專(zhuān)利名稱(chēng)：源于白內(nèi)障疾病模型小鼠的多潛能細(xì)胞、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種來(lái)源于白內(nèi)障疾病小鼠的多潛能細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞(ES)其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
白內(nèi)障是嚴(yán)重影響公眾健康的重大疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界約有4500 萬(wàn)人失明，其中有一半是由白內(nèi)障導(dǎo)致的。白內(nèi)障是由遺傳和環(huán)境危險(xiǎn)因素等多種原因引起的以晶狀體混濁為主要癥狀的多因子失調(diào)眼科疾病(Mccarty C A, Taylor H R. The genetics of cataract [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001,42 (8) :1677-8.)。白內(nèi)障的遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳。遺傳性白內(nèi)障無(wú)論從臨床表現(xiàn)上還是遺傳特性上都很復(fù)雜，許多與晶狀體相關(guān)的基因突變都可導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。由于白內(nèi)障疾病的復(fù)雜性，有效的方法就是研究遺傳性單純性白內(nèi)障來(lái)進(jìn)一步深入了解可導(dǎo)致和影響晶狀體病變的所有基因及發(fā)病機(jī)制。人們最早對(duì)白內(nèi)障遺傳因素的認(rèn)識(shí)是從動(dòng)物模型開(kāi)始的，主要是鼠模型(Graw J.Mouse models of cataract [J]. J Genet, 2009,88 (4) :469-86.)。這是由于晶狀體混池能相對(duì)容易地在鼠模型中檢測(cè)到，并且可同時(shí)觀察白內(nèi)障的遺傳方式。疾病的動(dòng)物模型是體外研究該疾病的發(fā)病機(jī)制、病理過(guò)程等的強(qiáng)有力的工具。鼠模型在白內(nèi)障研究領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的遺傳性白內(nèi)障小鼠模型約有140多個(gè)，這些小鼠模型主要是通過(guò)自發(fā)突變、誘發(fā)突變、敲除突變或轉(zhuǎn)基因等方式獲得。利用小鼠動(dòng)物模型，可以克服白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展緩慢、潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病原因多樣及經(jīng)常伴有各種其它疾病等因素干擾的問(wèn)題，可以通過(guò)單一的病因，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出典型的動(dòng)物疾病模型，因此，白內(nèi)障小鼠動(dòng)物模型對(duì)于研究白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和疾病診斷治療等是極為重要的手段和工具。隨著科學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)有20多個(gè)基因位點(diǎn)被證明與先天性白內(nèi)障有關(guān)，其中17 個(gè)基因已經(jīng)被完全克隆出來(lái)(He ff, Li S. Congenitalcataracts gene mapping [J]. Hum Genet, 2000,106 (I) : 1_13.)，人們對(duì)白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制也逐漸有了一定的了解，但仍然還有許多家庭受到未知基因突變引起的白內(nèi)障的影響。已發(fā)現(xiàn)的白內(nèi)障小鼠突變系中，也還有部分突變基因在其分子水平尚未明確定義，即使是那些已知與白內(nèi)障有關(guān)的基因，其確切的機(jī)制也還沒(méi)有完全弄清楚。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，先天性白內(nèi)障的診斷和治療已非難事，但目前診斷仍以癥狀學(xué)診斷為主，治療以手術(shù)為主，且手術(shù)治療后會(huì)有一定的并發(fā)癥?；蛟S可以仿效其他遺傳性疾病的做法，通過(guò)對(duì)胎兒期疾病基因篩選等方法，將疾病診斷提前到胎兒期，為有效的治療提供時(shí)機(jī)及依據(jù)，再通過(guò)基因治療的手段，將遺傳性白內(nèi)障控制在白內(nèi)障尚未形成或尚未完全形成之前，以實(shí)現(xiàn)在基因水平對(duì)遺傳性白內(nèi)障的防治?；蛑委熗ǔＴ诩?xì)胞水平進(jìn)行操作，而具有多能性的胚胎干細(xì)胞無(wú)疑是最佳選擇。