本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和分子育種領(lǐng)域，具體涉及三蕊柳雄性的dna分子標(biāo)記及三蕊柳雌雄株快速鑒定的方法。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、三蕊柳(salix?triandra)是楊柳科的一種雌雄異株灌木或喬木，其原產(chǎn)于西亞、中亞和歐洲，如今從日本到西歐廣泛分布。三蕊柳具有繁殖效率高、易于栽培等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，如在非原產(chǎn)地的美國大量種植。三蕊柳是歐洲、中國和美國等地柳屬育種領(lǐng)域中重要的親本樹種之一，近些年相繼獲得了以三蕊柳為親本的salix?purpurea×salixtriandra×salix?viminalis、salix?triandra×salix?dasyclados、salix?triandra×salix?viminalis等雜交品種，瑞典更是將三蕊柳作為親本培育速生的生物能源柳。為更好地實(shí)現(xiàn)其生產(chǎn)價值、有針對性地調(diào)節(jié)雌雄比例，鑒定雜交品種基因型等，性別特異性分子標(biāo)記顯得尤為重要。目前，研究者普遍采用三種方式對柳屬性別進(jìn)行鑒定，其一，對生殖器官進(jìn)行觀察、解剖；其二，對種子或植株進(jìn)行同工酶檢測；其三，在生殖器官成熟前采用aflp、rflp等技術(shù)開發(fā)分子標(biāo)記達(dá)到早期鑒定雌雄株的目的。

2、然而，關(guān)于三蕊柳性別鑒定的方法報道極少，因此，在三蕊柳中發(fā)明出可快速、準(zhǔn)確地對三蕊柳進(jìn)行性別鑒定的方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明從分子層面對三蕊柳的性別進(jìn)行鑒定，在基因組組裝的基礎(chǔ)上，確定三蕊柳雄性特異區(qū)，并根據(jù)雄性特異序列開發(fā)出雄特異性dna分子標(biāo)記及引物用于高效、穩(wěn)定、快速地鑒定三蕊柳的雌雄株。

2、本發(fā)明的目的是發(fā)掘三蕊柳的雄性特異序列，并開發(fā)其相應(yīng)的分子標(biāo)記及檢測引物用以快速準(zhǔn)確高效地鑒定三蕊柳的性別，有利于苗期對目標(biāo)性別的選育工作，也能為以三蕊柳為親本進(jìn)行雜交的后代基因型鑒定提供序列信息。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、對三蕊柳的20個雌株和19個雄株個體進(jìn)行重測序，以組裝的三蕊柳雄株單倍型基因組序列為參考，使用染色體商(cq)的方法鑒定出三蕊柳為雄性異配體，且定位到性染色體為15x、15y。根據(jù)雄性個體間群體分化指數(shù)fst分析，確定染色體15y的性別連鎖區(qū)域?yàn)?.83-7.16mb。將15y的全部基因蛋白序列與15x的蛋白序列進(jìn)行blastp比對分析，篩選15y的性別連鎖區(qū)域中無比對結(jié)果的基因做為三蕊柳雄特異性基因，這些基因?qū)?yīng)的核苷酸序列為雄特異性dna序列。最終確定雄特異性基因分別為satri15bg0039800、satri15bg0039500、satri15bg0039900、satri15bg0040000，雄性特異dna分子標(biāo)記名稱分別為：1-satri15bg0039800、2-satri15bg0039500、3-satri15bg0039900、4-satri15bg0040000，其核苷酸序列分別為seq?id?no.1-4所示。

5、本發(fā)明提供一種三蕊柳雄性特異序列分子標(biāo)記，其核苷酸序列分別為seq?idno.1-4任意之一所示。

6、本發(fā)明進(jìn)而提供所述的分子標(biāo)記在鑒定三蕊柳的雌雄株中的應(yīng)用。

7、具體地，通過pcr擴(kuò)增待測植株的基因組dna以判斷是存在所述分子標(biāo)記，或者通過探針與待測植株的基因組dna核酸雜交以判斷是存在所述分子標(biāo)記，或者通過對待測植株的基因組dna進(jìn)行測序以判斷是存在所述分子標(biāo)記，如果存在所述分子標(biāo)記，則為雄株，否為雌株。

