本發(fā)明涉及菌株代謝產(chǎn)物分離應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及從貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中分離包含脂肽類化合物的混合物，涉及貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，還涉及包含脂肽類化合物的混合物的抑菌活性應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、貝萊斯芽孢桿菌(bacillus?velezensis)是一種新型生防細(xì)菌，最早于2005年，西班牙學(xué)者ruiz-garcía等分離得到2個菌株cr-14b和cr-502t，它們能合成大量的脂肽類物質(zhì)并具有強的抑菌活性。貝萊斯芽孢桿菌分布廣泛，可在干旱、鹽漬等逆境下存活，相關(guān)產(chǎn)品甚少，開發(fā)前景廣闊。

2、貝萊斯芽孢桿菌tcs001(bacillus?velezensis?tcs001)分離自渤海淤泥，原始菌株為海洋芽孢桿菌ct2628，經(jīng)誘變穩(wěn)定后鑒定并命名為貝萊斯芽孢桿菌tcs001(bacillusvelezensis?tcs001)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為cgmcc?no.8921，首次公布于專利zl201410168402.2。在na培養(yǎng)基上生長后，tcs001單菌落形態(tài)呈近圓形，淺黃色，不透明；培養(yǎng)初期菌落表面光滑，邊緣整齊，后期表面有褶皺，邊緣略不整齊，中間有凸起，四周呈云霧狀擴散。革蘭氏染色表明：貝萊斯芽孢桿菌tcs001菌株為革蘭氏陽性，桿狀；對黃瓜灰霉病菌、黃瓜蔓枯病菌、黃瓜菌核病菌、黃瓜褐斑病菌、棉花枯萎病菌及香蕉葉斑病菌均有一定的抑制效果，其中對黃瓜灰霉病菌的抑制率最高，達(dá)87.66％。

3、本領(lǐng)域已知，芽孢桿菌屬細(xì)菌可分泌多種具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，然而，貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中的代謝物質(zhì)尚不明確。本發(fā)明通過優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌tcs001培養(yǎng)基的配方以及培養(yǎng)發(fā)酵工藝，提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中代謝物質(zhì)的產(chǎn)量，提取和分離代謝物質(zhì)，并對代謝物質(zhì)進(jìn)行生物活性測定，解析貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液的抗菌作用機理。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是對貝萊斯芽孢桿菌tcs001主要代謝物質(zhì)脂肽類抑菌物質(zhì)的提取、分離、純化與鑒定，明確貝萊斯芽孢桿菌tcs001脂肽類抑菌次生代謝產(chǎn)物的種類與含量。

2、本發(fā)明的另一目的是通過優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌tcs001培養(yǎng)基的配方以及培養(yǎng)發(fā)酵工藝，提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中代謝物質(zhì)的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

3、本發(fā)明涉及一種包含脂肽類化合物的混合物，脂肽類化合物為具有如下結(jié)構(gòu)所示的化合物，混合物中包含至少一種、二種、三種或多種脂肽類化合物，

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9、其中，所述式(一)化合物、式(二)化合物、式(三)化合物的重量分別占式(一)化合物、式(二)化合物和式(三)化合物總重量的約19.5％、48.8％、31.7％；優(yōu)選的，式(一)化合物：式(二)化合物：式(三)化合物的重量比19.5：48.8：31.7，式(一)化合物：式(二)化合物：式(三)化合物的重量比約為2:5:3。

10、所述式(四)化合物、式(五)化合物的重量分別占式(四)化合物、式(五)化合物總重量的約25％和75％。優(yōu)選的，式(四)化合物：式(五)化合物的重量比約為25:75。

11、所述包含脂肽類化合物的混合物分離自貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液；

12、所述分離方法可以為酸沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、有機溶劑萃取法，優(yōu)選的，所述分離方法為酸沉淀法。

13、所述貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液為貝萊斯芽孢桿菌tcs001種子液接種到培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)獲得；

14、所述貝萊斯芽孢桿菌tcs001種子液為活化的貝萊斯芽孢桿菌tcs001菌株經(jīng)mlb培養(yǎng)液發(fā)酵培養(yǎng)獲得；

15、所述培養(yǎng)基包括可溶性淀粉10.5g/l，花生餅粉18.5g/l，nacl?3.0g/l。

16、所述發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件為裝液量32％，接種量3％，初始發(fā)酵ph為6.0，發(fā)酵溫度31℃，種齡16h，轉(zhuǎn)速164rpm，發(fā)酵培養(yǎng)時間48h。

17、本發(fā)明的另一目的是確定貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中主要代謝物質(zhì)脂肽類抑菌物質(zhì)整體和部分的生物活性。

18、本發(fā)明涉及脂肽類式(一)化合物至式(五)化合物用于抑制植物病原真菌的用途，所述植物病原真菌為灰霉菌。

19、本發(fā)明涉及包含脂肽類化合物的混合物在防治山核桃干腐病、番茄早疫病、馬鈴薯晚疫病、草莓灰霉病、油菜菌核病、蘋果斑點落葉病、黃瓜靶斑病、黃瓜黑斑病、小麥紋枯病、高粱炭疽病、茶樹炭疽病、膠孢炭疽病、辣椒疫霉病、鐵皮石斛炭疽病、南瓜葉斑病、黃瓜枯萎病、草莓炭疽病、蘋果褐斑病的應(yīng)用。

