專利名稱：非酒精性脂肪肝小鼠模型的造模加工方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型的造模工藝，特別涉及一種非酒精性脂肪肝小鼠模型新型工藝。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)有了明顯的改變，被稱為“富貴病”的脂肪性肝病(也稱脂肪肝)發(fā)病率明顯提高，尤其是在亞洲。已成為僅次于病毒性肝炎的第二大高發(fā)性肝病。脂肪肝由多種誘因引起，病變主體在肝小葉，是常見的彌漫性肝病之一，以肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)蓄積過多和彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要病理特性。臨床上根據(jù)是否有過量酒精攝入，將脂肪肝分為酒精性脂肪肝病(alcoholic fatty liver disease, AFLD)和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)。非酒精性脂肪肝病 較為復(fù)雜化，如若不及時(shí)加以控制，從而會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和肝纖維化發(fā)生。它是一種無過量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪變性等特征的病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)病理過程。針對(duì)該病理過程，各醫(yī)療醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)都在研究治療非酒精性脂肪肝病的特效藥，在此背景下無論是新藥的安全性評(píng)價(jià)還是療效都需要有動(dòng)物模型進(jìn)行檢測(cè)。非酒精性脂肪肝小鼠模型的高效造模方法就顯得格外重要了。目前市場(chǎng)沒有出售具有穩(wěn)定遺傳性的非酒精性脂肪肝模型小鼠，都是需要后天培養(yǎng)改造的。針對(duì)于不同的造模方法，得出模型小鼠的時(shí)間也就長(zhǎng)短不一。一般造非酒精性脂肪肝模型的方法原理主要從兩方面同時(shí)進(jìn)行。即四氯化碳的腹腔注射可以導(dǎo)致肝臟的急性損傷，再配合著復(fù)合高脂飼料導(dǎo)致肝臟的病變，主要表現(xiàn)在肝細(xì)胞膜被四氯化碳破損，高脂飼料中的高熱量以脂肪滴的形式進(jìn)入。在上述研究中，全部是以高脂飼料及四氯化碳的量和時(shí)間的堆積而成。只求結(jié)果而不顧成本和效率，導(dǎo)致造模成功率低下，死亡率上升并且造模的整個(gè)過程時(shí)間冗長(zhǎng)。且傳統(tǒng)的造模方式為提高高脂飼料的熱量將豬油成分比值提高，加蔗糖少量，再配合其他藥物與基礎(chǔ)飼料混合壓制成條。剛開始小鼠食欲還是比較大的，但是由于豬油含量太高容易產(chǎn)生飽腹感及油膩感導(dǎo)致小鼠食欲不振食量明顯下降，從而拉長(zhǎng)的造模的時(shí)間。傳統(tǒng)造模方法還有一弊端，即四氯化碳每次注射劑量為10%，每次0.2ml。四氯化碳濃度高了可以有效導(dǎo)致肝細(xì)胞的損壞，但是小鼠體質(zhì)較弱或狀態(tài)不好該劑量的腹腔注射很容易導(dǎo)致模型動(dòng)物的猝死。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法及應(yīng)用，它在制備獲得動(dòng)物模型的同時(shí)，能有效縮短造模時(shí)間節(jié)約造模成本。本發(fā)明的技術(shù)方案一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，包含以下步驟
(I)取健康小鼠，先在動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3-7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎(chǔ)飼料；(2)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每日飼喂復(fù)合高脂飼料；
(3)兩周后給小鼠進(jìn)行腹腔注射濃度5%CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態(tài)持續(xù)至第28天，同時(shí)飼喂復(fù)合高脂飼料；即得。所述的復(fù)合高脂飼料，其配方為2%膽固醇+0. 5%膽酸鈉+0. 2%丙基硫氧嘧啶+5%焦糖+10%豬油+82. 3%基礎(chǔ)飼料。所述的按小鼠的重量計(jì)，四氯化碳的注射劑量為O. lml/10go所述的在動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在18°C 29°C，相對(duì)濕度在40 70%，保證環(huán)境清潔空氣流通。本發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用蔗糖高溫化為焦糖后代替了傳 統(tǒng)聞脂詞料中的鹿糖，此法提聞了復(fù)合聞脂詞料特有的香氣，從而刺激|旲型小鼠的食欲，解決了傳統(tǒng)高脂飼料降低模型小鼠食欲的問題，并且焦糖香味掩蓋了豬油冷卻后的油膩味道。焦糖還可以增長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，從而使甘油三酯的合成增加。本發(fā)明把傳統(tǒng)腹腔注射的10%CC14液換5% CCl4液并分為兩次注射，大大降低了造模的死亡率，并且達(dá)到造模死亡率為0%的理想狀態(tài)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，容易實(shí)施，成本低廉，使用效果好，具有較大的應(yīng)用推廣前景。


圖I為非酒精性脂肪肝模型小鼠肝勻漿檢測(cè)結(jié)果；
圖2為非酒精性脂肪肝模型小鼠血清檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例為了證明該種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法的有效性，因此進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)
模型小鼠與正常小鼠的血清TC、TG含量比對(duì)
