本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料，具體涉及一種負載自組裝bmp2殼核微球緩釋系統(tǒng)的3d打印多孔鈦合金支架及其制備方法。

背景技術：

1、隨著人口老齡化、運動或意外事故的發(fā)生，骨關節(jié)炎成為世界頭號致殘性疾病之一。目前，治療骨關節(jié)炎最有效的外科手段是人工關節(jié)置換術，能消除關節(jié)疼痛、改善和恢復關節(jié)功能、提高骨關節(jié)炎患者生活質量。人工關節(jié)假體常用的固定方式主要包括骨水泥固定和生物固定。傳統(tǒng)的骨水泥固定方式，是通過注射骨水泥在假體與骨腔之間產生機械絞索和容積填塞達到術后的即刻固定，然而骨水泥植入人體后會發(fā)生骨水泥滲漏引發(fā)假體周圍骨溶解和骨吸收，最終導致假體的松動失效，此外容易引起骨水泥反應綜合征，并伴有一定的猝死率；而新型的生物固定，是通過構建微小的孔隙結構，使骨組織逐漸長入假體內部，是一種更為可靠的固定方式。但是，生物固定若僅通過骨組織自主長入假體內部，存在著固定過程緩慢，早期結合不牢固，有較大的脫落風險。因此，研究并設計出一種可縮短骨長入時間、增強固定界面結合強度、具有促骨生長功能的生物固定方式是必要的。

2、骨植入物的孔隙率應在50％以上，孔徑大小在100-1000μm，ti6al4v(ti4材料)具有優(yōu)異的強度、硬度、耐腐蝕性以及較長的使用壽命、更輕的重量，能夠承受人體關節(jié)的復雜運動和負荷，使用更為舒適，通過3d打印激光熔融技術(slm)具有高度可控的成型性能，在關節(jié)假體中廣泛使用。但相比于陶瓷材料和高分子材料，金屬材料的生物活性較差，需要通過引入促骨生長的活性物質，促進細胞識別、粘附，加快骨長入過程。

3、骨組織修復重建的不同階段由不同的生長因子調控，其中最主要的促成骨因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone?morphogenetic?proteins-2,bmp2)，bmp2廣泛參與到骨組織的基本生理功能維持以及骨組織修復的各個階段，可使骨髓間充質干細胞轉化成骨細胞。bmp2的濃度及活性直接影響到骨細胞的分裂分化速度。然而，作為一種蛋白質，bmp2其活性極易受到外界環(huán)境的影響，在過高溫度以及極端酸堿狀態(tài)下都會失活，游離態(tài)的bmp2并不能有效的促進骨修復，反而會引起異位骨化、骨囊腫以及骨腫瘤的形成，而過量的bmp2則會引發(fā)免疫系統(tǒng)的防御機制，引起炎癥問題。因此，bmp2需要采用具有穩(wěn)定緩釋作用的包埋體系進行固定，同時與3d打印多孔支架有機結合，以達到縮短骨長入時間、增強固定界面結合強度、促骨生長的目的。因此，為了解決上述問題，本技術提出一種負載自組裝bmp2殼核微球緩釋系統(tǒng)的3d打印多孔鈦合金支架及其制備方法。

技術實現(xiàn)思路

1、解決的技術問題：針對上述技術問題，本發(fā)明提供一種負載自組裝bmp2殼核微球緩釋系統(tǒng)的3d打印多孔鈦合金支架及其制備方法，具體包括兩個部分：(1)基于乳化溶劑揮發(fā)法，得到粒徑均一、單分散性好的的聚乳酸微球，對其進行肝素化修飾后接枝bmp2，得到bmp2-pla微球；基于靜電噴霧技術，將上述微球物理包封，得到具有緩釋功能的bmp2-pla-alg殼核微球；(2)基于solidworks軟件和金屬3d打印機設計并制備x型多孔鈦合金支架，并進行pda涂層修飾，得到力學性能及孔隙率與人骨組織相匹配的pda-x-ti4支架；bmp2-pla-alg殼核微球和多孔pda-x-ti4支架在人工關節(jié)固定界面促骨生長領域中具有潛在的應用價值。