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES)是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中克隆出來(lái)的一類(lèi)細(xì)胞，在理想的條件下培養(yǎng)，這類(lèi)細(xì)胞能維持其無(wú)限自我更新增殖潛能，并可以分化為包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的多種類(lèi)型子細(xì)胞，具有發(fā)育成完整生命個(gè)體的能力(Martin G R. Isolation of a pluripotentcell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned byteratocarcinoma stem cells [J].Proc Natl Acad Sci USA, 1981,78 (12) :7634-8 ；Mastui Y, Zsebo K, Hongan B L. Derivation ofpluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cellsin culture[J]· Cell,1992, 70(5) :841-7.)。胚胎干細(xì)胞的用途很多，在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域都有很重要而深遠(yuǎn)的影響。胚胎干細(xì)胞的全能性、可遺傳操作性和無(wú)限擴(kuò)增能力，使其成為細(xì)胞和分子水平上研究個(gè)體發(fā)育過(guò)程中極早期事件的良好材料和方法。隨著人類(lèi)基因組學(xué)研究基因芯片、基因誘捕等生物技術(shù)的應(yīng)用，比較ES細(xì)胞及不同發(fā)育階段的細(xì)胞和分化細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可確定胚胎發(fā)育及細(xì)胞分化的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新基因。結(jié)合基因打靶技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)不同基因在生命活動(dòng)中的功能等。胚胎干細(xì)胞還提供了新藥物的藥理藥效、毒理及藥物代謝等研究的細(xì)胞水平的研究手段，可大大減少藥物實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，ES細(xì)胞還可用來(lái)研究動(dòng)物和人類(lèi)疾病的發(fā)生機(jī)制和發(fā)展，過(guò)程以便找到有效和持久的治療方法。此外通過(guò)ES細(xì)胞和基因治療技術(shù)，還有可能矯正缺陷基因。1981年，Evans等采用STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，在添加了血清的培養(yǎng)液中成功從囊胚 ICM 中培養(yǎng)了小鼠 ES 細(xì)胞(Evans M J, Kaufman M H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature,1981,292(5819) :154-156.)。 Martin GR以免疫外科法剝得囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)并將其置于STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上，并用小鼠PSA21-ES細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到小鼠ES細(xì)胞(Marin G R. Isolation of apluripotent cell line from early mouse embryos cultured in mediumconditioned by teratocarcinoma stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(12) :7634-8.)。 Dhhaise等將8-細(xì)胞小鼠胚胎消化成單個(gè)分裂球并培養(yǎng)于小鼠原代成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上， 以添加了胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，建立了一個(gè)ES細(xì)胞系MSBl，該細(xì)胞系細(xì)胞具有形成嵌合鼠的能力。上述研究者都是應(yīng)用經(jīng)典的飼養(yǎng)層加血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)獲得小鼠 ES細(xì)胞。雖然科學(xué)家用這個(gè)體系成功建立了多種小鼠品系的ES細(xì)胞系，但是這種培養(yǎng)體系仍存在很多不足。