本發(fā)明屬于肝癌診斷領域，具體地，本發(fā)明涉及可溶性免疫檢查點及其在預測肝癌預后中的應用。

背景技術：

1、根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝癌是全球第六大常見癌癥，其發(fā)病率排名第五位，死亡率位居第三位[1]。肝細胞癌(hepatocellular?carcinoma，hcc)是最常見的原發(fā)性肝癌類型，占所有原發(fā)性肝癌病例的90％[2]；在我國乙肝病毒(hepatitis?b?virus，hbv)感染是肝癌發(fā)生的最重要的病因之一[3]，乙型肝炎病毒相關肝細胞癌(hbv-hcc)占中國hcc患者的80％以上。

2、肝癌具有高復發(fā)率、高死亡率的特點，大多數(shù)的肝癌患者在診斷時已處于晚期，這使得治療方式受限。目前，免疫檢查點抑制劑療法的革命性進展延長了hcc患者的生存期，如抗pd-1/pd-l1抗體(anti-programmed?death-1antibody/anti-programmed?death1ligand?1antibody)和抗ctla4抗體(anti-cytotoxic?t?lymphocyte-associatedantigen-4antibody)。但是，盡管研究者們進行了大量研究來提高hcc免疫治療的臨床療效，患者對免疫檢查點阻斷療法(immune?checkpoint?blockade，icb)的反應仍然有限，同時存在耐藥性、不良反應等事件發(fā)生[4]。因此，迫切需要深入了解hbv-hcc的免疫作用機制并探索新的生物標志物及潛在的治療靶點。

3、近年來，可溶性形式的免疫檢查點(soluble?immune?checkpoints，sics)逐漸受到關注，有研究表明可溶性免疫檢查點與腫瘤局部cd8+t細胞耗竭以及hbv-hcc患者的預后密切相關[5-8]，另外，它們能夠與免疫檢查點抑制劑結合進而影響其功效[9]?？扇苄悦庖邫z查點主要通過mrna翻譯或膜結合蛋白脫落產生，并與細胞膜上的受體或配體結合，這增加了免疫信號通路組成的多樣性和免疫調節(jié)功能的復雜性[10]。不少臨床研究評估了可溶性免疫檢查點在腫瘤患者中的預后價值，并探討了可溶性免疫檢查點水平與臨床病理因素之間的關系[11,12]。然而，很少有對hbv-hcc患者的sics進行研究。因此，探索可溶性免疫檢查點在hbv-hcc患者中的臨床意義非常有必要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是如何基于免疫檢查點、尤其是可溶性免疫檢查點并結合臨床指標來預測肝癌患者的預后。

2、本發(fā)明的發(fā)明人基于大量hbv-hcc患者的臨床及免疫特征，通過采用單因素和多因素cox等比例風險分析篩選出與hbv-hcc患者3年總生存期(os)相關的風險因素，通過多因素cox回歸分析篩選出hbv-hcc患者3年os的獨立相關因素，進一步地由此構建出一個風險評分模型。驗證實驗證明，該風險評分模型能夠用于hbv-hcc患者預后的風險分層分析；并且，由于該模型覆蓋了多個可溶性免疫檢查點，可知，當臨床醫(yī)生在給肝癌患者選擇更有利的、與免疫檢查點抑制劑療法相關的治療方案時，該模型能夠提供有用的輔助信息。

3、基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供以下技術方案。

4、一方面，本發(fā)明提供一種用于對肝癌患者進行預后情況分組的方法，所述方法包括：

5、(1)為所述患者的臨床特征與可溶性免疫檢查點特征賦值：

6、所述臨床特征為肝性腦病、c反應蛋白(crp)水平、cd8+t細胞數(shù)、腫瘤直徑：

7、如患者患有肝性腦病，賦值1分；如否，賦值0分；

8、如患者crp水平≥5mg/l，賦值1分；如否，賦值0分；

9、如患者cd8+t細胞數(shù)≥320個/μl，賦值1分；如否，賦值0分；

10、如患者腫瘤直徑≥5cm，賦值1分；如否，賦值0分；

11、所述可溶性免疫檢查點為糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced?tnf?receptor，gitr)和程序性死亡受體配體1(programmeddeath?ligand?1，pd-l1)：

