本專利屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域，具體涉及到包含cd28或4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域的新型t細(xì)胞受體融合構(gòu)建體（truc）-t細(xì)胞的構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、嵌合抗原受體（car）t細(xì)胞療法是治療癌癥的革命性療法之一，已在血液腫瘤取得了里程碑式的突破。car-t細(xì)胞技術(shù)的基本原理主要是通過(guò)基因工程技術(shù)在t細(xì)胞表面裝上定位導(dǎo)航裝置car?(嵌合抗原受體)；car-t細(xì)胞利用其car專門(mén)識(shí)別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)免疫作用釋放多種效應(yīng)因子，從而高效地殺滅腫瘤細(xì)胞。car是car-t的核心部件，賦予t細(xì)胞hla非依賴的方式識(shí)別腫瘤抗原的能力。嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴（crs）、免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（icans）等毒副反應(yīng)、緩解后容易復(fù)發(fā)、實(shí)體腫瘤療效不佳是car-t療法目前面臨的重大挑戰(zhàn)。car-t細(xì)胞免疫療法在實(shí)體腫瘤的療效遠(yuǎn)不及血液腫瘤，重要原因包括腫瘤異質(zhì)性、缺乏特異性腫瘤抗原、car-t細(xì)胞向腫瘤病灶的趨化和滲透受到限制及其持久性較差、腫瘤免疫抑制微環(huán)境。

2、tcr由6種、共8個(gè)亞基組成，各亞基以獨(dú)特但又協(xié)調(diào)的方式彼此相互作用精密調(diào)控t細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的質(zhì)量、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。truc-t細(xì)胞既克服了hla依賴性，又具有不誘發(fā)crs的潛力。truc主要包括兩部分：胞外抗原結(jié)合區(qū)、cd3ε。truc-t細(xì)胞因充分利用了天然tcr信號(hào)通路，能誘導(dǎo)一種可控的抗腫瘤免疫反應(yīng)，且毒副作用較低，從而無(wú)論是療效還是安全性均優(yōu)于經(jīng)典的car-t細(xì)胞：1）能更有效地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，但不受hla的限制；2）與常規(guī)t細(xì)胞的激活類似，利用完整tcr的活化和調(diào)節(jié)機(jī)制，可避免大量細(xì)胞因子的釋放，以致安全性較好；3）快速遷移到腫瘤部位，穿透力增強(qiáng)，并保持較為持久的反應(yīng)性，以致能高效消除腫瘤（包括實(shí)體腫瘤）。

3、t細(xì)胞需要至少兩個(gè)信號(hào)才能完全激活：第一信號(hào)是通過(guò)tcr，第二信號(hào)或共刺激是通過(guò)cd80或cd86連接cd28介導(dǎo)。對(duì)于單獨(dú)tcr信號(hào)的誘導(dǎo)t細(xì)胞無(wú)反應(yīng)。第一代car僅與tcr-cd3ζ鏈偶聯(lián)，能夠提供與整個(gè)cd3復(fù)合物類似的刺激信號(hào)。然而這種car-t細(xì)胞由于缺少第二信號(hào)，在體內(nèi)的持久性和抗腫瘤效果非常有限，沒(méi)有明顯的臨床療效。為了增強(qiáng)刺激效果，第二代car在第一代car的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)共刺激模塊，使car-t細(xì)胞能夠擴(kuò)增改善其持續(xù)性，從而臨床療效能得到顯著改善。

4、鑒于第二信號(hào)在t細(xì)胞（包括car-t）激活中的必要性，本發(fā)明研制成功并優(yōu)化了含第二信號(hào)cd28或4-1bb的新型truc-t細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)car-t療法的嚴(yán)重毒副反應(yīng)（如crs和icans）及其對(duì)實(shí)體瘤的有限療效，本研究發(fā)明了包含cd28或4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域的新型truc（cd28）-t細(xì)胞和truc（4-1bb）-t細(xì)胞（以靶向bcma的truc（cd28）-t細(xì)胞和truc（4-1bb）-t細(xì)胞為例）。

2、通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建plenti-anti-bcma?truc、plenti-anti-bcma?truc(cd28)、plenti-anti-bcma?truc(4-1bb)質(zhì)粒載體，然后利用高滴度、高純度的慢病毒規(guī)模化生產(chǎn)工藝包裝出慢病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞，培養(yǎng)五天后通過(guò)流式分別檢測(cè)anti-bcmatruc的表達(dá)率，體外驗(yàn)證anti-bcma?truc細(xì)胞對(duì)表達(dá)bcma陽(yáng)性細(xì)胞的體外殺傷作用、以及對(duì)人移植腫瘤（如多發(fā)性骨髓瘤）nsg小鼠模型的療效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及如下優(yōu)點(diǎn)。

3、1，本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建包含cd28或4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域的新型truc（cd28）-t細(xì)胞和truc（4-1bb）-t細(xì)胞，使truc（cd28）-t細(xì)胞和truc（4-1bb）-t細(xì)胞同時(shí)具備第一信號(hào)和第二信號(hào)，其中truc（cd28）包括抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、cd3ε、cd28胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域，seq?id?no.1氨基酸序列所編。truc（4-1bb）-t細(xì)胞包括抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、cd3ε、4-1bb結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)seq?id?no.2氨基酸序列所編。

4、2，本發(fā)明通過(guò)4-1bb或cd28結(jié)構(gòu)域直接連接cd3ε使truc（cd28）-t細(xì)胞和truc（4-1bb）-t細(xì)胞殺傷強(qiáng)，體內(nèi)抑瘤久，細(xì)胞持久性好。

5、3，本發(fā)明通過(guò)將cd28結(jié)構(gòu)域內(nèi)結(jié)構(gòu)域直接連接至truc結(jié)構(gòu)后使truc（cd28）-t細(xì)胞增殖快。

技術(shù)特征：

1.包含cd28共刺激結(jié)構(gòu)域的新型truc-t細(xì)胞載體，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd3ε、細(xì)胞內(nèi)cd28結(jié)構(gòu)域，所述包含cd28共刺激結(jié)構(gòu)域的新型truc的氨基酸序列為seq?id?no.1。

2.包含4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域的新型truc-t細(xì)胞載體，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd3ε、細(xì)胞內(nèi)4-1bb結(jié)構(gòu)域，所述包含4-1bb細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的新型truc的氨基酸序列為seq?id?no.2。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了兩種包含CD28或4?1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的新型T細(xì)胞受體融合構(gòu)建體（TRuC）?T細(xì)胞的構(gòu)建與應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)在TRuC胞內(nèi)CD3ε結(jié)構(gòu)域C末端添增CD28或4?1BB共刺激結(jié)構(gòu)域構(gòu)建成新型TRuC28?T細(xì)胞和TRuC4?1BB?T細(xì)胞。與原始TRuC?T細(xì)胞相比，這些新型TRuC?T細(xì)胞均可同時(shí)整合第一信號(hào)和第二信號(hào)激活T細(xì)胞，從而顯著增強(qiáng)其對(duì)靶細(xì)胞的裂解能力、并顯著延長(zhǎng)其體內(nèi)的持久性，有效防治疾病復(fù)發(fā)，改善TRuC?T細(xì)胞的療效。

技術(shù)研發(fā)人員：高基民,魏成,方軼男,黃鑫,徐天龍,趙愛(ài)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江啟新生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19