如飼養(yǎng)層細(xì)胞不具耐藥性，因此無(wú)法用于轉(zhuǎn)染外源性基因的胚胎干細(xì)胞篩選，且死亡的飼養(yǎng)層細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致ES細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持(Suemori H, Nakatsuji N. Establishment of the Embryo-derived Stem(ES)Cell Linesfrom mouse blastocysts effects of the feeder cell layers[J]. DevelopmentGrowth & Differentiation, 1987，29 (2) :133-9.)。最重要的是飼養(yǎng)層和血清都具有動(dòng)物源性，且成分復(fù)雜，作用機(jī)制不清，具有不確定性和不可控性，因而限制了更多胚胎干細(xì)胞系的成功建立。2003年，Ying等人發(fā)現(xiàn)，血清中起作用的成分為BMP4，并利用LIF+BMP4的無(wú)血清無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系成功建立了小鼠ES細(xì)胞系(YingQ L,Nichols J, Chambers I, et al.BMP induction of Id proteinssuppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3[J]. Cell,2003,115(3) :281-92.) 2007 年，Ying等更在含有MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗劑的無(wú)血清培養(yǎng)基中獲得多能細(xì)胞(包括小鼠ES細(xì)胞)，并在其中保持自我更新?tīng)顟B(tài)(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00780011232. 5)。該培養(yǎng)體系的優(yōu)點(diǎn)在于不添加來(lái)自飼養(yǎng)層和血清中任一刺激更新維持ES細(xì)胞不分化狀態(tài)的成份，越來(lái)越多小鼠品系的胚胎干細(xì)胞系利用該培養(yǎng)體系得以建成，如NOD小鼠ES 系、C57BL/6N小鼠ES系和非肥胖型糖尿病小鼠ES細(xì)胞系等(Ohta H，Ohinata Y，Ikawa M, et al. Male germline and embryonic stem cell linesfrom NOD mice !efficient derivation of Gscells from a nonpermissivestrain for ES cell derivation[J]. Biology of reproduction,2009,81(6) :1147 ；Kiyonari H,Kaneko M,Abe S,et al. Three inhibitors ofFGF receptor, ERK, and GSK3establishes germline-competentembryonic stem cells of C57BL/6N mouse strain with high efficiencyand stability. Genesis, 48(5) :317-27 ；Nichols J, Jone K, Phillips J, et al. Validated germline-competent embryonic stem cell lines from nonobesediabetic mice. Nature medicine,2009, 15(7) :814-8.)。但目前為止，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于成功獲得來(lái)源于白內(nèi)障動(dòng)物模型的胚胎干細(xì)胞的報(bào)道。同時(shí)本領(lǐng)域急需獲得白內(nèi)障小鼠的胚胎干細(xì)胞，在細(xì)胞水平上為研究白內(nèi)障疾病，如發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選及基因治療等提供新的材料和方法。與動(dòng)物模型相比，胚胎干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于可以更為方便的進(jìn)行大規(guī)模的遺傳操作、篩選。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明人進(jìn)行多方面的研究，終于以白內(nèi)障小鼠為原材料，成功地從白內(nèi)障小鼠的早期胚胎中培養(yǎng)獲得了白內(nèi)障小鼠的胚胎干細(xì)胞、并驗(yàn)證了以白內(nèi)障小鼠為來(lái)源可以成功獲得具有白內(nèi)障遺傳信息的胚胎干細(xì)胞的方法是可行的。具體地，本發(fā)明包括以下幾項(xiàng)本發(fā)明的第一方面涉及一種多潛能細(xì)胞，其分離自白內(nèi)障疾病模型小鼠，優(yōu)選地，所述的模型小鼠為遺傳性白內(nèi)障疾病模型小鼠，優(yōu)選地，所述的遺傳性白內(nèi)障疾病模型小鼠選自a :遺傳性BALB/cCat/Cat白內(nèi)障小鼠；b:Philly 小鼠;c =Crybal基因突變小鼠；d :顯性白內(nèi)障小鼠Hif ;進(jìn)一步優(yōu)選為遺傳性BALB/cGat/Gat白內(nèi)障小鼠；優(yōu)選地，所述的多潛能細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明第一方面所述的多潛能細(xì)胞，其分離自白內(nèi)障疾病模型小鼠的早期胚胎。