12、如患者gitr水平≥75.89pg/ml，賦值1分；如否，賦值0分；

13、如患者pd-l1水平≥7.32pg/ml，賦值1分；如否，賦值0分；

14、(2)將步驟(1)中各個特征的值帶入以下風險評分公式：

15、riskscore＝1.1925413×(肝性腦病)+0.6751818×(crp)+(-0.6964451)×(cd8+t細胞)+1.2505047×(腫瘤直徑)+0.6793419×(pd-l1)+0.8117957×(gitr)，計算得到風險評分；

16、(3)將步驟(2)的風險評分與參考值相比，≥參考值則將所述患者確定為預后差的高風險組；如否，則將所述患者確定為預后差的低風險組。

17、本發(fā)明提供的方法不用于診斷疾病。

18、在本發(fā)明提供的方法中，所述肝癌優(yōu)選地是肝細胞癌(hcc)，更優(yōu)選地是乙型肝炎病毒相關肝細胞癌(hbv-hcc)。

19、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述肝癌是hbv-hcc。在本發(fā)明的上下文中，術語“hbv-hcc”被定義為患者乙型肝炎表面抗原陽性血清(hbsag≥6個月)，符合hcc診斷要求。

20、在本發(fā)明提供的方法中，所述可溶性免疫檢查點的表達水平是在患者的血液中、優(yōu)選在血漿中檢測到的。

21、可選地，本發(fā)明提供的方法在步驟(1)中還包括對所述臨床特征與可溶性免疫檢查點特征進行檢測。所述臨床特征與可溶性免疫檢查點特征情況均通過本領域公認方法進行判斷或檢測。例如，采用luminex多重免疫熒光分析檢測血漿中可溶性免疫檢查點，數(shù)據(jù)分析使用procartaplex?analyst?1.0軟件，通過擬合平均熒光強度與濃度的標準曲線來確定可溶性免疫檢查點的水平。

22、在本發(fā)明提供的方法中，步驟(3)中采用的參考值為利用hbv-hcc患者群通過所述公式計算的風險評分的最佳截斷值。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，在計算時采用r軟件的surv_cutpoint功能獲得所述參考值為2.74。

23、在本發(fā)明提供的方法中，所述預后由患者經(jīng)治療后的總生存期反映。所述治療方式可以是肝切除術、微創(chuàng)治療和姑息治療中的一種或多種。所述總生存期可以是治療后的1、2或3年總生存期。

24、在本發(fā)明提供的方法中，所述患者可以是bclc分期0-b或c-d的患者；和/或，所述患者可以是不同甲胎蛋白(alpha?fetal?protein，afp)水平的患者。

25、另一方面，本發(fā)明提供一種用于對肝癌患者進行預后情況分組的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：

26、(1)所述患者的臨床特征與可溶性免疫檢查點特征的賦值模塊：

27、所述臨床特征為肝性腦病、c反應蛋白(crp)水平、cd8+t細胞數(shù)、腫瘤直徑：

28、如患者患有肝性腦病，賦值1分；如否，賦值0分；

29、如患者crp水平≥5mg/l，賦值1分；如否，賦值0分；

30、如患者cd8+t細胞數(shù)≥320個/μl，賦值1分；如否，賦值0分；

31、如患者腫瘤直徑≥5cm，賦值1分；如否，賦值0分；

32、所述可溶性免疫檢查點為糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced?tnf?receptor，gitr)和程序性死亡受體配體1(programmeddeath?ligand?1，pd-l1)：

33、如患者gitr水平≥75.89pg/ml，賦值1分；如否，賦值0分；

34、如患者pd-l1水平≥7.32pg/ml，賦值1分；如否，賦值0分；

35、(2)所述患者的風險評分計算模塊：

36、將賦值模塊得到的各個特征的值帶入以下風險評分公式：

37、riskscore＝1.1925413×(肝性腦病)+0.6751818×(crp)+(-0.6964451)×(cd8+t細胞)+1.2505047×(腫瘤直徑)+0.6793419×(pd-l1)+0.8117957×(gitr)，計算得到風險評分；