2、技術方案：第一方面，本發(fā)明提供一種負載自組裝bmp2殼核微球緩釋系統(tǒng)的3d打印多孔鈦合金支架，包括3d打印多孔鈦合金支架和bmp2殼核微球，所述bmp2殼核微球平鋪在3d打印多孔鈦合金支架上，所述3d打印多孔鈦合金支架為x型結構，所述x型結構有圓形球頭堆積而成，且成陣列排布。

3、優(yōu)選的，所述bmp2殼核微球為bmp2-pla-alg殼核微球，包括核微球聚乳酸和殼微球海藻酸鈣。

4、優(yōu)選的，所述3d打印多孔鈦合金支架為多孔pda-x-ti4支架，其表面采用聚多巴胺涂層進行了修飾。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的負載自組裝bmp2殼核微球緩釋系統(tǒng)的3d打印多孔鈦合金支架的制備方法，包括以下步驟：

6、s1、多孔pda-x-ti4支架的制備；

7、s2、bmp2-pla-alg殼核微球的制備；

8、s3、將步驟s2制得的bmp2-pla-alg殼核微球平鋪在多孔pda-x-ti4支架上，滴入pbs緩沖液，使殼核微球下滲到多孔pda-x-ti4支架內部，并吸液膨脹，最終得到負載自組裝bmp2殼核微球緩釋系統(tǒng)的3d打印多孔鈦合金支架。

9、優(yōu)選的，步驟s1包括以下具體步驟：

10、s1-1、采用solidworks軟件創(chuàng)建x型胞元結構的三維模型，通過選擇性激光熔化技術，得到x-ti4支架；

11、s1-2、采用熱處理工藝對步驟s1-1得到的x-ti4支架進行去應力退火，退火溫度為750℃～980℃，之后隨爐冷卻至室溫；

12、s1-3、采用體積百分比為3％的氫氟酸和體積百分比為25％的硝酸依次對去應力后的x-ti4支架進行酸蝕，酸蝕時間為5～10分鐘，酸蝕直至去除支架表面未完全熔融的鈦合金粉末；

13、s1-4、依次采用分析純的丙酮、乙醇和去離子水依次對酸蝕后的x-ti4支架進行超聲波清洗，清洗時間為10分鐘，反復清洗直至超聲液體不再變渾濁，之后烘干儲存；

14、s1-5、將多巴胺溶于tris緩沖液中，配制成質量濃度為1.0～2mg/ml的多巴胺溶液，將清洗后的x-ti4支架置于多巴胺溶液中恒溫震蕩10～12小時聚合，得到多孔pda-x-ti4支架，并37-40℃烘干保存，備用。

15、優(yōu)選的，步驟s2包括以下具體步驟：

16、s2-1、將聚乳酸pla與二氯甲烷溶液按質量比1：19-99混勻作為連續(xù)相；將聚乙烯醇與純水按質量比1：19-99加熱溶解，得到的水溶液作為分散相；連續(xù)相充分乳化后，采用機械攪拌裝置低速攪拌，低速攪拌的速度為600-800rpm，室溫下將1體積份連續(xù)相逐滴緩慢滴加到10體積份的分散相中，開啟高速攪拌乳化，高速攪拌的速度為6000～9000rmp；

17、s2-2、待二氯甲烷揮發(fā)完全后，通過離心分離技術收集、洗滌，采用900目細胞篩篩分，得到pla微球；

18、s2-3、將乙二胺加入到0.6mg/ml的pda/tris溶液中，配制成0.3mg/ml的pda/eda/tris溶液，加入步驟s2-2得到的pla微球，pla微球和pda/eda/tris溶液的質量比為1:1～20，常溫低速攪拌2～3h，低速攪拌的速度為200～300rmp，得到pda/eda-pla微球；

