取組織的完整形態(tài)學(xué)信息并進(jìn)行原位分析，是目前檢測(cè)腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的核心技術(shù)。但是在常規(guī)的多重染色流程下，手工操作進(jìn)行多重標(biāo)記往往需要數(shù)天時(shí)間，靜態(tài)溶液中的反應(yīng)效率受到限制，并且較難實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)條件的統(tǒng)一，存在較大的人為誤差和低重現(xiàn)性，在單張切片上也難以呈現(xiàn)多種細(xì)胞群原位信息。而自動(dòng)化的染色平臺(tái)和設(shè)備造價(jià)昂貴，且需要大量切片和試劑、以及設(shè)備維護(hù)等人力物力資源，實(shí)驗(yàn)中的抗體稀釋度、抗體與酪胺熒光素之間的匹配、染色順序制定等，皆需要在反復(fù)實(shí)驗(yàn)后進(jìn)一步地優(yōu)化調(diào)整。鑒于當(dāng)前多重染色技術(shù)的局限性，開發(fā)新型的快速、高通量、資源節(jié)約型染色技術(shù)和方案至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請(qǐng)的目的是提供一種新的基于多重標(biāo)記構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的微流控芯片及其應(yīng)用。

2、本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：

3、本申請(qǐng)的第一方面公開了一種基于多重標(biāo)記構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的微流控芯片，包括上層結(jié)構(gòu)和雙層芯片，使用時(shí)兩者依序?qū)盈B；上層結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)公共試劑進(jìn)樣口、若干個(gè)獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池、進(jìn)出氣口和試劑出口；公共試劑進(jìn)樣口通過(guò)獨(dú)立的管道與各獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池連通；雙層芯片包括依序?qū)盈B的氣閥層和檢測(cè)層；氣閥層包括與獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池、進(jìn)出氣口和試劑出口對(duì)應(yīng)的通孔，以及呈氣囊結(jié)構(gòu)的氣閥，與進(jìn)出氣口對(duì)應(yīng)的通孔設(shè)置于氣閥上，用于對(duì)氣閥進(jìn)行充放氣；若干個(gè)獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池對(duì)應(yīng)若干個(gè)通孔，即獨(dú)立試劑進(jìn)樣口；檢測(cè)層包括與獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池對(duì)應(yīng)的若干個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)微通道，檢測(cè)微通道通過(guò)獨(dú)立試劑進(jìn)樣口與其對(duì)應(yīng)的獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池連通，然后，所有檢測(cè)微通道最終匯集在一起與試劑出口連通；使用時(shí)，上層結(jié)構(gòu)與氣閥層接觸，檢測(cè)層與待測(cè)切片接觸，通過(guò)氣閥層上的通孔，將獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池與對(duì)應(yīng)的檢測(cè)微通道連通；獨(dú)立檢測(cè)時(shí)，通過(guò)進(jìn)出氣口進(jìn)行充氣，使氣閥處于正壓模式，檢測(cè)層頂部為封閉的膜，氣閥覆蓋在檢測(cè)層頂部膜的上端，向下施加壓力，擠壓檢測(cè)層與切片緊貼，與此同時(shí)，待測(cè)切片將檢測(cè)微通道的下端封閉，從而形成獨(dú)立的檢測(cè)通道；需要全景標(biāo)記時(shí)，通過(guò)進(jìn)出氣口進(jìn)行抽氣，使氣閥處于負(fù)壓模式，檢測(cè)層頂部膜向上鼓起，將檢測(cè)層各檢測(cè)微通道從下方與組織接觸的面連通，在組織切片表面形成一個(gè)大腔室，從而對(duì)大腔室覆蓋區(qū)域內(nèi)的組織進(jìn)行相同的全景標(biāo)記。

4、優(yōu)選地，上層結(jié)構(gòu)還設(shè)置有觀察窗口，氣閥設(shè)置于觀察窗口對(duì)應(yīng)的位置。

5、優(yōu)選地，氣閥層和檢測(cè)層分別采用聚二甲基硅氧烷制備，組裝時(shí)，使檢測(cè)微通道的樣品入口與氣閥層的獨(dú)立試劑進(jìn)樣口對(duì)準(zhǔn)，試劑出樣口對(duì)準(zhǔn)，氣閥正對(duì)檢測(cè)微通道位于其上部，即形成一個(gè)完整的雙層芯片。

