本發(fā)明涉及生物制藥(抗體藥物)和基因工程，具體而言，是關于靶向免疫檢查點tim3的抗體及其應用。

背景技術：

1、t細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(t?cell?immunoglobulin?and?mucin?domain-containing?protein?3，tim3)，又稱甲型肝炎病毒細胞受體2(hepatitis?a?viruscellular?receptor?2，havcr2)，是一類t細胞表面抑制性分子，隸屬于tim免疫調節(jié)蛋白家族的一種i型跨膜蛋白，主要表達在t細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等多種免疫細胞上，同時也在多種腫瘤細胞上表達。tim3最初是作為表達于能夠產生γ干擾素的輔助性t細胞(cd4+th1)和細胞毒性t細胞(cd8+?t)上的一種受體被鑒定，在多種鼠類和人類免疫細胞中表達，tim3基因位于小鼠基因組中的11b1.1和人類基因組中的5q33.2上。人tim3蛋白由302個氨基酸組成，鼠同源物含有281個氨基酸殘基(與人同源性為63％)。tim3屬于免疫球蛋白超家族(igsf)，由7個外顯子組成，編碼其全長蛋白質序列，其特征是由一個氨基末端免疫球蛋白可變結構域(v結構域)和五個非共價半胱氨酸、一個粘蛋白柄、一個跨膜結構域和一個細胞質尾組成的共同結構組織，具有n端ig可變區(qū)(igv)樣結構域，膜近端黏蛋白樣結構域，其中包含o-聯(lián)糖基化位點(糖基化黏蛋白結構域)，單個跨膜區(qū)和一個c-端胞質尾，在粘蛋白和跨膜之間也存在n-聯(lián)糖基化位點。

2、tim3主要的配體有半乳糖凝集素-9(galectin-9)、高遷移率家族蛋白1(hmgbl)、癌胚抗原相關粘附分子1(ceacam1)、磷脂酰絲氨酸(ps)，但tim3與其配體相互作用引起免疫抑制的相關機制目前仍然不是十分清楚。

3、tim3可在多種免疫細胞中表達，包括cd4+t細胞中的1型t輔助細胞(th1)和17型t輔助細胞(th17)、cd8+t細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor?infiltrating?lymphocytes，tils)、調節(jié)性t細胞(tregs)、先天免疫細胞(如nk細胞)和foxp3+treg細胞等。研究表明阻礙抗腫瘤免疫的關鍵是t細胞功能障礙或t細胞衰竭，這種細胞狀態(tài)的特點是促炎癥細胞因子的產生受到損害，并且細胞毒性會隨著對抗原的持續(xù)暴露而發(fā)展，而tim3正是主要通過介導t細胞衰竭來抑制抗腫瘤免疫。th1和th17細胞通過促炎癥細胞因子參與抗腫瘤細胞介導的免疫，而cd8+t細胞是通過結合目標抗原來摧毀潛在的威脅，因此tim3促進了免疫耐受的發(fā)生。在t細胞激活后，tim3除了在釋放ifn-γ的cd4+t細胞和cd8+t細胞表達上調，在人類pbmc中，tim3在所有成熟cd56dimcd16+nk細胞上均有表達，未成熟cd56brightcd16?nk細胞在il-12、il-15、il-18的刺激下均能誘導tim3表達，提示tim3是nk細胞成熟的標志。t細胞衰竭抑制抗腫瘤免疫也可由tim3+cd8+?t細胞的stat5和p38信號通路受損所引起，阻斷tim3途徑可增加t細胞中干擾素-γ(ifn-γ)的產生，增強抗腫瘤免疫反應。在體外和體內模型中，cd8+tim3+t細胞的表達與pd-1的表達相關。此外，tim3在天然免疫細胞上的表達可抑制天然抗腫瘤免疫，抑制白細胞介素-2(il-2)等細胞因子的增殖和產生。pd-1和tim3陽性cd8+t細胞產生的ifn-γ較tim3陰性cd8+t細胞少，抗tim3抗體也能增加外周血nk細胞的ifn-γ。表達tim3的肥大細胞可以通過含免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-based?activation?motif，itam)的ige高親和力受體(fcepsilonri)激活，其使用的信號傳導途徑類似于t細胞。tim3在受體近端起作用，以增強lyn依賴激酶的信號通路，該信號通路可調節(jié)fcepsilonri連接下游的即期脫粒和后期細胞因子生成(wolf,y.；a.c.anderson?and?v.k.kuchroo,tim3?comes?of?age?as?an?inhibitoryreceptor.nature?reviews?immunology,2020.20(3):173-185)。

