本發(fā)明屬于醫(yī)藥，涉及一種人工蟾酥組合物及其用途。本發(fā)明具體涉及人工蟾酥或蟾酥代用品的關(guān)鍵原料及其制備方法、蟾酥代用品配方，和蟾酥代用品及其關(guān)鍵原料用于醫(yī)藥工業(yè)原料和醫(yī)藥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的用途。

背景技術(shù)：

1、蟾酥，我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(bufo?bufo?gargarizanscantor)或黑框蟾蜍(bufo?melanostictus?schneider)等的耳后腺及皮膚腺分泌物經(jīng)加工干燥而成，具有清熱解毒、消腫止痛和開(kāi)竅醒神的功效，是多種中藥大品種關(guān)鍵原料。但是當(dāng)前天然蟾酥資源供應(yīng)逐年減少。

2、為了緩解資源緊張，已有人工養(yǎng)殖中華大蟾蜍，但是種種問(wèn)題使得養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)仍未突破?？傮w而言養(yǎng)殖成本高、效率低、周期長(zhǎng)。目前對(duì)于人工蟾酥代用品的研發(fā)十分必要。

3、本發(fā)明人長(zhǎng)期從事蟾酥研究，在國(guó)家自然科學(xué)基金“牛黃與蟾酥配伍減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)理研究”，編號(hào)：3901894，2010年”、“蟾蜍皮膚接觸污染物對(duì)蟾酥品質(zhì)的影響及分子機(jī)制，81102762，2012年”、“基于多肽與腫瘤細(xì)胞生物親和的蟾酥大分子活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，81673563，2017年”、“基于多肽組和生物親和性的蟾酥毒肽抗腫瘤構(gòu)-效-毒關(guān)系及分子機(jī)制研究，82073975，2021年”、“蟾酥抑制皮膚炎癥性成纖維細(xì)胞活性改善特應(yīng)性皮炎的分子機(jī)制研究，82204715，2022年”、“蟾酥上調(diào)pcbp1抑制海馬神經(jīng)元鐵死亡抗抑郁機(jī)制，82304743，2023年”的資助下，深入挖掘蟾酥活性物質(zhì)基礎(chǔ)和安全性。

4、在這些工作的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)計(jì)了“化學(xué)特征類(lèi)似、功效近同、安全性更高”的蟾酥代用品，提供了一種人工蟾酥組合物及其用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種易于工業(yè)化生產(chǎn)制備、質(zhì)量穩(wěn)定且價(jià)格便宜的蟾酥等效代用品，公開(kāi)其主要原料組成物質(zhì)和組方以及在制備藥物中的用途。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的方案是：

3、在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種人工蟾酥組合物，所述組合物的核心組分包含以下一種或多種：蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)、蟾蜍色胺類(lèi)或蟾蜍多肽類(lèi)。

4、優(yōu)選地，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)、所述蟾蜍色胺類(lèi)和所述蟾蜍多肽類(lèi)是天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物類(lèi)似物、天然產(chǎn)物修飾物，或者所述蟾蜍色胺類(lèi)和所述蟾蜍多肽類(lèi)是通過(guò)化學(xué)合成或合成生物學(xué)技術(shù)制備的。

5、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中，所述組合物的核心組分由蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)、蟾蜍色胺類(lèi)和蟾蜍多肽類(lèi)組成，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)、所述蟾蜍色胺類(lèi)和所述蟾蜍多肽類(lèi)的質(zhì)量分別占所述人工蟾酥組合物總質(zhì)量的0.01-70％、0.01-80％、0.01-80％。

6、優(yōu)選地，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)、所述蟾蜍色胺類(lèi)和所述蟾蜍多肽類(lèi)的質(zhì)量分別占所述人工蟾酥組合物總質(zhì)量的10-30％、10-50％、10-50％。

7、更優(yōu)選地，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)、所述蟾蜍色胺類(lèi)和所述蟾蜍多肽類(lèi)的質(zhì)量分別占所述人工蟾酥組合物總質(zhì)量的10-20％、20-40％、20-40％。

8、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中，所述組合物還包含輔助性組分，所述輔助性組分包含以下一種或多種：蛋白、氨基酸、膽固醇、核酸或有機(jī)酸。具有填充、粘合、潤(rùn)滑、分散、緩釋、包衣、包膜、崩解、促滲、乳化、增溶等功能的藥學(xué)可接受的常規(guī)輔料。

