本發(fā)明構(gòu)建的雙基因質(zhì)粒通過重塑肝癌細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)，影響其代謝重編程，首次證實線粒體網(wǎng)絡(luò)重塑與誘導(dǎo)分化的關(guān)聯(lián)，從而抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步的，本研究作用于線粒體引起的誘導(dǎo)分化可能是一種治療惡性腫瘤的新方法，為腫瘤分化療法提供新的理論基礎(chǔ)和治療策略。

背景技術(shù)：

1、肝癌細(xì)胞的“warburg”效應(yīng)是細(xì)胞癌變的共同特征，即腫瘤細(xì)胞的代謝重編程，能量代謝以線粒體為主的atp生成轉(zhuǎn)變成糖酵解，因此逆轉(zhuǎn)代謝重編程是極具潛力的腫瘤治療手段。

2、線粒體具有獨(dú)立的基因，稱為線粒體dna，編碼13種蛋白，包括nadh-coq還原酶，細(xì)胞色素c氧化酶，atp合成酶的亞基、線粒體轉(zhuǎn)錄因子a(tfam)等，主要負(fù)責(zé)參與氧化磷酸化和mtdna的形成。作為細(xì)胞內(nèi)主要的氧化磷酸化場所，絕大部分的atp于線粒體生成。線粒體損傷也是誘導(dǎo)細(xì)胞代謝紊亂的直接因素，“線粒體網(wǎng)絡(luò)”作為線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和質(zhì)量總和的代名詞。線粒體破碎的線粒體網(wǎng)絡(luò)、dna突變和線粒體功能的改變都被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件之一。在肝癌患者腫瘤組織中，mtdna拷貝數(shù)也被證明低于正常組織，線粒體動力學(xué)、ros、atp含量等均發(fā)生不同程度的變化。這種異常的線粒體改變通過代謝障礙和信號轉(zhuǎn)變促進(jìn)hcc的進(jìn)展?？梢哉f與線粒體密切相關(guān)的代謝重編程是hcc發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。

3、sirtuins是一類nad+依賴性的去乙?；福哂写龠M(jìn)細(xì)胞線粒體功能和線粒體網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)作用。sirtuins家族由7(sirt1-7)個成員組成，其中，sirt3、sirt4和sirt5蛋白在表達(dá)后都定位于線粒體，且影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前sirtuins家族在肝細(xì)胞癌中的研究集中于對信號通路的影響，如低表達(dá)sirt3的hcc患者腫瘤惡性程度更高，通過增強(qiáng)mnsod活性或索拉非尼等藥物敏感性作為治療hcc的潛在靶點；sirt4參與肝細(xì)胞癌的抑制通路并使hcc的周期停滯；sirt5一方面研究稱其去琥珀?；哪芰τ绊慳cox酶的活性抑制hcc，而另一方面sirt5在某些肝癌細(xì)胞系上調(diào)、誘導(dǎo)糖酵解的代謝重編程。但直接重塑線粒體網(wǎng)絡(luò)、改善線粒體能量代謝的領(lǐng)域缺乏清晰的研究報道。

4、基因治療的有效性已被廣泛認(rèn)可，基于不同的基因構(gòu)建相應(yīng)的載體已進(jìn)行大量研究。為了顯著增加外源性基因?qū)膊〉闹委熜Ч嗷蚬脖磉_(dá)載體已進(jìn)行多項研究，包括內(nèi)部啟動子、自剪切2a肽元件、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點ires等構(gòu)建策略。其中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點ires在多數(shù)細(xì)胞mrna的翻譯過程中起到重要作用，其上下游的目的基因均可實現(xiàn)翻譯，并克服多個啟動子之間表達(dá)抑制現(xiàn)象。在此理論基礎(chǔ)上，將其引用構(gòu)建多基因載體，將會是實現(xiàn)共時共表達(dá)較為有效的策略。

