本發(fā)明屬于重金屬土壤污染修復(fù)，具體涉及一種重金屬耐受性菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著重金屬資源的不斷開發(fā)利用，重金屬自身的不可降解特性和嚴(yán)重的長短期環(huán)境毒性使其成為環(huán)境生態(tài)研究的重點關(guān)注對象。金屬冶煉行業(yè)，在長期的生產(chǎn)過程中釋放大量含重金屬煙氣和粉塵，并在冶煉廠區(qū)周圍持續(xù)聚集。冶煉廠周邊的土壤隨之成為有毒金屬污染物的重要匯集場所。土壤在遭受重金屬污染后，由于其難去除和一定的毒性轉(zhuǎn)化特點，使土壤發(fā)生退化并改變土地系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能。土壤重金屬污染會導(dǎo)致農(nóng)作物生長受阻、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降，并且可能通過土壤-植物-人體的食物鏈等途徑影響人體健康。

2、自20世紀(jì)70年代以來，前人不斷開展重金屬污染形成及其遷移特點的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)重金屬會于土壤和沉積物中迅速沉淀溶解、氧化還原、吸附解吸、絡(luò)合，并形成膠體，在不同環(huán)境中通過轉(zhuǎn)換和流動改變自身物理化學(xué)性質(zhì)，最終形成擁有不同危害程度、生物毒性和遷移特征的賦存形式。重金屬的自由態(tài)離子是其產(chǎn)生毒性效應(yīng)的關(guān)鍵形態(tài)，而這些不同賦存形態(tài)對生態(tài)風(fēng)險起著決定性作用。為了對重金屬環(huán)境污染進(jìn)行系統(tǒng)評估，除了測量重金屬元素的總量外，還應(yīng)開展形態(tài)分析工作，以判斷其對生物和環(huán)境的毒性和生態(tài)風(fēng)險程度。連續(xù)提取(sequentialextraction)又稱為順序提取，即按照化學(xué)性能由弱到強的順序使用一系列特定試劑，逐級吸持與特定化學(xué)基團結(jié)合的痕量元素，將不同元素形態(tài)從樣品中有效提取出來。從研究不同試劑對元素的吸持效應(yīng)與特異性，發(fā)展到聯(lián)合使用試劑來研究元素的形態(tài)、模擬其遷移過程，以達(dá)到判斷污染潛在危害的目標(biāo)。自20世紀(jì)70年代始，眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)重金屬元素形態(tài)的意義，研究建立了tessier法、aston法、sposito法、法、shuman法、gambrell法、bcr法、三態(tài)法等方法，推動了重金屬形態(tài)學(xué)的發(fā)展。在上述方法中，最具代表性的為歐共體委員會歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)局提出的bcr(bureaucommunautaire?de?référence)法。該方法可獲取弱酸可提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)四種重金屬的形態(tài)。已有的研究結(jié)果表明，在土壤系統(tǒng)中，殘渣態(tài)和可氧化態(tài)由于礦物結(jié)構(gòu)鎖定和有機質(zhì)的包裹，通常為不易發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化的低生物有效性重金屬形態(tài)；而弱酸可提取態(tài)和可還原態(tài)由于容易與土壤溶液中的離子發(fā)生交換或土壤系統(tǒng)ph等變化導(dǎo)致轉(zhuǎn)化釋放，通常為易被動植物等直接吸收利用，從而對生物造成高潛在風(fēng)險的重金屬形態(tài)。因此減少土壤系統(tǒng)高遷移和轉(zhuǎn)化風(fēng)險的重金屬形態(tài)占比和含量可以大大降低土壤毒性和生態(tài)風(fēng)險，實現(xiàn)土壤功能的恢復(fù)。

3、傳統(tǒng)的重金屬污染土壤修復(fù)的處理方法為物理、化學(xué)和植物法。物理修復(fù)包括土壤挖掘、過濾、分離等技術(shù)。其優(yōu)點在于實施較為簡單、見效快，能夠直接去除污染物。然而，物理修復(fù)通常會產(chǎn)生大量的污泥或廢棄土壤，并且不一定能完全去除所有的重金屬，可能導(dǎo)致污染轉(zhuǎn)移?；瘜W(xué)修復(fù)利用化學(xué)反應(yīng)中和或穩(wěn)定重金屬，如使用酸堿調(diào)節(jié)劑、絡(luò)合劑等。這類方法的優(yōu)點是可以有效降低重金屬的生物可利用性，提高修復(fù)效率。但其缺點是可能引入新的化學(xué)物質(zhì)，帶來二次污染風(fēng)險，同時也會增加處理成本。