9、優(yōu)選地，所述輔助性組分由膽固醇類(lèi)、蛋白類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核苷類(lèi)組成，質(zhì)量分別占所述人工蟾酥組合物總質(zhì)量的0.01-20％、0.01-30％、0.01-20％、0.01-20％、0.01-20％。

10、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)是甲型強(qiáng)心苷及其苷元、乙型強(qiáng)心苷及其苷元、強(qiáng)心甾類(lèi)似物或其化學(xué)修飾物，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)是動(dòng)物來(lái)源的或植物來(lái)源的，所述動(dòng)物來(lái)源包括蟾蜍科、蛙科兩棲動(dòng)物，所述植物來(lái)源包括：含有嚏根草苷類(lèi)、海蔥苷類(lèi)的原植物、鈴蘭(convallaria?majalis)、黃蟬(allamanda?schottii)、馬利筋(asclepias?curassavica)、金盞花(adonis?amurensis)，各種萬(wàn)年青植物，以及毛茛科鐵筷子屬植物、百合科海蔥屬天然植物、百合科蒼角殿屬球莖類(lèi)多肉植物、風(fēng)信子科海蔥屬、景天科、玄參科(洋地黃屬)、夾竹桃科(黃花夾竹桃屬、羊角拗屬)、蘿藦科(杠柳屬、馬利筋屬)、百合科(鈴蘭屬、萬(wàn)年青屬)、十字花科(糖介屬)、毛茛科(側(cè)金盞花屬)、南非植物drimia?robusta、urginea?steinh。

11、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)是蟾蜍甾烯，所述蟾蜍甾烯包括游離型蟾蜍甾烯類(lèi)成分或結(jié)合型蟾蜍甾烯類(lèi)成分。

12、優(yōu)選地，所述蟾蜍甾烯包括游離型蟾蜍甾烯類(lèi)成分選自以下一種或多種：酯蟾毒配基(resibufogenin)、蟾毒靈(bufalin)、蟾毒精(resibufagin)、(resibufaginol)、去乙酰華蟾毒精(desacetylcinobufagin)、和蟾蜍它靈(gamabufotalin)、去乙酰蟾毒它靈(desacetylbufotalin)、1β-羥基-蟾毒靈(1β-hydroxylbufalin)、遠(yuǎn)華蟾毒精(telocinobufagin)、蟾蜍他里寧(bufotalinin)、沙蟾毒精(arenobufagin)、嚏根草配基(hellebrigenin)、去水華蟾毒精(dehydrated?cinobufagin)、華蟾毒精(cinobufagin)、蟾毒它靈(bufotalin)、19-氧代華蟾毒精(19-oxo-cinobufagin)、3β，14β，16β-三羥基-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、3β，14β-二羥基-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、華蟾蜍精醇(cinobufaginol)、華蟾素(cinobufotalin)、19-oxo-cinobufagin、19-氧代華蟾素(19-oxo-cinobufotalin)、desacetylcinobufagin、14β-羥基-3β-[(β-d-葡萄吡喃糖基)氧]-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、3β，14β，16β-三羥基-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯或3β，14β-二羥基-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯。