6、優(yōu)選地，上層結(jié)構(gòu)由光固化樹脂材料制備。

7、本申請(qǐng)的另一方面公開了一種采用本申請(qǐng)的微流控芯片的微流控檢測(cè)系統(tǒng)。

8、優(yōu)選地，本申請(qǐng)的微流控檢測(cè)系統(tǒng)包括本申請(qǐng)的微流控芯片，以及公共試劑模塊、試劑控制模塊、正壓控制模塊、外接氣路開關(guān)、負(fù)壓模塊、廢液收集模塊；公共試劑模塊包括若干個(gè)獨(dú)立的公共試劑池，各公共試劑池通過(guò)獨(dú)立的管道與試劑控制模塊的入口端連通；試劑控制模塊用于獨(dú)立的控制和選擇相應(yīng)的公共試劑池，試劑控制模塊的出口端與微流控芯片的公共試劑進(jìn)樣口連通；正壓控制模塊為外接氣源，通過(guò)外接氣路開關(guān)與微流控芯片的進(jìn)出氣口連通，用于對(duì)氣閥進(jìn)行充氣；負(fù)壓模塊獨(dú)立的與微流控芯片的進(jìn)出氣口連通，用于對(duì)氣閥進(jìn)行抽氣；廢液收集模塊與微流控芯片的試劑出口連通，用于收集廢液。

9、優(yōu)選地，廢液收集模塊呈封閉狀態(tài)，負(fù)壓模塊通過(guò)獨(dú)立的管道與廢液收集模塊連通，用于獨(dú)立的控制廢液收集模塊，使其保持負(fù)壓狀態(tài)。

10、優(yōu)選地，試劑控制模塊與微流控芯片的公共試劑進(jìn)樣口的連通管道上設(shè)置有第一流量計(jì)。

11、優(yōu)選地，廢液收集模塊與微流控芯片的試劑出口的連通管道上設(shè)置有第二流量計(jì)。

12、優(yōu)選地，微流控檢測(cè)系統(tǒng)還包括計(jì)算機(jī)控制端，計(jì)算機(jī)控制端與試劑控制模塊、正壓控制模塊、外接氣路開關(guān)、負(fù)壓模塊信號(hào)連接，通過(guò)程序控制給壓的具體參數(shù)、流體的切換順序和每項(xiàng)進(jìn)程的時(shí)間。

13、本申請(qǐng)的再一方面公開了本申請(qǐng)的微流控芯片或者本申請(qǐng)的微流控檢測(cè)系統(tǒng)在多重免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用。

14、本申請(qǐng)的再一方面公開了一種多重免疫熒光檢測(cè)方法，包括采用本申請(qǐng)的微流控芯片或者本申請(qǐng)的微流控檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)同一張切片樣品進(jìn)行多重免疫熒光標(biāo)記。

15、優(yōu)選地，本申請(qǐng)的多重免疫熒光檢測(cè)方法包括先通過(guò)進(jìn)出氣口進(jìn)行充氣，使氣閥處于正壓模式，在各檢測(cè)微通道中分別采用不同的抗體進(jìn)行標(biāo)記；然后，通過(guò)進(jìn)出氣口進(jìn)行抽氣，使氣閥處于負(fù)壓模式，從而使檢測(cè)微通道連通，在組織切片表面形成一個(gè)大腔室，對(duì)大腔室覆蓋區(qū)域內(nèi)的組織進(jìn)行相同的全景標(biāo)記。

16、優(yōu)選地，本申請(qǐng)的多重免疫熒光檢測(cè)方法還包括在全景標(biāo)記后，將切片樣品取出，對(duì)其進(jìn)行后處理或連續(xù)染色。

17、本申請(qǐng)的有益效果在于：

18、本申請(qǐng)的微流控芯片以及基于該微流控芯片的多重免疫熒光檢測(cè)，提升了染色效率，能實(shí)現(xiàn)流程的標(biāo)準(zhǔn)化，精準(zhǔn)液量以及時(shí)間、流速的調(diào)整，可用于對(duì)染色結(jié)果的質(zhì)量控制，有效地節(jié)省了抗體試劑和組織樣本，為腫瘤微環(huán)境研究提供了一種更快速、簡(jiǎn)化、輕便的多重標(biāo)記方案和途徑。