本發(fā)明第一方面所述的多潛能細(xì)胞，其表達(dá)堿性磷酸酶、SSEAl基因和/或選自 0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；優(yōu)選地,該多潛能細(xì)胞表達(dá)0ct4、Nanog和Sox2 ；更優(yōu)選地,該多潛能細(xì)胞表達(dá)0ct4、Nanog、Sox2和Eras ；進(jìn)一步優(yōu)選地,該多潛能細(xì)胞同時(shí)表達(dá)堿性磷酸酶、SSEAl以及選自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utf I、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；更進(jìn)一步優(yōu)選地，該多潛能細(xì)胞同時(shí)表達(dá)堿性磷酸酶、SSEAU 0ct4、Nanog和 Sox2。
本發(fā)明第一方面所述的多潛能細(xì)胞，其可形成畸胎瘤或畸胎癌，優(yōu)選地，所形成的畸胎瘤或畸胎癌中含有源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個(gè)胚層的分化細(xì)胞。本發(fā)明第一方面所述的多潛能細(xì)胞，其在培養(yǎng)基中可作為單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖。本發(fā)明第一方面所述的多潛能細(xì)胞，其可形成嵌合體；優(yōu)選地，所述嵌合體中的所有細(xì)胞與所述多潛能細(xì)胞源于同一親本；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的嵌合體為嵌合鼠； 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的嵌合鼠患有白內(nèi)障疾病。本發(fā)明的第二方面涉及一種多潛能細(xì)胞，其是保藏號(hào)為CCTCCC201217、于2012年 2月15日保藏在地址是中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的遺傳性BALB/ceat/eat白內(nèi)障小鼠的胚胎干細(xì)胞系。本發(fā)明的第三方面涉及一種嵌合鼠，由前述任一項(xiàng)的多潛能細(xì)胞與受體胚胎聚合后，培育獲得。本發(fā)明的第四方面涉及一種多潛能細(xì)胞群，其包含前述任一項(xiàng)所述的多潛能細(xì)胞；優(yōu)選地，其包含至少95%的所述的多潛能細(xì)胞。本發(fā)明的第五方面涉及一種分離多潛能細(xì)胞的方法，該方法從白內(nèi)障疾病模型小鼠中分離獲得多潛能細(xì)胞，優(yōu)選地，從白內(nèi)障疾病模型小鼠的早期胚胎中分離獲得多潛能細(xì)胞。優(yōu)選地，該方法包括以下步驟(I)使白內(nèi)障小鼠母鼠與白內(nèi)障小鼠公鼠交配，使母鼠受孕；(2)從受孕母鼠的子宮中獲得囊胚；(3)從步驟⑵的囊胚獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM, inner cell mass :哺乳類(lèi)囊胚中位于囊胚腔一側(cè)的具有全能性的細(xì)胞團(tuán))；(4)任選地，從步驟(3)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分選一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成集落；優(yōu)選將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)用胰酶消化后傳代培養(yǎng)；(5)任選地，從步驟⑷的集落獲得單克隆，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述的方法包括以下步驟選擇6周齡以上性成熟的所述的白內(nèi)障小鼠母鼠與成年公鼠交配使母鼠受孕；從受孕的白內(nèi)障疾病模型小鼠子宮中沖取囊胚，用培養(yǎng)液培養(yǎng)得到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，解離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，消化成單細(xì)胞后，傳代培養(yǎng)，獲得所述的能無(wú)限傳代的多潛能細(xì)胞；優(yōu)選地，所述的受孕的白內(nèi)障疾病模型小鼠為受孕3. 5dpc的小鼠；優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)液為添加了 GSK3抑制劑CHIR99021和蛋白激酶抑制劑 PD0325901 的 N2B27 培養(yǎng)液；優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)液中GSK3抑制劑CHIR99021的終濃度為I 5 μ M，優(yōu)選為2 4 μ Μ，更優(yōu)選為3 μ Μ，蛋白激酶抑制劑Η)0325901的終濃度為O. 