38、(3)分組模塊：

39、將計算模塊得到的風險評分與參考值相比，≥參考值則將所述患者確定為預后差的高風險組；如否，則將所述患者確定為預后差的低風險組。

40、在本發(fā)明提供的系統(tǒng)中，所述肝癌優(yōu)選地是肝細胞癌(hcc)，更優(yōu)選地是乙型肝炎病毒相關肝細胞癌(hbv-hcc)。

41、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，所述肝癌是hbv-hcc。

42、在本發(fā)明提供的系統(tǒng)中，所述可溶性免疫檢查點的表達水平是在患者的血液中、優(yōu)選在血漿中檢測到的。

43、可選地，本發(fā)明提供的系統(tǒng)的賦值模塊還進行對所述臨床特征與可溶性免疫檢查點特征進行檢測。在該檢測模塊中，所述臨床特征與可溶性免疫檢查點特征情況均通過本領域公認方法進行判斷或檢測。例如，采用luminex多重免疫熒光分析檢測血漿中可溶性免疫檢查點，數(shù)據(jù)分析使用procartaplex?analyst?1.0軟件，通過擬合平均熒光強度與濃度的標準曲線來確定可溶性免疫檢查點的水平。

44、在本發(fā)明提供的系統(tǒng)中，分組模塊中采用的參考值為利用hbv-hcc患者群通過所述公式計算的風險評分的最佳截斷值。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，在計算時采用r軟件的surv_cutpoint功能獲得所述參考值為2.74。

45、在本發(fā)明提供的方法中，所述預后由患者經(jīng)治療后的總生存期反映。所述治療方式可以是肝切除術、微創(chuàng)治療和姑息治療中的一種或多種。所述總生存期可以是治療后的1、2或3年總生存期。

46、在本發(fā)明提供的方法中，所述患者可以是bclc分期0-b或c-d的患者；和/或，所述患者可以是不同甲胎蛋白(alpha?fetal?protein，afp)水平的患者。

47、還一方面，本發(fā)明提供一種用于肝癌患者進行預后情況分組的產品，所述產品可以在本發(fā)明提供的系統(tǒng)中使用。

48、優(yōu)選地，所述產品包括對所述臨床特征與可溶性免疫檢查點特征進行檢測中使用的工具與試劑。

49、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一個新的cox回歸模型，其可用于預測hbv-hcc患者的預后。

50、本領域中，結合免疫指標的hbv-hcc患者的預后預測模型很少。本發(fā)明的預后預測模型基于臨床指標和可溶性ics(sics)。已知sics是免疫調節(jié)的重要組成部分，盡管其確切的作用機制尚未確定，但是它們具有微創(chuàng)、低成本和快速檢測的優(yōu)勢，在液體活檢時代具有巨大的潛力，作為可溶性分子，它們很容易從血液中獲得，并且可以重復檢測，這對于評估免疫狀態(tài)和肝癌的嚴重程度具有重要意義。

51、具體而言，本發(fā)明的預后預測模型包括了兩種可溶性ics。其一為gitr，另一為pd-l1。gitr，最初被描述為一種糖皮質激素誘導因子，據(jù)報道在調節(jié)性t(treg)細胞[13]、nk細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(til)上表達[14]，它促進效應t細胞的活化和增殖，并減少treg細胞生成[15]?？扇苄詆itr的細胞來源是巨噬細胞和treg細胞[16]，研究表明sgitr觸發(fā)小鼠的炎癥反應[17]，引起小鼠巨噬細胞的細胞周期停滯和凋亡，并引起各種免疫反應[18]。在我們的研究中，高水平的sgitr與hbv-hcc患者的較短生存期顯著相關，原因可能是sgitr通過抑制gitr/gitrl途徑介導免疫抑制，導致癌癥患者預后不良。關于spd-l1，我們認為spd-l1是hbv-hcc預后的風險因素，事實上，可溶性pd-l1與pd-i結合可抑制t細胞反應[19]，這提示spd-ll與機體免疫功能受損及預后不良有關。

52、就臨床特征，本發(fā)明的預后預測模型選擇了肝性腦病、c反應蛋白(crp)水平、cd8+t細胞數(shù)、腫瘤直徑，在臨床中這些因素與患者預后密切相關，并且是容易獲得的臨床數(shù)據(jù)。本發(fā)明的預后預測模型聯(lián)合患者的免疫特征，提高了生存預測的準確性。

53、總之，我們開發(fā)了一個基于可溶性免疫檢查點的hbv-hcc患者的cox回歸預后預測模型，該預測模型結合了兩大類特征，對于不同事件分布(例如，不同的干預方式)、不同臨床分期(bclc分期0-b、c-d，各種afp水平)，它可以準確地預測患者的總生存率。在實際應用中，采用該模型可以將肝癌患者、尤其是hbv-hcc患者分為預后差的高風險組和低風險組，可以為臨床提供直接、準確的疾病診斷、治療的輔助信息。