13、另外，優(yōu)選地，所述結(jié)合型蟾蜍甾烯類(lèi)成分選自以下一種或多種：3-精氨琥珀酸酯酯蟾毒配基(resibufogenin-3-succinate-arginine?ester)、3-精氨琥珀酸酯蟾毒靈(bufalin-3-succinate-arginine?ester)、3-精氨戊二酸酯酯蟾毒配基(resibufogenin-3-glutarate-arginine?ester)、(resibufaginol-3-succinate-arginine?ester)、3-精氨己二酸酯酯蟾毒配基立體異構(gòu)體(resibufogenin-3-adipate-arginine?esterstereoisomer)、3-精氨己二酸酯蟾毒靈基立體異構(gòu)體(bufalin-3-adipate-arginineester?stereoisomer)、3-精氨庚二酸酯酯蟾毒配基(resibufogenin-3-pimelate-arginine?ester)、3-精氨庚二酸酯蟾毒靈(bufalin-3-pimelate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯酯蟾毒配基(resibufogenin-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯華蟾毒精(cinobufagin-3-succinate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯去乙酰華蟾毒精(desacetylcinobufagin-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯華蟾蜍精醇(cinobufaginol-3-succinate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯遠(yuǎn)華蟾毒精(telocinobufagin-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯日蟾毒它靈(gamabufotalin-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨己二酸酯華蟾毒精(cinobufagin-3-adipate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯嚏根草配基(hellebrigenin-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯沙蟾毒精(arenobufagin-3-suberate-arginineester)、3-精氨庚二酸酯華蟾毒精(cinobufagin-3-pimelate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯華蟾毒精(cinobufagin-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨庚二酸酯華蟾蜍精醇(cinobufaginol-3-pimelate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯華蟾蜍精醇(cinobufaginol-3-suberate-arginine?ester)、3-精氨辛二酸酯-19-氧代華蟾素(19-oxo-cinobufotalin-3-suberate-arginine?ester)、脫葡萄糖嚏根草苷(deglucohellebrin)、、5β，14β，16β-三羥基-19-醛基-3β-[(a-l-鼠李吡喃糖基)氧]蟾蜍甾-20，22-二烯、14β，16β-二羥基-3β-[β-d-葡萄吡喃糖基-(1→4)-(β-d-葡萄吡喃糖基)-氧]-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、14β，16β-二羥基-3β-[(β-d-葡萄吡喃糖基)氧]-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、hellebosapogenin、hellebrin、14β-羥基-3β-[β-d-葡萄吡喃糖基-(1→6)-(β-d-葡萄吡喃糖基)-氧]-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯。

14、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)是植物來(lái)源的蟾蜍甾烯。

15、優(yōu)選地，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)來(lái)源于毛茛科鐵筷子屬植物鐵筷子(helleborusthibetanus)或其鐵筷子變種，包括：黑嚏根草或黑鐵筷子(helleborus?niger)、高加索鐵筷子(helleborus?caucasicus)、東方鐵筷子或亞伯加西亞鐵筷子(helleborusorientalis)、綠花嚏根草或綠花鐵筷子(helleborus?viridis)、杏味鐵筷子或博氏圣誕玫瑰(helleborus?bocconei)、紫鐵筷子(helleborus?purpurascens)、香味鐵筷子h.odbrus、h.abchasicus、h.macranthus、土耳其鐵筷子(h.torquatus)、尖裂鐵筷子(h.multifidus)、圓葉圣誕玫瑰h.cyclophyllus、h.odorus、克羅地亞圣誕玫瑰h.croaticus、h.istriacus、h.dumetorum、異味鐵筷子(helleborus?foetidus)、齒葉鐵筷子(helleborusargutifolius)、暗紅鐵筷子(helleborus?atrorubens)、科西嘉鐵筷子(helleboruscorsicus)、鉛色圣誕玫瑰(helleborus?lividus)，

16、優(yōu)選地，所述植物來(lái)源蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)可以通過(guò)溶劑提取、色譜富集、微生物或酶轉(zhuǎn)化處理工藝獲得。

17、具體地，所述制備方法包括以下步驟：將含有蟾蜍甾烯強(qiáng)心苷的原植物藥材根及根莖，打成粗粉，加入10倍量乙醇或水或其他溶劑浸泡，常規(guī)提取方法提取，合并提取液、過(guò)濾、濃縮干燥，經(jīng)大孔樹(shù)脂分離，獲取40％-100％乙醇洗脫部位。

18、更優(yōu)選地，所述蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)是采用微生物發(fā)酵或酶轉(zhuǎn)化方式，進(jìn)行強(qiáng)心苷的脫糖基處理制備得到的。工業(yè)上這些微生物或酶能夠通過(guò)已知的基因序列突變、刪除或編輯的技術(shù)實(shí)現(xiàn)改造，而獲得更強(qiáng)與底物結(jié)合、抗變性和苷元轉(zhuǎn)化能力。