5 3. 5 μ M，優(yōu)選為I 3 μ Μ，更優(yōu)選為2 μ M ;優(yōu)選地，消化時(shí)使用的是胰蛋白酶，濃度為0. 25%，37°C消化I 2min。本發(fā)明的第六方面涉及前述任一項(xiàng)的多潛能細(xì)胞或嵌合鼠或多潛能細(xì)胞群的使用方法，其包括在藥物篩選、白內(nèi)障機(jī)理研究、基因治療細(xì)胞、動(dòng)物模型中在合適的條件下使用所述多潛能細(xì)胞或嵌合鼠或多潛能細(xì)胞群；優(yōu)選地，所述使用包括與藥物接觸、作為對(duì)照以及基因?qū)氚悬c(diǎn)。優(yōu)選地，所述的藥物為治療白內(nèi)障疾病的藥物。本發(fā)明的第七方面涉及前述任一項(xiàng)的多潛能細(xì)胞或嵌合鼠或多潛能細(xì)胞群，用于篩選藥物的用途，或者用于制備基因治療藥物的用途；優(yōu)選地，所述的藥物為治療白內(nèi)障疾病的藥物。綜上所述，本發(fā)明涉及的白內(nèi)障小鼠多潛能細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞特性，其堿性磷酸酶表達(dá)呈陽(yáng)性；胚胎時(shí)期細(xì)胞表面特異性抗原SSEA-I表達(dá)陽(yáng)性；表達(dá)0ct4、Nanog、和 Sox2等多種與多潛能相關(guān)的基因；特別的具有產(chǎn)生含有三個(gè)原胚層(外胚層、內(nèi)胚層和中胚層)分化細(xì)胞的畸胎瘤的能力以及助于形成嵌合體的能力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的來(lái)自遺傳性白內(nèi)障小鼠的多潛能細(xì)胞，其主要特征是(I)同時(shí)表達(dá)堿性磷酸酶、SSEAl 以及 0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、 Cripto、Rexl、Gdf3等多潛能相關(guān)的基因，這些基因的表達(dá)證明該細(xì)胞株處于未分化狀態(tài)；(2)可以在無(wú)血清無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)；(3)可在體外長(zhǎng)期傳代和擴(kuò)增；(4)自然分化形成擬胚體后,外胚層Nestin (+),原始外胚層GATA4(+)、Soxl7 (+), 內(nèi)胚層標(biāo)志基因AFP (+)，中胚層Flkl (+)；(5)注入裸鼠后形成畸胎瘤，畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的所有分化細(xì)胞；(6)能形成嵌合鼠，且嵌合鼠患有白內(nèi)障疾病。本發(fā)明提供了體外培養(yǎng)白內(nèi)障動(dòng)物模型胚胎干細(xì)胞的思路，所獲得的多潛能細(xì)胞可用于白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究、治療白內(nèi)障藥物的篩選及提供基因治療手段的研究載體， 為白內(nèi)障疾病研究提供了的新的材料和方法。


圖I是白內(nèi)障小鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)從透明帶中孵化出來(lái)貼壁后的形態(tài)。圖2是白內(nèi)障小鼠ES經(jīng)多次傳代后的細(xì)胞形態(tài)。圖3是白內(nèi)障小鼠ES堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果。圖4是Reverse Transcription-PCR檢測(cè)白內(nèi)障小鼠ES未分化marker表達(dá)情況的電泳圖，從左到右泳道依次是陽(yáng)性對(duì)照46CES細(xì)胞、129小鼠尾巴成纖維細(xì)胞、白內(nèi)障小鼠ES細(xì)胞株4、白內(nèi)障小鼠ES細(xì)胞株5、白內(nèi)障小鼠ES細(xì)胞株6。圖5是免疫熒光染色檢測(cè)白內(nèi)障小鼠ES干細(xì)胞相關(guān)marker表達(dá)情況，其中A為 SSEAl染色結(jié)果，B為0ct4染色結(jié)果，C為Nanog染色結(jié)果，D為Sox2染色結(jié)果。圖6是Reverse Transcription-PCR檢測(cè)白內(nèi)障小鼠ES在體外向三個(gè)胚層的分化潛能，從左到右泳道依次是白內(nèi)障小鼠ES細(xì)胞，5天的擬胚體，10天后自然分化的擬胚體。圖7是白內(nèi)障小鼠ES畸胎瘤形成情況，其中A為神經(jīng)組織(外胚層)，B為肌肉組織(中胚層)，C為上皮組織(內(nèi)胚層)。