8、本發(fā)明相應(yīng)提供基于所述的分子標(biāo)記鑒定三蕊柳的雌雄株的特異性pcr引物。

9、優(yōu)選地，其是下述4對引物任意之一：正向引物如seq?id?no.5所示，反向引物如seq?id?no.6所示；

10、正向引物如seq?id?no.7所示，反向引物如seq?id?no.8所示；

11、正向引物如seq?id?no.9所示，反向引物如seq?id?no.10所示；

12、正向引物如seq?id?no.11所示，反向引物如seq?id?no.12所示。

13、本發(fā)明尤其提供一種鑒定三蕊柳的雌雄株的方法，其特征在于，其利用基于所述的分子標(biāo)記鑒定三蕊柳的雌雄株的特異性pcr引物對待測植株的基因組模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有相應(yīng)的條帶則表明樣品為雄性，若未獲得相應(yīng)條帶，則表明樣品為雌性。

14、優(yōu)選地，所述pcr引物是下4對引物任意之一：

15、正向引物如seq?id?no.5所示，反向引物如seq?id?no.6所示；

16、正向引物如seq?id?no.7所示，反向引物如seq?id?no.8所示；

17、正向引物如seq?id?no.9所示，反向引物如seq?id?no.10所示；

18、正向引物如seq?id?no.11所示，反向引物如seq?id?no.12所示

19、具體地，采取的pcr擴(kuò)增體系如下：

20、

21、

22、pcr擴(kuò)增條件如下：設(shè)置為預(yù)變性98℃，3min；變性98℃，10sec，退火68℃，15sec，循環(huán)數(shù)35次；延伸72℃，5min。

23、具體地，所述4對引物分別擴(kuò)增時，如果有相應(yīng)的擴(kuò)增特異條帶分別為256bp、264bp、256bp和264bp，則表明樣品為雄性，若未獲得相應(yīng)條帶，則表明樣品為雌性。

24、在具體實(shí)施方式中，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

25、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過篩選與三蕊柳性別連鎖的特異性dna序列，獲得4個三蕊柳雄性特異性的dna分子標(biāo)記，設(shè)計可用于檢測該分子標(biāo)記的引物并開展三蕊柳雌雄性別鑒定實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了開發(fā)的分子標(biāo)記及引物的可靠性。本發(fā)明提供鑒定三蕊柳性別的方法準(zhǔn)確，操作簡單、準(zhǔn)確度高，有效克服了選育期和植株非花期難以區(qū)分雌雄株的缺點(diǎn)。采用該發(fā)明的方法可在育種期間對目標(biāo)性別進(jìn)行篩選，可以節(jié)約生產(chǎn)和管理成本，在育種生產(chǎn)實(shí)踐中有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種三蕊柳雄性特異序列分子標(biāo)記，其核苷酸序列分別為seq?id?no.1-4任意之一所示。

2.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在鑒定三蕊柳的雌雄株中的應(yīng)用。

3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中通過pcr擴(kuò)增待測植株的基因組dna以判斷是存在所述分子標(biāo)記，或者通過探針與待測植株的基因組dna核酸雜交以判斷是存在所述分子標(biāo)記，或者通過對待測植株的基因組dna進(jìn)行測序以判斷是存在所述分子標(biāo)記，如果存在所述分子標(biāo)記，則為雄株，否為雌株。

4.基于權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記鑒定三蕊柳的雌雄株的特異性pcr引物。

5.如權(quán)利要求4所述的pcr引物，其特征在于，其是下述4對引物任意之一：正向引物如seq?id?no.5所示，反向引物如seq?id?no.6所示；

6.一種鑒定三蕊柳的雌雄株的方法，其特征在于，其利用基于權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記鑒定三蕊柳的雌雄株的特異性pcr引物對待測植株的基因組模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有相應(yīng)的條帶則表明樣品為雄性，若未獲得相應(yīng)條帶，則表明樣品為雌性。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr引物是下4對引物任意之一：

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，

9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，

10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種用于鑒定三蕊柳性別的雄性特異DNA分子標(biāo)記及其檢測引物。本發(fā)明利用三蕊柳高質(zhì)量單倍型基因組和重測序數(shù)據(jù)，使用CQ和Fst等方法鑒定到三蕊柳為雄性異配體（XX/XY），其性染色體位于15號，Y性別連鎖區(qū)為5.83?7.16Mb，經(jīng)過blastp比對分析，最終鑒定到4個Y特異基因序列作為三蕊柳雄性特異DNA分子標(biāo)記。通過對雄性特異DNA分子標(biāo)記設(shè)計引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增可快速鑒定三蕊柳雌雄株。本發(fā)明可用于苗期三蕊柳雌雄株快速鑒定，為育種期間對目標(biāo)性別進(jìn)行篩選節(jié)約了成本，提供了便利，在柳屬性別鑒定的生產(chǎn)實(shí)踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：朱芷瑩,何理,王一,丁潔
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海辰山植物園
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19