19、具體地，所述制備方法包括以下步驟：

20、含有蟾蜍甾烯強(qiáng)心苷總提物上樣到大孔吸附樹(shù)脂柱，依次采用純水，10％，20％，40％，60％，80％，100％體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液梯度洗脫，收集不同部位洗脫成分減壓回收。按下述顯色方法進(jìn)行檢測(cè)，排除生物堿、黃酮部位，合并40％-100％乙醇洗脫部位，獲得總苷，香草醛-高氯酸法測(cè)定甾體強(qiáng)心苷含量。加入生物催化酶酶進(jìn)行苷元轉(zhuǎn)化，酶/總強(qiáng)心苷質(zhì)量比為(0.05∶1到5∶1)，緩沖液ph為4.5，酶水解溫度為35℃時(shí)，酶解時(shí)間6小時(shí)。酶解液經(jīng)噴霧干燥獲得干粉，加入0.5-3倍有機(jī)溶劑(乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等)回流提取獲得植物來(lái)源蟾蜍二烯內(nèi)酯部位。生物催化酶包括：β-葡萄糖苷酶、糖苷酶c、蝸牛酶、果膠酶、纖維素酶、甘露糖酶、纖維二糖酶、蛋白酶、半乳糖酶等。

21、固定化酶解-萃取法：目標(biāo)植物經(jīng)有機(jī)溶劑或水提，提取液濃縮干燥，制得總提取物。采用離子吸附法對(duì)生物酶進(jìn)行固定化處理，酶與含有陰陽(yáng)離子交換基團(tuán)的混合樹(shù)脂以靜電作用力結(jié)合的固定化方法。該方法處理?xiàng)l件溫和，沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)偶聯(lián)劑處理修飾，保持較高的酶催化活力。酶/總強(qiáng)心苷質(zhì)量比為(0.01∶1到5∶1)，緩沖液ph為4.5，酶水解溫度為常溫或37℃時(shí)，搖床振搖，酶解過(guò)夜。該方法優(yōu)點(diǎn)是固定化酶在反應(yīng)結(jié)束后，隨離子交換樹(shù)脂自然沉降，過(guò)濾后洗滌可以重復(fù)使用，減少酶用量。酶解液經(jīng)噴霧干燥獲得干粉，加入0.5-3倍有機(jī)溶劑超聲提取獲得植物來(lái)源蟾蜍二烯內(nèi)酯部位。

22、微生物發(fā)酵酶解-萃取法：微生物發(fā)酵法處理含有天然蟾蜍甾烯內(nèi)酯的強(qiáng)心苷植物或植物提取物。微生物包括哈茨木霉、木霉、塔賓曲霉、米曲霉、黑曲霉、紅曲酶、泡盛曲霉、鐮孢屬真菌、彎孢霉屬真菌發(fā)酵，也包括益生菌發(fā)酵，乳稈菌、腸球菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌屬、酵母菌等發(fā)酵，通過(guò)產(chǎn)生的、碳水化合物活性酶等，實(shí)現(xiàn)蟾蜍強(qiáng)心苷向苷元轉(zhuǎn)化。

23、在優(yōu)選實(shí)施方式中，采用黑曲霉、米曲霉、乳桿菌的混合菌種進(jìn)行發(fā)酵，采用固態(tài)發(fā)酵法。例如，將含有蟾蜍甾烯強(qiáng)心苷的原植物粉碎，加2倍量水潤(rùn)濕，加入發(fā)酵菌液，28度條件下發(fā)酵20天，干燥，乙酸乙酯萃取獲得苷元，經(jīng)大孔樹(shù)脂富集純化得到蟾蜍總甾烯部位

24、更優(yōu)選地，所述植物來(lái)源的蟾蜍甾烯選自以下一種或多種：3β，14β-二羥基-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、deglucohellebrin、3β，14β，16β-三羥基-5α-蟾蜍甾-20，22-二烯、蟾蜍它里定或嚏根草苷元(hellebrigenin)、去乙酰華蟾毒精desacetylcinobufagin、19酮基-華蟾毒精(19-oxo-cinobufagin)、3β，5β，14β，16β-四羥基-19醛基-蟾蜍甾-20，22-二烯(16-oh-hellebrigenin)、3β，14β，16β-三羥基-5β蟾蜍甾-20，22-二烯(16-oh-bufalin)。