技術(shù)特征：

1.一種基于多重標(biāo)記構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的微流控芯片，其特征在于：包括上層結(jié)構(gòu)(1)和雙層芯片(2)，使用時(shí)兩者依序?qū)盈B；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述上層結(jié)構(gòu)(1)還設(shè)置有觀察窗口(15)，所述氣閥(211)設(shè)置于所述觀察窗口(15)對(duì)應(yīng)的位置。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述氣閥層(21)和檢測(cè)層(22)分別采用聚二甲基硅氧烷制備，組裝時(shí)，使檢測(cè)微通道(221)的樣品入口與氣閥層(21)的獨(dú)立試劑進(jìn)樣口(212)對(duì)準(zhǔn)，試劑出樣口對(duì)準(zhǔn)，氣閥(211)正對(duì)檢測(cè)微通道(221)位于其上部，即形成一個(gè)完整的雙層芯片(2)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的微流控芯片，其特征在于：所述上層結(jié)構(gòu)(1)由光固化樹脂材料制備。

5.一種采用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的微流控芯片的微流控檢測(cè)系統(tǒng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微流控檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于：包括權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的微流控芯片(01)，以及公共試劑模塊(02)、試劑控制模塊(03)、正壓控制模塊(04)、外接氣路開關(guān)(05)、負(fù)壓模塊(06)、廢液收集模塊(07)；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微流控檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于：所述試劑控制模塊(03)與微流控芯片(01)的公共試劑進(jìn)樣口(11)的連通管道上設(shè)置有第一流量計(jì)(081)；

8.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的微流控芯片或者權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的微流控檢測(cè)系統(tǒng)在多重免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用。

9.一種多重免疫熒光檢測(cè)方法，其特征在于：包括采用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的微流控芯片或者權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的微流控檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)同一張切片樣品進(jìn)行多重免疫熒光標(biāo)記。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多重免疫熒光檢測(cè)方法，其特征在于：包括先通過(guò)進(jìn)出氣口(13)進(jìn)行充氣，使氣閥(211)處于正壓模式，在各檢測(cè)微通道(221)中分別采用不同的抗體進(jìn)行標(biāo)記；然后，通過(guò)進(jìn)出氣口(13)進(jìn)行抽氣，使氣閥(211)處于負(fù)壓模式，使檢測(cè)微通道連通，在組織切片表面形成一個(gè)大腔室，對(duì)大腔室覆蓋區(qū)域內(nèi)的組織進(jìn)行相同的全景標(biāo)記；

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)公開了一種基于多重標(biāo)記構(gòu)建腫瘤微環(huán)境的微流控芯片及其應(yīng)用。本申請(qǐng)微流控芯片包括上層結(jié)構(gòu)和雙層芯片；上層結(jié)構(gòu)包括公共試劑進(jìn)樣口、若干獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池、進(jìn)出氣口和試劑出口；公共試劑進(jìn)樣口通過(guò)獨(dú)立管道與各獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池連通；雙層芯片包括氣閥層和檢測(cè)層；氣閥層包括與獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池、進(jìn)出氣口和試劑出口對(duì)應(yīng)的通孔，以及呈氣囊結(jié)構(gòu)的氣閥；檢測(cè)層包括若干獨(dú)立的檢測(cè)微通道，檢測(cè)微通道通過(guò)獨(dú)立試劑進(jìn)樣口與對(duì)應(yīng)的獨(dú)立試劑儲(chǔ)液池連通，所有檢測(cè)微通道最終匯集在一起與試劑出口連通。本申請(qǐng)微流控芯片提升了染色效率，能實(shí)現(xiàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化，精準(zhǔn)液量以及時(shí)間、流速的調(diào)整，可用于對(duì)染色結(jié)果質(zhì)量控制，有效地節(jié)省抗體試劑和組織樣本。

技術(shù)研發(fā)人員：史冰,張瑜,黃振立
受保護(hù)的技術(shù)使用者：海南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15