圖8是白內(nèi)障小鼠ES參與形成的具有白內(nèi)障疾病的嵌合鼠。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。以下實(shí)施例中，用到的培養(yǎng)基有胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基為2i培養(yǎng)基，具體組成為49% DMEM/F12 (購(gòu)自GIBCO公司)， 49 % Neurobasal Medium (購(gòu)自 GIBCO 公司)，O. 5 X L-谷氨酰胺(購(gòu)自 GIBCO 公司)、 IX 巰基乙醇(購(gòu)自GIBCO公司)、1ΧΝ2(購(gòu)自GIBCO公司)、1ΧΒ27(購(gòu)自GIBCO公司)、3 μ M CHIR99021 (購(gòu)自 Stemgent 公司)、2 μ M PD0325901 (購(gòu)自 Stemgent 公司)。此培養(yǎng)基用于獲取并維持源于白內(nèi)障小鼠的ES細(xì)胞。擬胚體培養(yǎng)基具體成分為79% DMEM/F12(購(gòu)自GIBCO公司)，20% FBS(購(gòu)自 PAA公司)，1%非必須氨基酸(購(gòu)自GIBCO公司)，O. 5 X L-谷氨酰胺(購(gòu)自GIBCO公司)， IX β-巰基乙醇(購(gòu)自GIBCO公司)。實(shí)施例I、白內(nèi)障小鼠囊胚的獲取取6-8周齡的遺傳性BALB/ceat/eat白內(nèi)障母鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，于14:00左右，腹腔注射PMSG(孕馬血清促性腺激素，Pregnant Mare Serum Gonadotrophin) (10IU/ 只),48h 后注射 HCG(人絨毛膜促性腺激素，human chorionic gonadotrophin) (10IU/只)，挑選有交配經(jīng)驗(yàn)的同品系白內(nèi)障公鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，按公鼠母鼠2 I比例合籠。次日早上見(jiàn)栓記為懷孕0.5d。見(jiàn)栓第4 天(懷孕3. 5d)，斷頸處死母鼠，75%乙醇消毒；在無(wú)菌環(huán)境下暴露子宮，用鑷子取出子宮置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。用Iml無(wú)菌注射器吸入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, PAA公司)的DMEM/F12(GIBC0公司)作為沖卵液，從子宮角端進(jìn)針進(jìn)行沖胚(具體步驟請(qǐng)參見(jiàn) 安德拉斯，瑪麗娜，克里斯蒂娜，等.小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)[M].孫青原，陳大元主譯.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005.)。在立體解剖顯微鏡下尋找處于囊胚期的胚胎，用取卵針(商購(gòu)，也可自制，只要針口孔徑大小較胚胎大小稍大，可吸取胚胎即可)收集。在沖胚前一天,將經(jīng)絲裂霉素C滅活的MEF (mouse embryof ibroblast,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物，第3代)以300個(gè)細(xì)胞/孔鋪在96孔培養(yǎng)板中制備飼養(yǎng)細(xì)胞。將收集的囊胚期胚胎置于上述飼養(yǎng)細(xì)胞上，每孔I個(gè)囊胚，加入100微升添加了 GSK3抑制劑CHIR99021 (Stemgent公司，終濃度3 μ M)和蛋白激酶抑制劑 PD0325901 (Stemgent公司，終濃度2 μ Μ)的Ν2Β27培養(yǎng)液，置于37°C>5% C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天更換一次培養(yǎng)液。實(shí)施例2、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)自然孵化及胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)施例I中獲得的囊胚期胚胎在所述的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)I 2天后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM)開(kāi)始向透明帶外孵出，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，孵出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)呈克隆團(tuán)狀貼壁生長(zhǎng)(參見(jiàn)圖I)。吸去培養(yǎng)液，用0.25%的胰酶37°C消化I 2min，添加FBS (胎牛血清) 終止消化，用移液器輕輕吹打，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)解離成單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)，IOOOrpm離心2min，棄上清，用添加了 GSK3抑制劑CHIR99021 (Stemgent公司，終濃度3 μ M)和蛋白激酶抑制劑 PD0325901 (Stemgent公司，終濃度2 μ Μ)的Ν2Β27培養(yǎng)液重懸，傳代至鋪有MEF飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔板中(原一個(gè)96孔的細(xì)胞，消化后仍然直接傳到一個(gè)96孔中培養(yǎng))，37°C、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按上述方法胰酶消化傳代培養(yǎng)2 3代，此時(shí)細(xì)胞增殖很快，之后每三天即可傳一代(此時(shí)傳代比率視實(shí)際克隆數(shù)而定)。