本發(fā)明屬于藥物領域，特別提供一種采用Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的方法。

背景技術：

氯諾昔康(Lornoxicam)，是一種具有抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱作用的非甾體類抗炎藥，能高度選擇性抑制環(huán)加氧酶抑制劑(COX-II)。臨床上主要用于慢性關節(jié)炎癥、手術和急性創(chuàng)傷后的疼痛、上呼吸道感染引起的發(fā)熱等。目前，氯諾昔康在臨床上有片劑、顆粒劑及干混懸劑等劑型，但由于其溶解度很小，生物利用度低，且波動性較大，局部濃度低，需頻繁給藥，有一定的胃腸道不良反應，且肝臟毒性較大。

脂質(zhì)體作為外用藥物載體具有靶向性、高效、長效、降低藥物不良反應等優(yōu)勢。由于脂質(zhì)體可以使藥物具有較大的角質(zhì)層透過量，而進入血液循環(huán)的藥量較少，從而表現(xiàn)出相對的皮膚組織靶向性。柔性納米脂質(zhì)體(ultra flexible nano-niosomes,UNN)是將膽酸鈉、吐溫、司盤等表面活性劑加入到制備脂質(zhì)體的類脂材料中制成，可高效地穿過比其自身小數(shù)倍的脂質(zhì)載體，柔性脂質(zhì)體具有高效滲透性、親水性和高度柔韌性。氯諾昔康作為有效成分制備柔性納米脂質(zhì)囊泡，不僅能減少氯諾昔康對胃腸道及肝臟的不良反應，也避免了藥物的首過效應，延長了鎮(zhèn)痛時間。

Box-Behnken效應面法設計實驗是適用于多因素考察的新型科學設計方法。其優(yōu)勢在于運用非線性擬合模型從而提高準確度，近年來多被研究者用來進行處方及工藝優(yōu)化。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用Box-Behnken效應面法篩選制備氯諾昔康柔性脂質(zhì)體最佳處方的方法，效應面法具有試驗設計全面、科學準確、可以研究多個因素交互作用等優(yōu)點，針對制備柔性脂質(zhì)體過程中影響較大的磷脂濃度，磷脂與膽固醇質(zhì)量比，總脂質(zhì)與吐溫80質(zhì)量比，總脂質(zhì)與藥物質(zhì)量比四個因素分別進行考察，以包封率和粒徑作為優(yōu)化指標進行Box-Behnken效應面實驗設計，優(yōu)化氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的最佳處方。

本發(fā)明具體方案如下：

一種采用Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的方法，其特征在于：采用薄膜分散水化法制備脂質(zhì)體，分別以磷脂濃度、磷脂與膽固醇質(zhì)量比、總脂質(zhì)與吐溫80質(zhì)量比、總脂質(zhì)與藥物質(zhì)量比為考察對象，以包封率、粒徑為評價指標，采用4因素3水平Box-Behnken效應面設計法篩選氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的最佳處方。

本發(fā)明所述采用Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的方法，其特征在于：采用葡聚糖G50微柱離心法測定包封率，動態(tài)激光散射法測定脂質(zhì)體的粒徑和ζ-電位。

采用本發(fā)明所述方法優(yōu)化而成的制備氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的方法，其特征在于：將氯諾昔康與大豆卵磷脂、膽固醇、吐溫80混合，加入溶劑溶解，然后減壓除去溶劑，得到淡黃色透明均勻薄膜；加入重蒸水水化，50-60℃條件下水化15-25min后，探頭超聲3-5min，然后過0.22μm濾膜，得淡黃色氯諾昔康柔性脂質(zhì)體混懸液。由體外釋放考察中可知，相比于原料藥溶液組，優(yōu)化后制得的氯諾昔康柔性脂質(zhì)體包封率較高，大小分布均勻，具有緩釋特點。

其中，最優(yōu)處方工藝條件為：大豆卵磷脂濃度為16.94mg/mL，大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4.46:1，總脂質(zhì)與吐溫80質(zhì)量比為8.12:1，總脂質(zhì)與藥物質(zhì)量比為18.65:1。以最優(yōu)處方制備的氯諾昔康柔性脂質(zhì)體平均粒徑較小(93.86±7.58)nm、ζ-電位較好(-20.21±2.31mV)、包封率較高(90.23±1.46)％，實際值與預測值偏差較小。82.06％的藥物在24h內(nèi)從脂質(zhì)體中釋放出來，具備明顯的緩釋特性。

本發(fā)明所述制備氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的方法，其特征在于：所述溶劑為無水氯仿；水化條件優(yōu)選為：55℃條件下水化20min。

本發(fā)明通過Box-Behnken效應面法得到優(yōu)化的氯諾昔康柔性脂質(zhì)體制備工藝，按該處方制備3批脂質(zhì)體，同時對其包封率和粒徑進行測定。從測定結(jié)果看，實際值與預測值相差較小，證明該方法預測性能良好，是脂質(zhì)體處方工藝優(yōu)化的有效方法。優(yōu)化后制得的氯諾昔康柔性脂質(zhì)體包封率較高，大小分布均勻，具有緩釋特點，這為后期將其制成親水凝膠提供了較好的實驗基礎。