I、購買具有動(dòng)物號(hào)的昆明種清潔級(jí)的小鼠24只，雌雄各半，體重在18g左右的。購買到實(shí)驗(yàn)室后先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3天到一周左右，看小鼠情況而定。狀況良好適應(yīng)3天即可，否則要延長(zhǎng)7天。7天時(shí)狀況還不佳(指不夠活潑好動(dòng)的)則廢棄不投入實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槔ッ鞣N小鼠比較活潑好斗，尤其是雄性小鼠。每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎(chǔ)飼料。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為兩組，一組為正常對(duì)照組一組為模型組。每組12只雌雄各6只，每組雌雄小鼠分開飼養(yǎng)，每個(gè)鼠籠里6只小鼠。2、在動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在18 °C 29 °C，相對(duì)濕度在40 70%，保證環(huán)境清潔空氣流通。3、空白對(duì)照組每日飼喂基礎(chǔ)鼠飼料，模型組每日飼喂復(fù)合高脂飼料，其配方為2%膽固醇+0. 5%膽酸鈉+0. 2%丙基硫氧嘧啶+5%蔗糖(高溫下轉(zhuǎn)化為焦糖后使用)+10%豬油+82. 3%基礎(chǔ)飼料。按此方法飼喂兩周。4、兩周后給模型組小鼠進(jìn)行腹腔注射濃度5% CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液(因?yàn)樗穆然疾蝗苡谒?。每次腹腔注射均需新鮮配制方可。將模型小鼠精確稱量后以其質(zhì)量多少按照每IOg腹腔注射O. Iml的原則換算注射每只模型小鼠的腹腔注射劑量。腹腔注射狀態(tài)持續(xù)至第28天，同時(shí)飼喂復(fù)合高脂飼料。5、28天后，停止所有操作將兩組實(shí)驗(yàn)小鼠停食不停水24h，24h后對(duì)兩組小鼠精確稱重并記錄，采血。小鼠稱重后放入小鼠尾靜脈注射固定器，從其尾部采血。75%的酒精擦拭尾部后，注射器針頭扁平刺進(jìn)血管，每只小鼠抽取O. 2ml O. 3ml，抗凝血?jiǎng)┯肙. 9%的生理鹽水即可。若有渾濁則冷凍離心(3500r/min，lOmin)，取上清液待用。6、取血后將小鼠移出固定器，提起其尾部旋轉(zhuǎn)七八圈，放其至摩擦力大的平面上。由于小鼠被轉(zhuǎn)有暈眩感而趴在桌面上不能動(dòng)，此時(shí)拉其尾部和頭部以頸椎脫白法處死。待其不動(dòng)立即解剖，此時(shí)小鼠的心臟還在搏動(dòng)，取新鮮肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸去表面的水分，立即稱重記錄。7、取肝臟中葉，剪取IOOmg加9倍體積的異丙醇，在冰上研磨成10%肝勻漿，4°C提取24h，離心(3000r/min)，提取上清液待用。用甘油三酯試劑盒、膽固醇試劑盒分別檢測(cè)兩組實(shí)驗(yàn)小鼠的血清和肝勻漿。兩者 均在檢測(cè)波長(zhǎng)500nm處測(cè)定光吸收值(OD值)。統(tǒng)計(jì)分析處理數(shù)據(jù)如下圖I和圖2所示。根據(jù)圖I可以得知，模型組的小鼠在第29天時(shí)，肝系數(shù)、甘油三酯含量以及膽固醇含量較正常對(duì)照組小鼠均嚴(yán)重超標(biāo)。整個(gè)造模時(shí)間只用了 28天即成，其中無一小鼠死亡。
權(quán)利要求
1.一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于包含以下步驟 (1)取健康小鼠，先在動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3-7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎(chǔ)飼料； (2)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每日飼喂復(fù)合高脂飼料； (3)兩周后給小鼠進(jìn)行腹腔注射濃度5%CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態(tài)持續(xù)至第28天，同時(shí)飼喂復(fù)合高脂飼料；即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于復(fù)合高脂飼料，其配方為2%膽固醇+0. 5%膽酸鈉+0. 2%丙基硫氧嘧啶+5%焦糖+10%豬油+82. 3%基礎(chǔ)飼料。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于按小鼠的重量計(jì)，四氯化碳的注射劑量為O. lml/10go
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于在動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在18°C 29°C，相對(duì)濕度在40 70%，保證環(huán)境清潔空氣流通。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非酒精性脂肪肝模型小鼠的造模方法，其特征在于包含以下步驟(1)取健康小鼠，先在動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3-7天，每天更換鼠籠墊料和清水，在此期間飼喂基礎(chǔ)飼料；(2)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每日飼喂復(fù)合高脂飼料；(3)兩周后給小鼠進(jìn)行腹腔注射濃度5%CCl4液，用去離子水將液體四氯化碳稀釋至濃度為5%的乳濁液，每次腹腔注射均需新鮮配制方可；腹腔注射狀態(tài)持續(xù)至第28天，同時(shí)飼喂復(fù)合高脂飼料；即得。此造模方法歷時(shí)短、造模成功率高、死亡率極低、成本低。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102972345SQ20121053366
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者陳祥盛, 薛琰, 肖思衛(wèi) 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)