4、大量的證據支持，阻斷tim3信號通路可以增強pd-1抗體治療癌癥的效果，這推動了抗tim3阻斷抗體作為抗腫瘤免疫藥物的研發(fā)，以期能夠用于腫瘤的治療。目前，在癌癥患者中使用抗tim3抗體的幾項臨床試驗正在進行中。

5、因此，開發(fā)出tim3抗體具有重要的臨床意義。

技術實現思路

1、本發(fā)明的一個目的在于提供一種特異性結合tim3的分子。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種靶向tim3的抗體。

3、本發(fā)明的另一目的在于提供tim3抗體的相關應用。

4、為了開發(fā)出特異性結合tim3的結合分子，本發(fā)明使用tim3融合蛋白免疫balb/c小鼠，通過雜交瘤融合技術及細胞elisa(使用293t-tim3細胞作為陽性細胞，293t細胞作為陰性細胞)，篩選分泌可與tim3特異性結合抗體的雜交瘤克隆，分離得到了一種可與tim3特異性結合的抗體，通過測序的方法鑒定了該抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列。

5、根據本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種分子，該分子能夠免疫特異性結合tim3，因此本發(fā)明中亦稱其為tim3結合分子。具體而言，該分子包括tim3抗體或來源于該抗體的能夠免疫特異性結合tim3的生物活性片段(抗原結合片段)，其中所述tim3抗體的六個cdr的氨基酸序列包括：

6、重鏈cdr1：gysftgynmn(seq?id?no:1)；

7、重鏈cdr2：iidpyygttnynqkfrg(seq?id?no:2)；

8、重鏈cdr3：ggnsfdy(seq?id?no:3)；

9、輕鏈cdr1：tassilssnylh(seq?id?no:4)；

10、輕鏈cdr2：stsylas(seq?id?no:5)；

11、輕鏈cdr3：hqfhpsprt(seq?id?no:6)。

12、本發(fā)明中，“免疫特異性結合”是指，如果這種結合展現一種抗體結合至其同源抗原的特異性以及親和力的話，則稱一個分子能夠“免疫特異性地結合”另一分子。如果這種結合涉及免疫球蛋白分子的抗原識別位點的話，則稱抗體能夠“免疫特異性地結合”至抗原(并且特別是人tim3)的一個靶區(qū)域或構造(“表位”)。免疫特異性地結合到一種具體的抗原的一種抗體可以按更低的親和力結合到其他抗原，前提是如果該其他抗原具有由如通過例如免疫測定、測定、或本領域中已知的其他測定確定的抗原識別位點所識別的一些序列或構造相似性的話，但不會結合至完全不相關的抗原。然而，優(yōu)選地，抗體(及其抗原結合片段)將不與其他抗原發(fā)生交叉反應?？贵w也可以按非免疫特異性的方式結合到其他分子，諸如結合到fc受體(fcr)，憑借該分子的不涉及該抗原識別位點的其他區(qū)域/域中的結合域，諸如fc區(qū)。

13、本發(fā)明中，一個分子“能夠免疫特異性結合tim3”是指，該分子具有通過結合tim3而減弱或阻斷該tim3與配體結合的能力。

14、根據本發(fā)明的具體實施方案，來源于本發(fā)明的抗體的能夠免疫特異性結合tim3的生物活性片段包括所述tim3抗體的六個cdr的氨基酸序列。

15、根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的抗體可以為動物源抗體，也可以為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。

16、本發(fā)明中，“抗體”旨在表示具有一個“可變區(qū)”抗原識別位點的一個免疫球蛋白分子。術語“可變區(qū)”旨在將該免疫球蛋白的這種域與抗體廣泛共享的域(例如一個抗體fc域)區(qū)分。本發(fā)明中，術語一種抗體的“抗原結合片段”是指一種抗體的包含以下項的一個或多個部分：該抗體的互補決定區(qū)(“cdr”)以及任選地包括該抗體的“可變區(qū)”抗原識別位點、并且展現免疫特異性地結合抗原的能力的框架殘基。此類片段包括fab'、f(ab')2、fv、單鏈(scfv)，及其突變體、天然存在的變體，以及包括該抗體的“可變區(qū)”抗原識別位點以及一種異源蛋白(例如，毒素、針對不同抗原的抗原識別位點、酶、受體或受體配體等)的融合蛋白。本發(fā)明中，術語“片段”是指一種肽或多肽，該肽或多肽包括至少3個或4個連續(xù)的氨基酸殘基、至少10個連續(xù)的氨基酸殘基、至少15個連續(xù)的氨基酸殘基、至少20個連續(xù)的氨基酸殘基、至少25個連續(xù)的氨基酸殘基、至少40個連續(xù)的氨基酸殘基、至少50個連續(xù)的氨基酸殘基、至少60個連續(xù)的氨基殘基、至少70個連續(xù)的氨基酸殘基、至少80個連續(xù)的氨基酸殘基、至少90個連續(xù)的氨基酸殘基、至少100個連續(xù)的氨基酸殘基、至少125個連續(xù)的氨基酸殘基、至少150個連續(xù)的氨基酸殘基、至少175個連續(xù)的氨基酸殘基、至少200個連續(xù)的氨基酸殘基、或至少250個連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列。