4、近年來，針對重金屬污染土地的微生物修復(fù)技術(shù)得到大量研究和應(yīng)用，包括：微生物吸附、微生物富集、微生物轉(zhuǎn)化、植物-微生物聯(lián)合和原位微生物礦化等過程實現(xiàn)土壤系統(tǒng)中重金屬危害風(fēng)險的降低和去除。

5、(a)微生物吸附

6、微生物吸附過程主要分為三種方式：胞外吸附、細(xì)胞表面吸附以及胞內(nèi)吸附。這一技術(shù)涉及使用生物活性或非生物活性的微生物菌體，包括死亡的微生物細(xì)胞及其衍生物質(zhì)材料，作為吸附劑，實現(xiàn)對土壤中重金屬活性和生物有效性的去除。黃飛等利用提前篩選好的耐cd2+的細(xì)菌蠟狀芽孢桿菌(bacillus?cereus)研究了蠟狀芽孢桿菌細(xì)胞吸附cd2+的能力，結(jié)果表明在30min之內(nèi)，細(xì)胞對cd2+的吸附量可達(dá)到93％。但吸附完重金屬的微生物細(xì)胞需及時從系統(tǒng)分離，否則有再次釋放的風(fēng)險。

7、(b)微生物轉(zhuǎn)化

8、微生物轉(zhuǎn)化主要通過氧化還原反應(yīng)、甲基化/去甲基化和脫烴等作用進(jìn)行的，微生物將重金屬離子從有毒價態(tài)轉(zhuǎn)化成低毒或無毒的物質(zhì)。汞的生物轉(zhuǎn)換過程，尤其是其甲基化和去甲基化方式，已經(jīng)成為研究熱點。在此過程中，硫酸鹽還原菌、鐵還原菌、產(chǎn)甲烷菌以及具有mehg去甲基化微生物和氧化還原微生物等，共同在轉(zhuǎn)化汞的形態(tài)過程中起著重要的作用。假單胞菌(pseudomonas?putida)是一種有能力將六價鉻(cr(vi))還原為三價鉻(cr(iii))的細(xì)菌。在實驗室中，該細(xì)菌被廣泛研究，并成功應(yīng)用于污染土壤的治理。

9、(c)植物-微生物聯(lián)合

10、結(jié)合植物與微生物的聯(lián)合修復(fù)方法，植物通過根系釋放的有機物促進(jìn)微生物的生長，微生物則幫助植物吸收或轉(zhuǎn)化重金屬。例如向日葵(helianthus?annuus)被用于重金屬污染的土壤治理。這些植物通過其根系與土壤中的微生物(如固氮細(xì)菌和真菌)一起，增強重金屬的去除能力，能夠提取鉛、鎘和其他有害金屬。蘆葦?shù)母蹬c多種細(xì)菌和真菌形成共生關(guān)系，這些微生物不僅幫助蘆葦吸收重金屬，還通過其代謝作用提升土壤的自我修復(fù)能力，同時還能改善土壤的理化性質(zhì)。在鉛和砷污染的土壤中，芥菜(brassica?spp.)被發(fā)現(xiàn)能夠挖掘重金屬并通過其根系微生物(如某些放線菌)進(jìn)行重金屬的代謝和去除。微生物能黏附在植物根系表面，幫助吸收重金屬并促進(jìn)重金屬的沉淀或轉(zhuǎn)化。

11、(d)原位微生物礦化

12、原位微生物礦化是一種利用土壤微生物的代謝活動將重金屬轉(zhuǎn)化為無害或低毒性礦物形式的修復(fù)方法。此過程中利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的碳酸根或磷酸根來固結(jié)重金屬離子，進(jìn)而減少土壤中生物活性重金屬。通常選擇適應(yīng)重金屬污染環(huán)境的微生物，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等，這些微生物能夠在高重金屬濃度下生存，并參與金屬的轉(zhuǎn)化過程。

13、微生物礦化重金屬研究現(xiàn)狀：

14、微生物誘導(dǎo)碳酸鹽沉淀(micp)技術(shù)是目前盛行的微生物礦化技術(shù)，其是指自然界中微生物通過代謝產(chǎn)生的co32-與自然界中金屬陽離子結(jié)合生成碳酸鹽礦物沉淀的過程。micp技術(shù)的核心是利用微生物的代謝活動，促進(jìn)碳酸鹽的沉淀，從而有效地封閉土壤中的重金屬。這一過程通常包括以下幾個步驟：