附圖說明

圖1氯諾昔康柔性脂質(zhì)體洗脫曲線。

圖2因素交互作用對包封率和粒徑的曲面效應圖。

圖3氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的粒徑分布(a)。

圖4氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的ζ-電位(b)。

圖5氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的透射電鏡照片。

圖6氯諾昔康溶液和氯諾昔康柔性脂質(zhì)體體外釋放。

具體實施方式

1儀器與材料

JY9222D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪華儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，DL-180型超聲波清洗機(浙江省象山縣石浦海天電子儀器廠)，TGL-16C臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，UV-9100紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)，JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本Electron株式會社)，F(xiàn)A1104電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)，Spectrum-754PC型紫外掃描儀(上海光譜儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪華儀器廠)，ZetasizerNano ZS-90激光粒徑測定儀(英國Malvern Instru-ments公司)。

氯諾昔康(東京化成工業(yè)株式會社)，大豆卵磷脂(PC＞96％，上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司)，膽固醇(生化純，天津市博迪化工股份有限公司)，葡聚糖G50(如吉生物科技有限公司)，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂64mg、膽固醇16mg、吐溫80 10mg、氯諾昔康4mg于250mL茄型瓶中，加入10mL無水氯仿溶解后在50℃減壓除去無水氯仿，得到淡黃色透明均勻薄膜，加入重蒸水4mL水化，55℃條件下水化20min后，探頭超聲(200W)3min后，過0.22μm濾膜2次，得淡黃色氯諾昔康柔性脂質(zhì)體混懸液，同法制備空白脂質(zhì)體。

2.2含量測定方法學的建立

2.2.1檢測波長的選擇

取制備的空白脂質(zhì)體適量，分別對氯諾昔康和空白脂質(zhì)體進行紫外全波長掃描。氯諾昔康在378nm處有最大吸收，且空白脂質(zhì)體不干擾測定，因此選擇氯諾昔康檢測波長為378nm。

2.2.2標準曲線的制備

精密稱取氯諾昔康對照品5mg于50mL棕色容量瓶中，以甲醇配成質(zhì)量濃度為100μg·mL^-1的儲備液，分別精密量取0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL儲備液于10mL棕色量瓶中，用甲醇定容后得到濃度分別為1、2、5、10、15、20μg·mL^-1的氯諾昔康溶液并于378nm測定其吸光度(A)。以吸光度(A)對藥物質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，得標準曲線方程為:C＝44.455A-3.2031(R²＝0.9999)。結(jié)果表明，氯諾昔康質(zhì)量濃度在1～20μg·mL^-1內(nèi)與吸光度呈良好線性關系。

2.3氯諾昔康柔性脂質(zhì)體包封率的測定

2.3.1柱分離度的考察

a微型柱的制備

取四只2.5mL注射針筒，底部放一層脫脂棉，加入3.0g經(jīng)PBS溶液浸泡飽和過，并用蒸餾水洗至中性的葡聚糖凝膠(Sephadex G50)，將裝好的微柱放入套管中4000r·min^-1離心5min，除去微柱中殘留的水，備用。

b洗脫曲線的考察

精密吸取氯諾昔康柔性脂質(zhì)體0.2mL，緩緩加入柱頂中心處，4000r·min^-1離心5min后在柱頂部加入0.2mL蒸餾水，4000r·min^-1離心5min，收集濾過液，再于柱頂部加入同體積的蒸餾水，重復以上操作。收集1～8管濾液分別置于5mL容量瓶中，甲醇定容，采用紫外-可見分光光度計，以甲醇為對照，于378nm處測定吸光度值，制備洗脫曲線(圖1)。

由圖1可知，洗脫曲線呈單峰。用雙蒸水洗脫一次后即可把脂質(zhì)體全部洗脫下來。最終確定洗脫條件為脂質(zhì)體混懸液上樣離心后再用同體積雙蒸水洗脫一次。

2.3.2空白脂質(zhì)體回收實驗

精密量取0.2mL空白脂質(zhì)體上樣，收集濾過液，用同體積雙蒸水洗脫一次，合并濾過液并置于5mL容量瓶中，雙蒸水定容至刻度，搖勻，于500nm處測定吸光度值定為A_a；精密量取空白脂質(zhì)體0.2mL于5mL容量瓶中，雙蒸水定容至刻度，搖勻，于500nm處測定吸光度值定為A_b，計算回收率(R)，R(％)＝(A_a/A_b)×100％，結(jié)果見表1。

表1脂質(zhì)體回收率實驗(n＝3)

2.3.3脂質(zhì)體包封率的測定

分別精密量取氯諾昔康柔性脂質(zhì)體0.2mL 2份。1份加于G50柱頂，離心后以重蒸水進行洗脫，合并洗脫液并置于10mL容量瓶中，用甲醇定容并超聲破乳后在378nm處測定吸光度為A₁；另1份直接加入10mL的容量瓶中，加甲醇定容并超聲破乳于378nm處測定吸光度為A₂。包封率(EE/％)計算方法如下：