20、本發(fā)明的另一目的是通過脂肽類次生代謝產(chǎn)物的分離提取，提高了芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物的純度與濃度，且因其理化性質(zhì)較貝萊斯芽孢桿菌tcs001自身更為穩(wěn)定，在田間病害防治中具有廣闊的應(yīng)用價值。

21、本發(fā)明涉及一種提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中脂肽類化合物的方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括1％可溶性淀粉，2％花生餅粉，0.3％nacl。所述發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度31℃、時間48h、ph?6.0、接種量3％、裝液量32％，酸沉淀ph?2.0。

22、本發(fā)明涉及一種提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中脂肽類化合物的方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括可溶性淀粉10.5g/l，花生餅粉18.5g/l，nacl?3g/l。

23、本發(fā)明有益的技術(shù)效果

24、本發(fā)明首次從貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中分離出包含脂肽類化合物的混合物，并測定了該混合物的生物活性；

25、本發(fā)明首次明確了貝萊斯芽孢桿菌tcs001產(chǎn)生的脂肽類次生代謝產(chǎn)物種類，并明確了主要的脂肽類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其生物活性，且因脂肽類活性物質(zhì)的理化性質(zhì)較貝萊斯芽孢桿菌tcs001自身更為穩(wěn)定，其在田間病害防治中具有廣闊的應(yīng)用價值。

26、本發(fā)明通過優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌tcs001培養(yǎng)基的配方以及培養(yǎng)發(fā)酵工藝，提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中代謝物質(zhì)的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

27、本發(fā)明提取分離的脂肽類次生代謝物是芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的重要抑菌活性物質(zhì)，本發(fā)明提高了貝萊斯芽孢桿菌tcs001脂肽類次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，進(jìn)而可有效提高其在植物病害防治中的效果。

技術(shù)特征：

1.一種包含脂肽類化合物的混合物及其抑制植物病原真菌的用途，其特征在于，脂肽類化合物為具有如下結(jié)構(gòu)所示的化合物，混合物中包含至少一種、二種、三種或多種脂肽類化合物，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含脂肽類化合物的混合物及其抑制植物病原真菌的用途，其特征在于，所述混合物分離自貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述包含脂肽類化合物的混合物及其抑制植物病原真菌的用途，其特征在于，所述分離脂肽類化合物的方法為酸沉淀法。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述包含脂肽類化合物的混合物及其抑制植物病原真菌的用途，其特征在于，所述貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液為貝萊斯芽孢桿菌tcs001種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)獲得；優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源為質(zhì)量/體積為1％的可溶性淀粉；氮源為質(zhì)量/體積為2％的花生餅粉；無機鹽為質(zhì)量/體積為0.3％的nacl尤其優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括可溶性淀粉10.5g/l，花生餅粉18.5g/l，nacl?3g/l。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述包含脂肽類化合物的混合物及其抑制植物病原真菌的用途，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件包括發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵培養(yǎng)時間48h，初始發(fā)酵ph為6.0，裝液量32％中的一種或幾種；優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件還包括接種量3％，種齡16h，轉(zhuǎn)速164rpm中的一種或幾種。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述包含脂肽類化合物的混合物及其抑制植物病原真菌的用途，其特征在于，所述貝萊斯芽孢桿菌tcs001種子液為活化的貝萊斯芽孢桿菌tcs001菌株經(jīng)mlb培養(yǎng)液發(fā)酵培養(yǎng)獲得。

7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的脂肽類化合物用于抑制植物病原真菌的用途；優(yōu)選的，所述植物病原真菌為灰霉菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述包含脂肽類化合物的混合物在防治山核桃干腐病、番茄早疫病、馬鈴薯晚疫病、草莓灰霉病、油菜菌核病、蘋果斑點落葉病、黃瓜靶斑病、黃瓜黑斑病、小麥紋枯病、高粱炭疽病、茶樹炭疽病、膠孢炭疽病、辣椒疫霉病、鐵皮石斛炭疽病、南瓜葉斑病、黃瓜枯萎病、草莓炭疽病、蘋果褐斑病的應(yīng)用。

9.一種提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中脂肽類化合物的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括質(zhì)量/體積1％的可溶性淀粉，質(zhì)量/體積2％的花生餅粉，質(zhì)量/體積0.3％的nacl；優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括可溶性淀粉10.5g/l，花生餅粉18.5g/l，nacl?3g/l。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的提高貝萊斯芽孢桿菌tcs001發(fā)酵液中脂肽類化合物的方法，其特征在于，所述發(fā)酵工藝條件包括發(fā)酵溫度31℃、時間48h、ph?6.0、裝液量32％中的一種或幾種。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及將包含脂肽類化合物的混合物從貝萊斯芽孢桿菌TCS001發(fā)酵液中分離，發(fā)現(xiàn)包含脂肽類化合物的混合物以及五種脂肽類化合物具有抑制植物病原真菌的活性，較貝萊斯芽孢桿菌TCS001自身更為穩(wěn)定，在田間病害防治中具有廣闊的應(yīng)用價值。通過優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌TCS001培養(yǎng)基的配方以及培養(yǎng)發(fā)酵工藝條件，提高了貝萊斯芽孢桿菌TCS001發(fā)酵液中脂肽類化合物的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

技術(shù)研發(fā)人員：金京,陳杰,楊然迪,楊怡妍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15