5、將sirtuins家族定位于線粒體的sirt3、sirt4和sirt5基因轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，從而重塑線粒體網(wǎng)絡(luò)、改善線粒體質(zhì)量和功能，逆轉(zhuǎn)“warburg”效應(yīng)的代謝重編程。觀察這種逆轉(zhuǎn)能否影響腫瘤細(xì)胞的分化和惡性表型，為腫瘤的基因治療提供新的理論基礎(chǔ)和治療策略，是本發(fā)明的主要目的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過分別檢測sirt3、sirt4和sirt5基因?qū)δ芰看x的影響，進(jìn)而構(gòu)建sirt3和sirt4雙基因質(zhì)粒。構(gòu)建的雙基因質(zhì)粒通過重塑肝癌細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而影響其代謝重編程，首次證實線粒體網(wǎng)絡(luò)重塑與誘導(dǎo)分化的關(guān)聯(lián)，從而抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

技術(shù)特征：

1.本發(fā)明通過sirt3、sirt4和sirt5基因的檢測篩選，構(gòu)建雙基因質(zhì)粒pires-sirt3/4，改善肝癌細(xì)胞的線粒體功能障礙，逆轉(zhuǎn)代謝重編程，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化，實現(xiàn)抑制惡性表型的作用。

2.權(quán)利要求1所述的sirt3、sirt4和sirt5基因的檢測篩選，其特征在于，sirt3和sirt4改善肝癌細(xì)胞氧化磷酸化關(guān)鍵酶，提高線粒體呼吸功能，而sirt5促進(jìn)糖酵解關(guān)鍵酶pk，達(dá)到進(jìn)一步促“warburg”效應(yīng)的作用。

3.權(quán)利要求1所述的一種雙基因質(zhì)粒pires-sirt3/4，其特征在于，選用了攜帶內(nèi)部核糖體結(jié)合位點ires的母質(zhì)粒pires2-egfp，將人sirt3和sirt4基因克隆在ires的上下游，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的雙基因表達(dá)質(zhì)粒psirt3/4，實現(xiàn)sirt3和sirt4基因的共時共表達(dá)。

4.權(quán)利要求3所述的sirt3和sirt4基因，其特征在于，sirt3促進(jìn)肝癌細(xì)胞中線粒體生物發(fā)生因子pcg-1α，sirt4調(diào)控線粒體自噬蛋白pink1和parkin。二者相互作用，顯著重塑肝癌細(xì)胞中損傷的線粒體網(wǎng)絡(luò)。

5.權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞分化，其特征在于，線粒體網(wǎng)絡(luò)顯著改善，線粒體呼吸功能恢復(fù)，肝癌細(xì)胞由以有氧糖酵解為主的能量代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榫€粒體作用的氧化磷酸化。肝癌細(xì)胞分化標(biāo)志物hnf4α和hnf3γ增加，肝癌細(xì)胞的惡性表型得到顯著抑制。

6.權(quán)利要求1所述的一種雙基因質(zhì)粒pires-sirt3/4，這種作用于線粒體引起的誘導(dǎo)分化可能是一種治療惡性腫瘤的新方法和新策略，用于治療惡性腫瘤的藥物制備的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
癌細(xì)胞在癌變后會發(fā)生以有氧糖酵解為主的代謝重編程。本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)SIRT3和SIRT4雙基因的重塑線粒體網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞分化，首次公開了癌細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)重塑和誘導(dǎo)分化之間的關(guān)聯(lián)，為惡性腫瘤的分化療法提供新的基因治療策略。本發(fā)明利用IRES的連接成功構(gòu)建雙基因質(zhì)粒pSIRT3/4，實現(xiàn)了外源多基因在胞內(nèi)的共時共表達(dá)。證明肝癌細(xì)胞具有線粒體功能損傷及破碎的線粒體網(wǎng)絡(luò)，而雙基因的轉(zhuǎn)入顯著改善線粒體質(zhì)量和功能。最后，對肝癌細(xì)胞進(jìn)行惡性表型和分化指標(biāo)檢測，證明SIRT3和SIRT4雙基因是通過改善線粒體功能障礙，達(dá)到逆轉(zhuǎn)代謝重編程，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化的目的，進(jìn)而抑制其發(fā)生發(fā)展，為肝細(xì)胞癌及惡性腫瘤的分化療法提供新的理論基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：利時雨,張麗君
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州溯原生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/10