EE/％＝(A₁/A₂)×100％

2.4Box-Behnken效應面法試驗設計

在預試驗基礎上，根據(jù)單因素實驗考察結(jié)果，選擇對氯諾昔康柔性脂質(zhì)體制劑學性質(zhì)影響較為明顯的4個因素:磷脂濃度(X₁)、磷脂與膽固醇質(zhì)量比(X₂)、總脂質(zhì)與吐溫80質(zhì)量比(X₃)、總脂質(zhì)與藥物質(zhì)量比(X₄)，在低中高3個水平上進行優(yōu)化，同時以包封率(Y₁，EE/％)及粒徑(Y₂，d/nm)為評價指標進行實驗考察，影響因素及水平見表2，實驗設計和評價指標結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken效應面法中的變量

2.4.1二次回歸模型的建立

利用Box-Behnken實驗軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得擬合方程為:

EE/％＝-1051.67+104.44X₁+2.27X₂+43.37X₃+7.71X₄+2.00X₁X₂-0.56X₁X₃-0.26X₁X₄+2.89X₂X₃+0.48X₂X₄-0.25X₃X₄-3.04X₁2-7.48X₂²-2.52X₃²-0.13X₄²(R²＝0.8604,P<0.0001) (1)

d_PD＝2004.03-264.79X₁-35.54X₂-15.20X₃+41.55X₄+1.40X₁X₂+1.40X₁X₃-0.54X₁X₄+1.48X₂X₃-0.66X₂X₄-0.39X₃X₄+7.86X₁²+1.41X₂²-0.42X₃²-0.72X₄²(R²＝0.8085,P＝0.0001) (2)

2.4.2方差顯著性檢驗

兩個擬合方程R²值說明該模型擬合程度較好，可以用此模型對處方工藝進行預測分析。從表4回歸系數(shù)顯著性檢驗可知，模型1中，X₁(P＜0.0001)、X₂(P＝0.0005)、X₁²(P<0.0001)、X₂²(P＝0.0038)、X₃²(P＝0.0004)極顯著，X₄(P＝0.0683)、X₂X₃(P＝0.0540)顯著，其他項不顯著。模型2中，X₁(P＜0.0001)、X₁²(P＜0.0001)極顯著，其他項不顯著。

表3 Box-Bchnken效應面法優(yōu)化Lor-FLS處方的組合和相應值

表4回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗

2.4.3效應面優(yōu)化與預測

根據(jù)回歸方程，應用Design Expert 8.0.6試驗設計軟件，繪制影響較大的2個因素對于各指標三維曲面圖(圖2)。根據(jù)Box-Behnken效應面實驗結(jié)果最優(yōu)處方為X₁＝16.94，X₂＝4.46，X₃＝8.12，X₄＝18.65。按此最優(yōu)處方制備3批柔性脂質(zhì)體，其包封率、粒徑見表5。從表5可知，實測值和模型預測值偏差都較小，說明該模型預測性良好。對于優(yōu)化處方制備的制劑進行了ζ電位的測定，從圖4可看出，氯諾昔康柔性脂質(zhì)體的ζ電位為-20.23mV。通常ζ電位在±20mV以上時，由于靜電排斥會阻止微粒間相互碰撞，使制劑不易沉降，從而有利于制劑的穩(wěn)定。

表5 Lor-FLS的實際值和預測值

2.5氯諾昔康柔性質(zhì)體的透射電鏡檢查

取適量氯諾昔康柔性脂質(zhì)體混懸液滴在噴碳銅網(wǎng)上，以2.0％磷鎢酸染色，采用JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察載藥脂質(zhì)體的形態(tài)。從圖5可知，氯諾昔康柔性脂質(zhì)體大小較均一，表面光滑，近似成球形。

2.6體外釋放度實驗

采用透析法對氯諾昔康柔性脂質(zhì)體進行體外釋放考察。根據(jù)最優(yōu)處方制備適量脂質(zhì)體于40C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ捎诼戎Z昔康的溶解度在pH 8.0較大，能夠符合漏槽條件，因此選擇PBS(pH 8.0)緩沖液為溶出介質(zhì)。具體方法如下：取氯諾昔康柔性脂質(zhì)體混懸液5mL于截留分子量為2000的透析袋中，同時以等量的氯諾昔康PBS(pH 8.0)緩沖液溶液為對照，分別置于含有200mL的PBS(pH 8.0)緩沖液的錐形瓶中，于37℃水浴震蕩，分別于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24h吸取1mL釋放介質(zhì)，同時補加1mL PBS緩沖液并按照“2.2.2”方法測定釋放介質(zhì)中藥物濃度，計算藥物累計釋放百分率。由圖6可知，溶液組在4h內(nèi)就可完全釋放，而脂質(zhì)體組在24h內(nèi)有82.06％藥物從脂質(zhì)體中釋放出來，存在明顯的緩釋作用。

上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。