傳代后的細(xì)胞形態(tài)鏡檢結(jié)果如圖2所示，由圖可以看出，獲得的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)類(lèi)似胚胎干細(xì)胞，呈克隆狀生長(zhǎng)，邊緣清晰，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密。實(shí)施例3、胚胎干細(xì)胞特性檢測(cè)3. I堿性磷酸酶表達(dá)取實(shí)施例2中獲得的干細(xì)胞，用4%多聚甲醛(PAF)固定lOmin，用PBS洗3次，每次所用時(shí)間分別為5min、10min、15min,盡可能的去除多聚甲醒。加入O. 5ml α -萘酹Tris base Fast red TR = I : 4 : 5混合染液，室溫孵育5 lOmin，吸去染液，用PBS漂洗終止反應(yīng)。顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，細(xì)胞被染成紅色，而紅色表示具有堿性磷酸酶活性，從而說(shuō)明， 實(shí)施例2獲得的細(xì)胞具有很強(qiáng)的堿性磷酸酶活性，進(jìn)一步的說(shuō)，培養(yǎng)的細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞特性，即表達(dá)堿性磷酸酶。3. 2未分化狀態(tài)檢測(cè)3.2. IReverse Transcription-PCR方法檢測(cè)分析實(shí)施例2獲得的細(xì)胞未分化基因表達(dá)水平由于未分化的細(xì)胞會(huì)特異性表達(dá)以下基因，包括0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、 Fgf4、UtfI、Cripto、Rexl、Gdf3，所以可以通過(guò)檢測(cè)這些基因的表達(dá)情況得知實(shí)施例2中所獲得的細(xì)胞的未分化狀態(tài)。未分化marker引物序列設(shè)計(jì)如表I所示，其中以Eif4g2作為內(nèi)參,引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(其中F表不正向引物，R表不反向引物)。表I
權(quán)利要求
1.一種多潛能細(xì)胞，其分離自白內(nèi)障疾病模型小鼠，優(yōu)選地，所述的模型小鼠為遺傳性白內(nèi)障疾病模型小鼠，優(yōu)選地，所述的遺傳性白內(nèi)障疾病模型小鼠選自 a :遺傳性BALB/cGat/Gat白內(nèi)障小鼠； b Philly 小鼠； c =Crybal基因突變小鼠； d:顯性白內(nèi)障小鼠Hif;進(jìn)一步優(yōu)選為遺傳性BALB/ceat/eat白內(nèi)障小鼠；優(yōu)選地，所述的多潛能細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。
2.權(quán)利要求I的多潛能細(xì)胞，其分離自白內(nèi)障疾病模型小鼠的早期胚胎。
3.權(quán)利要求I的多潛能細(xì)胞，其表達(dá)堿性磷酸酶、SSEAl基因和/或選自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；優(yōu)選地，該多潛能細(xì)胞表達(dá)0ct4、Nanog和Sox2 ；更優(yōu)選地，該多潛能細(xì)胞表達(dá)0ct4、Nanog、Sox2和Eras ；進(jìn)一步優(yōu)選地，該多潛能細(xì)胞同時(shí)表達(dá)堿性磷酸酶、SSEAl以及選自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utf I、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；更進(jìn)一步優(yōu)選地，該多潛能細(xì)胞同時(shí)表達(dá)堿性磷酸酶、SSEA1、0ct4、Nanog和Sox2。
4.權(quán)利要求I的多潛能細(xì)胞，其可形成畸胎瘤或畸胎癌，優(yōu)選地，所形成的畸胎瘤或畸胎癌中含有源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個(gè)胚層的分化細(xì)胞。
5.權(quán)利要求I的多潛能細(xì)胞，其在培養(yǎng)基中可作為單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖。
6.權(quán)利要求I的多潛能細(xì)胞，其可形成嵌合體；優(yōu)選地，所述嵌合體中的所有細(xì)胞與所述多潛能細(xì)胞源于同一親本；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的嵌合體為嵌合鼠；更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的嵌合鼠患有白內(nèi)障疾病。
7.一種多潛能細(xì)胞，其是保藏號(hào)為CCTCC C201217、于2012年2月15日保藏在地址是中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的胚胎干細(xì)胞。