19、s2-4、將肝素鈉、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)和n-羥基琥珀酰亞胺按照質量比12:4:1的比例溶于mes緩沖液，配制成質量濃度為1％肝素鈉溶液，加入步驟s2-3得到的pda/eda-pla微球，其中pda/eda-pla微球與肝素鈉溶液的質量比為1:1～20，常溫攪拌24～36h，得到hep-pda/eda-pla微球；

20、s2-5、將bmp2和純水按照1:1～20的質量比配制成溶液，加入步驟s2-4得到的hep-pda/eda-pla微球，其中hep-pda/eda-pla微球與bmp2溶液的質量比為1:1～20，常溫低速攪拌2～3h，得到bmp2-pla微球，冷凍干燥保存；

21、s2-6、將海藻酸鈉和純水按質量比1：45-99混合均勻，得到海藻酸鈉水溶液，加入步驟s2-5得到的bmp2-pla微球，配制成質量百分比0.5％～1.5％的靜電噴霧溶液；將氯化鈣和純水按質量比1:9～99配制成收集溶液，備用；

22、s2-7、將靜電噴霧溶液裝入注射器中，所述注射器上設有直角針頭，置于推注泵上；將收集溶液裝入一次性培養(yǎng)皿中，并將一次性培養(yǎng)皿置于針頭下方，調整針尖與收集溶液距離；

23、s2-8、加裝電壓控制裝置，并將負極接地，啟動推注泵并調整推注速度，啟動電壓控制裝置并調整電壓；推注完畢10min后離心收集微球，純水洗滌并冷凍干燥，得到粒徑縮小的bmp2-pla-alg殼核微球。

24、進一步的，步驟s2-7中針尖與收集溶液的距離應為10～15cm，針頭直徑為20g、25g或30g。

25、進一步的，步驟s2-8中推注泵推注速度為1～2mm/min，正極電壓為5～15kv。

26、有益效果：1)bmp2-pla-alg殼核微球由核微球聚乳酸和殼微球海藻酸鈣組成，采用更安全的物理封裝和共價結合策略減緩bmp2的釋放和降解，利用肝素與bmp2之間共價結合的方式固定在聚乳酸微球表面，之后物理封裝在海藻酸鈣基質中，從而避免bmp2游離在骨生長環(huán)境中引起異位骨化、骨囊腫以及骨腫瘤等附作用；避免過量的bmp2引發(fā)免疫系統(tǒng)的防御機制，引起炎癥問題；避免可能會損害bmp2活性的化學修飾；

27、2)所使用的材料均為生物安全材料，具有促骨生長和可降解的特性：海藻酸是來源于褐藻的天然多糖聚合物，無毒無害、可生物降解，被廣泛應用于食品加工以及生物材料；聚乳酸可在人體內降解，中間代謝產物是乳酸，最終代謝產物是水和co2，其代謝產物不會在重要器官聚集；

28、3)基體x型結構ti6al4v多孔支架(x-ti4)利用solidworks和選擇激光熔融技術設計并制備，精度較高，酸蝕后基本保持表面形貌，壓縮試驗表明其抗壓強度和彈性模量均滿足植入人體要求，同時，保留了較高的孔隙率以供成骨細胞長入；支架表面聚多巴胺pda涂層具有良好的粘附性、親水性和生物相容性，在黏附固定殼核微球的同時，為ti4支架提供細胞黏著識別位點，改善其生物性能；

29、4)利用海藻酸鈣微球冷凍干燥后形貌不變、粒徑縮小的特性，將凍干微球滲入多孔支架內部；利用海藻酸鈣微球吸液后膨脹的特性，注入pbs緩沖液使微球原位膨脹嵌合在多孔支架內部；利用聚多巴胺涂層的粘附特性，將微球粘附在多孔支架上，并對鈦合金材料進行生物活性修飾；在不改變多孔支架孔隙結構的情況下，對無生物活性的鈦合金表面進行修飾，同時，利用機械嵌合和化學結合的方法引入活性物質bmp2，保留殼核結構的緩釋效果。