15、細(xì)菌代謝：某些細(xì)菌(如尿素分解細(xì)菌)通過分解尿素產(chǎn)生氨，使環(huán)境ph值升高，或通過光合作用產(chǎn)生碳酸根離子，促進(jìn)碳酸鹽的沉淀。

16、碳酸鹽沉淀：在碳酸根的存在下，土壤中的重金屬離子(如鉛、鎘、鋅等)能夠與碳酸根結(jié)合形成不溶于水的礦物(如碳酸鹽礦物)，從而將重金屬鎖定在土壤中。

17、其中產(chǎn)脲酶菌(ups)是微生物誘導(dǎo)碳酸鹽沉淀技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一種菌類。大量學(xué)者探索了不同細(xì)菌類型對重金屬cd、pb和zn的礦化作用，其中芽孢桿菌屬(bacilluslentus)、蠟狀芽孢桿菌屬(bacillus?cereus)、芽孢八疊球菌(sporosarcina?koreensis)以及地桿菌(terrabacter?tumescens)是處理高濃度重金屬的優(yōu)秀案例。除此之外還有枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus)、奇異變形桿菌(proteus?mirabilis)、普通變形桿菌(proteus?vulgaris)、銅綠假單胞菌(pseudomonas?aeruginosa)等都具有誘導(dǎo)碳酸鹽的能力。

18、除了細(xì)菌種類對micp技術(shù)成礦能力有影響，重金屬離子濃度、溫度、ph、鈣源以及尿素濃度同樣對碳酸鹽沉淀產(chǎn)生較大的影響。重金屬離子濃度對微生物細(xì)胞具有一定毒性，通常重金屬濃度越高對細(xì)胞的毒害作用越大。重金屬離子的進(jìn)入會引起細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而導(dǎo)致酶失活和代謝異常。ph決定了以酸為基礎(chǔ)的化學(xué)平衡，從而確定了碳酸鹽的存在和沉淀過程。溫度對含有脲酶的細(xì)菌生長有很大的影響，每種酶的相關(guān)機制都依賴于環(huán)境溫度，較高酶的釋放需要良好的環(huán)境支撐。同時ph對酶活性也有影響，有研究表明，ph從6升高到10時，脲酶活性增加，但是ph超過10時，脲酶活性降低。不同鈣源誘導(dǎo)生成的晶體也不相同，其中最穩(wěn)定的礦物為菱形的方解石沉淀，李成杰等人對氯化鈣、醋酸鈣、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣進(jìn)行了不同鈣源生成caco3的晶型研究，表明氯化鈣作為upb1菌的鈣源效果最好，且形成的菱形方解石最為穩(wěn)定。尿素的催化作用也比較依賴于環(huán)境的溫度，一般最佳溫度在20～37℃范圍內(nèi)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種重金屬耐受性菌株及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，提供一種重金屬耐受性菌株，所述菌株命名為proteusmirabilis?d2，已于2024年12月04日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址為廣東省廣州市，保藏編號為gdmcc?no：65293。

3、優(yōu)選的，所述菌株的最佳培養(yǎng)周期為36h。

4、優(yōu)選的，所述菌株為產(chǎn)脲酶菌。

5、提供一種所述的重金屬耐受性菌株的應(yīng)用，用于修復(fù)重金屬污染的土壤。

6、優(yōu)選的，所述重金屬為鉛、鎘、鋅。

7、提供一種修復(fù)重金屬污染的土壤的方法，將所述的菌株在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌液，添加尿素，然后將菌液分批次加入到被重金屬污染的土壤中，相鄰批次之間翻動若干次土壤。

8、優(yōu)選的，菌液的od600＝1，尿素的添加比例為菌液質(zhì)量的3.5％。

9、優(yōu)選的，菌液每批次的添加比例為0.5l/kg，共添加了12次，每批次之間間隔一周。

10、提供一種修復(fù)重金屬污染的菌劑，所述菌劑中包括所述的菌株。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于，實現(xiàn)具重金屬耐受和micp功能的可培養(yǎng)奇異變形桿菌(p.mirabilis?d2)對高鎘鉛鋅污染的土壤中生物毒性的有效降低，并確定技術(shù)應(yīng)用的相應(yīng)參數(shù)(包括溫度、ph值、尿素濃度)。