8.一種嵌合鼠，由權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)的多潛能細(xì)胞與受體胚胎聚合后，培育獲得。
9.一種多潛能細(xì)胞群，其包含權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)所述的多潛能細(xì)胞；優(yōu)選地，其包含至少95%的權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)所述的多潛能細(xì)胞。
10.一種分離多潛能細(xì)胞的方法，該方法從白內(nèi)障疾病模型小鼠中分離獲得多潛能細(xì)胞，優(yōu)選地，從白內(nèi)障疾病模型小鼠的早期胚胎中分離獲得多潛能細(xì)胞；優(yōu)選地，該方法包括以下步驟(1)使白內(nèi)障小鼠母鼠與白內(nèi)障小鼠公鼠交配，使母鼠受孕；(2)從受孕母鼠的子宮中獲得囊胚；(3)從步驟(2)的囊胚獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；(4)任選地，從步驟(3)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分選一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成集落；優(yōu)選將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)用胰酶消化后傳代培養(yǎng)；(5)任選地，從步驟(4)的集落獲得單克隆，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
11.權(quán)利要求10的方法，包括以下步驟選擇6周齡以上性成熟的權(quán)利要求I所述的白內(nèi)障小鼠母鼠與成年公鼠交配使母鼠受孕；從受孕的白內(nèi)障疾病模型小鼠子宮中沖取囊胚，用培養(yǎng)液培養(yǎng)得到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，解離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，消化成單細(xì)胞后，傳代培養(yǎng)，獲得所述的能無(wú)限傳代的多潛能細(xì)胞；優(yōu)選地，所述的受孕的白內(nèi)障疾病模型小鼠為受孕3. 5dpc的小鼠；優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)液為添加了 GSK3抑制劑CHIR99021和蛋白激酶抑制劑Η)0325901 的Ν2Β27培養(yǎng)液；優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)液中GSK3抑制劑CHIR99021的終濃度為I 5 μ Μ，優(yōu)選為2 4 μ Μ，更優(yōu)選為3 μ Μ，蛋白激酶抑制劑Η)0325901的終濃度為O. 5 3. 5 μ M，優(yōu)選為I 3 μ Μ，更優(yōu)選為2 μ M ;優(yōu)選地，消化時(shí)使用的是胰蛋白酶，濃度為0. 25%，37°C消化I 2min。
12.權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)的多潛能細(xì)胞或權(quán)利要求8的嵌合鼠或權(quán)利要求9的多潛能細(xì)胞群的使用方法，其包括在藥物篩選、白內(nèi)障機(jī)理研究、基因治療細(xì)胞、動(dòng)物模型中在合適的條件下使用所述多潛能細(xì)胞或嵌合鼠或多潛能細(xì)胞群；優(yōu)選地，所述使用包括與藥物接觸、作為對(duì)照以及基因?qū)氚悬c(diǎn)；優(yōu)選地，所述的藥物為治療白內(nèi)障疾病的藥物。
13.權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)的多潛能細(xì)胞或權(quán)利要求8的嵌合鼠或權(quán)利要求9的多潛能細(xì)胞群，用于篩選藥物的用途，或者用于制備基因治療藥物的用途；優(yōu)選地，所述的藥物為治療白內(nèi)障疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種源于遺傳性白內(nèi)障小鼠的多潛能細(xì)胞，本發(fā)明的多潛能細(xì)胞來(lái)源于白內(nèi)障疾病模型小鼠，經(jīng)檢測(cè)確定具有胚胎干細(xì)胞特性。本發(fā)明可用于白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究、治療白內(nèi)障藥物的篩選及提供基因治療手段的研究載體，為白內(nèi)障疾病研究提供了的新的材料和方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102586174SQ201210044230
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉韜, 周秀梅, 張麗青, 李林芳, 錢(qián)其軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院