25、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中，所述蟾蜍色胺類(lèi)選自以下一種或多種：

26、在上述人工蟾酥組合物中，所述蟾蜍色胺類(lèi)選自以下一種或多種：5-甲氧基-n，n-二甲基色胺(5-meo-dmt)、5-meo-nmt、5-甲氧基色胺(5-methoxytryptamine)、bufobutanoic?acid、bufobutarginine、布磷素a(bufoserotonin?a)、布磷血清素b(bufoserotonin?b)、布磷色胺c(bufoserotonin?c)、蟾蜍特尼定(bufotenidine)、n，n-二甲基五羥色胺(bufotenine)、氧化蟾毒色胺(bufotenine?oxide)、蟾毒色胺-o-硫酸鹽(bufotenine-o-sulphate)、bufoviridine、n-甲基-5-羥基色胺(n-methylserotonin)、5-羥基色胺(serotonin)、色胺(tryptamine)、脫氫蟾蜍色胺dehydrobufotenine、吲哚-3-乙醛(indole-3-acetaldehyde)、5-羥基吲哚-3-甲醛(5-hydroxyindole-3-aldehyde)、5-羥基苯酚(5-hydroxy?tryptophol)、bufobutarginne或bufopyramide。

27、作為可選的方式，在上述人工蟾酥組合物中所述的蟾蜍多肽類(lèi)選自以下一種或多種：

28、優(yōu)選地，所述蟾蜍多肽類(lèi)選自以下一種或多種：phe-asp-phe-pro-gly-asn-lys-ile-thr、phe-pro-ala-ser-ala-ala-gly-lys-g1y-leu-gln、ser-glu-trp-glu-glu-ash-pro-met(+15.99)-asn-lys-tyr-val-ser、asn-phe-thr-gly-asp-ser-ile-pro-cys(+57.02)-arg、ser(+42.01)-asp-glu-ile-ile-his-asn-pro-ala-val-pro-phe、thr-lys-pro-thr-asp-asp-glu-leu-lys-glu-leu、tyr-glu-arg-pro-leu-val-thr、leu-thr-val-gly-pro-arg-gly-pro-leu-leu-val-gln-asp、val-asp-leu-asn-pro-ser-asn-val-gly-trp-asn-lys-thr-thr-phe-ala、lys-thr-lys-pro-thr-asp-asp-glu-leu-lys-glu-leu-tyr、gln-a1a-glu-phe-asp-lys-ala-a1a-glu-asp-val-lys-lys-leu-lys-thr、met-leu-ala-asn-glu-asp-tyr-ala-ser-leu-thr-lys-gly-i1e-gln-asn-leu-asn、ala-thr-pro-val-asp-trp-lys-pro-gly-asp-arg-val-met-val、phe-phe-asp-phe-pro-gly-asn-lys-ile-thr-ser-val-ala-gly-val-tyr-phe、ser-asp-ile-ser-ala-gly-lys-ile-lys-gln、gln-gly-leu-ala-ala-gly-met(+15.99)-pro-gly-tyr-pro-val-leu(-.98)、phe-asp-lys-ala-ala-glu-asp-val-lys-lys-leu-lys-thr-lys-pro-thr-asp-asp-glu-leu-lys、trp-gly-trp-pro-ile-asp-asp-ala-thr-thr-glu-lys-leu-ser、pro-arg-gly-pro-leu-leu-val-gln-asp。

29、在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了上述第一個(gè)方面所述的人工蟾酥組合物在制備醫(yī)藥工業(yè)原料中的用途，所述醫(yī)藥工業(yè)原料用于天然蟾酥的等效替代。

30、在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了上述第一方面所述的人工蟾酥組合物在制備治療咽喉類(lèi)、心臟類(lèi)、皮膚類(lèi)、腫瘤類(lèi)和神經(jīng)類(lèi)疾病的藥物中的用途。

31、優(yōu)選地，在所述藥物中還可以包含其他活性成分，以便與本發(fā)明人工蟾酥組合物形成治療心臟、腫瘤和咽喉等疾病的復(fù)方藥物。

32、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下有益效果：

33、本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種人工蟾酥的關(guān)鍵原料、配方、制備方法，特別是本發(fā)明開(kāi)發(fā)了可用于工業(yè)生產(chǎn)的從植物中有效獲取蟾蜍強(qiáng)心甾類(lèi)成分的方法。藥效學(xué)評(píng)價(jià)證實(shí)，采用本發(fā)明方法制備得到的人工蟾酥組合物具有與天然蟾酥等效或近效的作用，具有用于制備天然蟾酥代用品的價(jià)值。本發(fā)明為含蟾酥中成藥提供可持續(xù)性資源保障，為中國(guó)野生蟾蜍資源及生態(tài)保護(hù)提供支持。本發(fā)明也包括以所述人工蟾酥組合物或其原料為組分的新藥物設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。