17、人嵌合抗體、人源化抗體或人抗體對于在人體內使用是特別優(yōu)選的，然而，可有利地采用動物源的抗體用于許多用途(例如，體外或原位檢測測定，急性體內使用等)。完全人抗體對于人受試者的治療性治療是特別令人希望的。人類抗體可以通過在本領域中已知的多種方法來制造，包括使用衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體文庫的上述的噬菌體展示方法。

18、根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明提供一種結合tim3的抗體，命名為tim3-1#，其可變區(qū)氨基酸序列如下(cdr序列以加粗和加下劃線示出)：

19、重鏈：

20、

21、輕鏈：

22、

23、根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的tim3結合分子包括：

24、(1)一個重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)具有seq?id?no:7所示的氨基酸序列，或在這些氨基酸序列基礎上經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的基本上具有同等功能的氨基酸序列；和/或

25、(2)一個輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)具有seq?id?no:8所示的氨基酸序列，或在這些氨基酸序列基礎上經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的基本上具有同等功能的氨基酸序列。

26、本發(fā)明中，在結合或展現的效果的背景下使用的術語“基本上”旨在表示所觀察到的效果是生理學或治療相關的。因此，例如，如果阻滯的程度是生理學或治療相關的話(例如如果這種程度大于完全阻滯的60％，大于完全阻滯的70％，大于完全阻滯的75％，大于完全阻滯的80％，大于完全阻滯的85％，大于完全阻滯的90％，大于完全阻滯的95％，或大于完全阻滯的97％)，一個分子能夠基本上阻滯cd47的活性。類似地，如果此類免疫特異性以及表征是大于60％相同的，大于70％相同的，大于75％相同的，大于80％相同的，大于85％相同的，大于90％相同的，大于95％相同的，或大于97％相同的，則稱一個分子與另一個分子具有基本上相同的免疫特異性和/或表征。

27、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明通過elisa實驗，spr實驗和流式細胞檢測實驗，證明了本發(fā)明的tim3抗體的特異性親和能力。

28、本發(fā)明的tim3抗體，在蛋白和細胞水平，均具有與tim3的特異結合能力，且親和力高。本發(fā)明的抗體tim3活性，主要體現在具有活化t細胞、增強細胞因子ifn-γ表達分泌的能力。

29、根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述的tim3結合分子(例如所述tim3抗體或來源于該抗體的能夠特異性結合tim3的生物活性片段)的核酸分子。

30、根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明上述核酸分子的載體。

31、根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明上述核酸分子或含有上述載體的細胞。

32、根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的tim3結合分子(例如tim3抗體或來源于該抗體的能夠特異性結合tim3的生物活性片段)，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。

33、根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了所述的tim3結合分子或所述的藥物組合物在制備用于治療受試者的疾病的治療劑中的應用，其中，所述疾病包括與細胞和組織tim3表達相關的疾病。

34、根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了所述的tim3結合分子在制備用于診斷受試者的疾病的診斷劑中的應用，其中，所述疾病包括與細胞和組織tim3表達相關的疾病。

35、根據本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的tim3結合分子可以是單獨作為活性成分或與其他活性成分組合應用。例如，所述的tim3結合分子可與pd1抑制劑(例如抗pd1抗體)聯(lián)合用于干預和調節(jié)t細胞活性。本發(fā)明的靶向tim3抗體，具有與pd1抑制劑協(xié)同作用能力。

36、綜上所述，本發(fā)明提供了一種靶向tim3的特異性抗體，測定了抗體可變區(qū)序列，并提供其在調節(jié)/提高t細胞免疫活性中的應用。